专利名称：烟曲霉文丙在治疗免疫性肠炎及相关免疫性疾病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制药技术领域。
背景技术：
烟曲霉文丙(Fumigaclavine C)自从1977年发现以来，对该化合物的相关研究非常少，在药理学方面的报道更是罕见，仅有一篇文章表明该化合物在免疫性肝炎模型中具有良好疗效(Zhao et al.J Pharm Pharmcol 2004，56775-84)。另一方面，自身免疫性的肠炎是临床上的多发病和难治性疾病，包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。免疫性肠炎经常从青少年时就发病，据报道发病率高达每年4～10/100000人。终身难愈，后期会发展成各种胃肠道疾病包括肠癌，伴随着较高的死亡率。目前临床上虽能对疾病进程进行控制，但尚缺乏有效的治愈手段，而且所用的药物还有强烈的副作用。
发明内容
本发明的目的是研究烟曲霉文丙作为免疫抑制剂在免疫性肠炎及相关免疫性疾病中的应用。
本发明的技术方案1.烟曲霉文丙的提取分离及其鉴定见专利(申请号200310112694.X谭仁祥、徐强、赵颖、刘俊彦、王俊。名称“烟曲霉文丙在抗炎免疫抑制药中的应用”。申请日期2003年12月19日)。
2.烟曲霉文丙的药理试验1)小鼠肠炎的诱导取6-8周龄的BALB/c雌性小鼠，禁食20小时。然后将3.5F的注射软管从小鼠肛门插入直肠，深度在4厘米左右。注射软管与1毫升注射器相连，通过这一设备向小鼠结肠腔内注入100微升TNBS(2，4，6-三硝基苯磺酸，2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid)溶液(TNBS以50％乙醇溶液溶解，浓度为5mg/ml)。正常组小鼠给予100微升50％乙醇溶液作为对照。给药结束后拔出注射软管并使小鼠继续保持垂直体位30秒，以使药液遍布整个结肠。
2)小鼠炎症症状的观察和结肠组织病理变化的评分每日观察并记录小鼠的体重和存活情况。在注射TNBS后第3日至第8日对小鼠给药。每日腹腔注射烟曲霉文丙(5，10，20mg/kg)或环孢素A(CsA，10mg/kg)，对照组腹腔注射相应体积的磷酸盐缓冲液(PBS)。所有小鼠均在TNBS注射后9日处死，分别取出sacral lymph nodes，colonic patches和结肠组织。将结肠组织用10％福尔马林溶液固定，石蜡包埋，作4-5微米厚的冠状切片，并用苏木精-曙红染色。按照文献报道对结肠的组织学变化进行评分。评分最高可达8分，此时结肠发生全面的扩散性的病变。
3)sacral lymph nodes和colonic patches淋巴细胞的制备取TNBS致敏小鼠，无菌分离sacral lymph nodes和colonic patches。将sacral lymphnodes置于5毫升D-Hank’s溶液中，用无菌针芯轻轻碾压，并用移液管反复吹打，使细胞进入溶液并分散成单个细胞。过滤，离心，用RPMI-1640溶液洗涤两次，混悬，计数待用。另将colonic patches用胶原酶IV(0.5mg/ml in RPMI-1640)消化20分钟，然后加入RPMI-1640溶液吹打成为单个细胞，过滤，离心，洗涤两遍，计数待用。
4)sacral lymph nodes，colonic patches和结肠组织中细胞因子mRNA水平的检测将获得的细胞调整为每毫升5×106个置于24孔板中，在37℃，5％ CO2的环境中进行培养。24小时后，取出细胞进行离心并用TriPure分离试剂提取总RNA。另外，各不同组的小鼠分别取出结肠组织，用TriPure匀浆提取总RNA。最后用260nm处的紫外吸收值确定RNA浓度。其后，将RNA逆转录为cDNA，反应体系如下2μg总RNA，2000pmol Oligo dT，1.0mM dNTP，200U M-MLV逆转录酶，5×转录缓冲液。PCR引物及扩增条件见表1。PCR产物用2.0％琼脂糖胶电泳并用溴化乙锭显色。用Labworks 4.0的软件对电泳条带亮度半定量分析。
