专利名称：一种烟曲霉菌多克隆抗体的制备方法
技术领域：
本发明涉及抗体及其制备方法，特别是用于针对烟曲霉菌半乳甘露聚糖(Glucomannan, GM)抗原的一种多克隆抗体及其制备方法。
背景技术：
近年来由于广谱抗菌药物大量使用、肿瘤和器官移植患者的增多，深部真菌感染的发病率和病死率逐年增高。烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)是一种重要的条件致病菌，常感染免疫能力低下或免疫能力缺陷的患者，正逐渐成为一种重要的致病真菌。目前侵袭性曲霉菌感染检测的金标准是组织活检和无菌体液培养。然而该病病情发展很快，传统培养的方法阳性检出低、培养周期长，往往造成漏诊、误诊，导致贻误病情。免疫检测技术是利用抗原抗体间能特异性结合反应，通过检测标记在反应物上的标记物，对抗原或抗体实现定性或定量检测的方法。根据标记物质的不同，分为酶联免疫分析技术(Enzyme-Linked Immunosorbant Assay, ELISA)、免疫突光检测技术、化学发光免疫分析技术、免疫微球技术、免疫胶体金技术等。其中ELISA技术具有操作简单，灵敏度高，检测时间短的特点，在临床检测和科学研究中被广泛使用。在烟曲霉菌的临床检测中 ，目前国际市场上仅有Bio-Rad公司的烟曲霉GM抗原检测产品。我国国内并没有真正用于烟曲霉菌临床检测的产品。而免疫学检测产品的关键在于能否得到合适的抗体，因此，制备针对烟曲霉菌GM抗原的抗体成为开发该抗原检测产品的关键。半乳甘露聚糖结构特殊、是不完全抗原、与很多种微生物产生的多糖成分类似，很难像蛋白免疫原一样容易得到特异性高、亲和力好的单克隆抗体。文献I中用烟曲霉菌GM抗原粗提物作为免疫原，文献2中用烟曲霉菌GM抗原粗提物、烟曲霉分生孢子、烟曲霉重组半乳甘露聚糖蛋白作为免疫原制备分别出了单克隆抗体。但GM抗原粗提物或烟曲霉分生孢子作为免疫原都具有免疫原分子组成复杂、蛋白及多肽类杂质含量太多等缺点，且重组GM抗原并非多糖而是糖蛋白，所以国内并没有真正用纯烟曲霉菌GM抗原制备抗体的先例。综上所述，在新型隐球菌临床检测领域，迫切需要制备出抗烟曲霉菌GM抗原的抗体。本发明详细描述本发明的目的在于提供一种抗烟曲霉菌GM抗原的多克隆抗体。本发明的目的在于提供一种制备抗烟曲霉菌GM抗原的多克隆抗体的方法。 本发明所使用的烟曲霉菌GM抗原由天津贻诺琦生物工程有限公司提供(专利申请号:201110289099.8)。本发明技术方案如下:步骤:1.用GM抗原免疫动物。2.测定免疫后动物的血清效价，从免疫后的动物体内取血。
3.用饱和硫酸铵盐析法和亲和层析法对血清进行纯化，得到纯化的多克隆抗体。上述步骤I中免疫的方法是多种多样的，如:脾内注射法，腹腔注射法等。免疫剂量可视具体动物种类而定。用于制备GM多克隆抗体的动物可以是鼠、兔、鸡、羊、马、猪、驴等可用于免疫的动物。上述步骤2中免疫后的动物可处死后采血，也可以不处死，饲养过程中每次采一定量的血。上述步骤3中用于抗体纯化的方法可以是饱和硫酸铵盐析沉淀法和亲和层析法
坐寸o用上述方法制备得到的多克隆抗体及其他种属来源的多克隆抗体是需要本发明保护的。 本发明提供了一种抗烟曲霉菌GM抗原的多克隆抗体，及抗烟曲霉菌GM抗原的多克隆抗体的制备方法。在本发明的制备方法中，GM抗原是从烟曲霉菌的培养物中制得(专利申请号:201110289099.8)，该抗原为国内首例提纯的烟曲霉菌GM抗原，因而本发明得到的多克隆抗体为国内首例抗烟曲霉菌GM抗原的多克隆抗体，填补了国内空白。实验证明，用本发明所属方法制得的多克隆抗体具有特异性好，效价高的特点，有很强的应用前景。附图描述:
图1显示了兔IgG型 多克隆抗体的SDS-PAGE检测的结果。图2显示了兔IgG型多