5)白细胞介素2(IL-2)和干扰素γ(IFN-γ)的检测取出如前培养24小时后的细胞上清，于-70℃保存。然后用ELISA检测细胞培养上清中IL-2和IFN-γ的蛋白水平。检测限为10pg/ml，标准曲线范围为0到1000pg/ml。
6)明胶酶谱分析取细胞培养的上清，通过明胶降解的方法检测其中的金属基质蛋白酶-9(MMP-9).另取各组小鼠的结肠组织用含有100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的D-Hank’s溶液冲洗，然后置于1ml无血清的RPMI 1640溶液中培养24小时(37℃，5％ CO2)。同样取上清测定MMP-9活性。取20μl上清与10μl sample buffer(62.5mM Tris-HCl，含有10％甘油，0.00125％溴酚兰和12％SDS)混合上样。电泳使用含5％聚丙稀酰胺和2mg/ml明胶的SDS-PAGE胶。电泳1小时后剥离该SDS-PAGE胶，用rinsing buffer(50mM Tris-HCl containing 2.5％ Triton X-100，5mM CaCl2，1μM ZnCl2，0.05％ NaN3)洗涤两次，每次30分钟。然后再用incubationbuffer(50mM Tris-HCl containing 5mM CaCl2，1μM ZnCl2，0.05％ NaN3)在37℃温浴36小时。再以0.1％考马斯亮兰R250染色30分钟，继而用10％的冰乙酸和10％异丙醇溶液脱色。用蓝色背景上的白色亮带表征MMP-9的活性。
表1各个细胞因子的PCR参数
S上游序列，AS下游序列
3.烟曲霉文丙的药理试验结果及分析1)烟曲霉文丙腹腔注射对TNBS诱导肠炎的影响TNBS结肠内给药诱导肠炎以后，小鼠会产生严重的炎症症状，如腹泻、体重下降等，伴随着比较高的死亡率。给予TNBS后从第3日至第8日各组动物分别每日腹腔注射烟曲霉文丙(5，10，20mg/kg)或CsA(10mg/kg)。与对照组相比，烟曲霉文丙在以10和20mg/kg的剂量给药时能够使小鼠的体重增长恢复到正常水平，同时还能剂量依赖性地提高小鼠的存活率。(如图1)。
2)烟曲霉文丙腹腔注射抑制肠炎小鼠炎症局部的病理损伤和炎性细胞浸润TNBS结肠内给药诱导肠炎后9日处死动物，取出结肠组织。肉眼观察发现肠粘膜水肿并有出血性溃疡。严重损伤的结肠壁会由于水肿而增厚。对照组动物肠道内没有成形的粪便，而与此不同的是，给药治疗后的小鼠肠道内则有固体粪便(如图2 A)。组织切片检查发现对照组动物的结肠组织发现肠隐窝变形，杯细胞丢失，单核细胞浸润，还有严重的粘膜损伤；而烟曲霉文丙(20mg/kg)和CsA(10mg/kg)治疗后对动物炎症局部的炎症反应和粘膜溃疡都有显著改善。(如图2B，C)。根据炎症标准评分发现，烟曲霉文丙治疗组(5，10，20mg/kg)的组织评分分别为6.1，3.6和2.1，而对照组的分数则高达6.9(如图2D)。
3)烟曲霉文丙抑制sacral lymph node淋巴细胞的炎症因子的表达和产生以及MMP-9的活性分离对照组动物的sacral lymph node细胞并在37℃培养24小时，体外给予烟曲霉文丙。培养结束后将细胞离心，提取总RNA以检测细胞因子和MMP-9的表达水平。结果发现烟曲霉文丙能够抑制参与肠炎的许多细胞因子(IL-1β，IL-2，IL-12α，IFN-γ和TNF-α)以及MMP-9的表达(如图3A，B)。此外，收集细胞培养的上清检测细胞因子的产生。结果表明烟曲霉文丙可以抑制IL-2和IFN-γ的产生(如图3E，F)。烟曲霉文丙同时还能抑制另一个重要的炎症因子MMP-9(如图3C，D)。
4)烟曲霉文丙抑制colonic patch淋巴细胞的炎症因子的表达和产生以及MMP-9的活性分离对照组动物的colonic patch细胞并在37℃培养24小时，体外给予烟曲霉文丙。培养结束后将细胞离心，提取总RNA以检测细胞因子和MMP-9的表达水平。结果与sacral lymph node淋巴细胞的实验结果相似。如图4A和B所示，本药物可以剂量依赖性地抑制多种炎症因子的表达，包括IL-1β，IL-2，IL-12α，IFN-γ，TNF-α和MMP-9。此外，它也能在蛋白水平抑制IL-2 and IFN-γ的(如图4E，F)。同时，酶谱分析也发现了烟曲霉文丙对MMP-9活性的抑制作用(如图4C，D)。
5)静脉注射烟曲霉文丙对肠炎小鼠结肠组织炎症因子表达和MMP-9活性的抑制作用分离各组动物的结肠组织并匀浆提取总RNA。烟曲霉文丙或CsA给药后能够在mRNA水平上显著抑制炎症因子的表达(如图5A，B)。而且，检测结肠组织分离后体外培养的上清发现烟曲霉文丙和CsA组的MMP-9活性也受到了明显抑制(如图5C，D)。
本发明较现有技术的有益效果是，烟曲霉文丙(Fumigaclavine C)对难以治愈的免疫性肠炎具有良好的治疗作用，能应用于包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎在内的肠道疾病。鉴于本药物对各种炎症因子尤其是Th1细胞因子的显著抑制作用，本药物也可作为免疫抑制剂用于其它多种Th1细胞参与的自身免疫性疾病，如迟发型超敏反应，多发性硬化症，胰岛素依赖性的糖尿病，自身免疫性心肌炎，桥本氏病，Grave’s病，重症肌无力等。
四
图1.烟曲霉文丙和CsA对小鼠TNBS诱导肠炎的改善作用。烟曲霉文丙(5，10，20mg/kg)或CsA(10mg/kg)每日腹腔给药。每日记录各组小鼠的体重变化(A)和死亡情况(B)。结果以mean±s.e.m表示。#P＜0.05，##P＜0.01，vs正常小鼠；*P＜0.05，**P＜0.01，vs模型小鼠(Dunnett’s test)。
图2.烟曲霉文丙和CsA对小鼠炎症结肠肉眼观察和显微镜观察表现的改善作用。烟曲霉文丙(5，10，20mg/kg)或CsA(10mg/kg)每日腹腔给药。TNBS致敏后第九日取出结肠组织进行观察。A.肠炎小鼠的结肠外观。B，C.肠炎小鼠结肠的组织学变化。D.肠炎小鼠结肠组织的微观评分。结果以mean±s.e.m表示。#P＜0.05，##P＜0.01，vs正常小鼠；*P＜0.05，**P＜0.01，vs模型小鼠(Dunnett’s test)。a，正常组；b，模型组；c，d，e，烟曲霉文丙5，10，20mg/kg组；f，CsA 10mg/kg组。组织切片作HE染色。放大倍数为B×10in，C×100。
图3.烟曲霉文丙对肠炎小鼠sacral lymph node淋巴细胞的炎症因子表达、产生以及MMP-9活性的抑制作用。用RT-PCR的方法检测IL-1β，IL-2，IL-12α，IFN-γ和TNF-α)以及MMP-9的表达(A)。再用Lab Work 4.0软件与β-actin基因表达相比较进行半定量(B)。细胞培养上清中的MMP-9活性用酶谱分析法检测(C)并以Lab Work 4.0软件进行半定量(D)。细胞培养上清中的IL-2(E)和IFN-γ(F)水平分别用ELISA方法进行检测。*P＜0.05，**P＜0.01，vs正常小鼠(Dunnet’s test)。
图4.烟曲霉文丙对肠炎小鼠colonic patch淋巴细胞的炎症因子表达、产生以及MMP-9活性的抑制作用。用RT-PCR的方法检测IL-1β，IL-2，IL-12α，IFN-γ和TNF-α)以及MMP-9的表达(A)。再用Lab Work 4.0软件与β-actin基因表达相比较进行半定量(B)。细胞培养上清中的MMP-9活性用酶谱分析法检测(C)并以LabWork 4.0软件进行半定量(D)。细胞培养上清中的IL-2(E)和IFN-γ(F)水平分别用ELISA方法进行检测。*P＜0.05，**P＜0.01，vs正常小鼠(Dunnet’s test)。
图5.烟曲霉文丙和CsA对肠炎小鼠结肠组织的炎症因子表达以及MMP-9活性的抑制作用。烟曲霉文丙(5，10，20mg/kg)或CsA(10mg/kg)每日腹腔给药。将各组的结肠组织取出并匀浆提取总RNA。用RT-PCR的方法检测IL-1β，IL-2，IL-12α，IFN-γ和TNF-α)以及MMP-9的表达(A)。再用Lab Work 4.0软件与β-actin基因表达相比较进行半定量(B)。另取肠组织进行体外培养，上清中的MMP-9活性用酶谱分析法检测(C)并以Lab Work 4.0软件进行半定量(D)。
五具体实施例方式
烟曲霉文丙腹腔注射能够显著改善TNBS诱导的小鼠免疫性肠炎。采用BALB/c雌性小鼠，首先注射TNBS，其后第3日至第8日对小鼠给药每日腹腔注射烟曲霉文丙(5，10，20mg/kg)或环孢素A(CsA，10mg/kg)，对照组腹腔注射相应体积的磷酸盐缓冲液(PBS)。结果表明TNBS结肠内给药诱导肠炎以后，小鼠会产生严重的炎症症状，如腹泻、体重下降等，伴随着比较高的死亡率。与对照组相比，烟曲霉文丙在以10和20mg/kg的剂量给药时能够使小鼠恢复体重增长提高小鼠的存活率(附图1)。同时对结肠局部的炎症反应和粘膜溃疡都有显著改善(附图2B，C)。
在肠炎的发生发展过程中有许多炎症细胞因子的参与。本研究进一步发现烟曲霉文丙能够抑制参与肠炎的许多细胞因子(IL-1β，IL-2，IL-12α，IFN-γ和TNF-α)以及MMP-9的表达(附图3A，B；图4A，B；图5A，B)和IL-2和IFN-γ蛋自的产生(如图3E，F；图4E，F；图5E，F)。烟曲霉文丙同时还能抑制另一个重要的炎症因子MMP-9的功能(如图3C，D；图4C，D；图5C，D)。
以上结果提示，烟曲霉文丙(Fumigaclavine C)可以应用于包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎在内的肠道疾病以及其它多种Th1细胞参与的自身免疫性疾病，如迟发型超敏反应，多发性硬化症，胰岛素依赖性的糖尿病，自身免疫性心肌炎，桥本氏病，Grave’s病，重症肌无力等。
权利要求
1.烟曲霉文丙在制备治疗肠炎，包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎药物中的应用。
2.烟曲霉文丙在制备治疗多种T细胞参与的自身免疫性疾病，如迟发型超敏反应，多发性硬化症，胰岛素依赖性的糖尿病，自身免疫性心肌炎，桥本氏病，Grave’s病，重症肌无力药物中的应用。
全文摘要
本发明属于生物制药技术领域，目的是研究烟曲霉文丙作为免疫抑制剂在肠炎中的应用。本发明所述，烟曲霉文丙(Fumigaclavine C)可以应用于包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎在内的肠道疾病以及其它多种T细胞参与的自身免疫性疾病，如迟发型超敏反应，多发性硬化症，胰岛素依赖性的糖尿病，自身免疫性心肌炎，桥本氏病，Grave’s病，重症肌无力等。
文档编号A61K31/48GK1686131SQ20051003863
公开日2005年10月26日 申请日期2005年3月31日 优先权日2005年3月31日
发明者徐强, 谭仁祥, 吴雪丰 申请人:南京大学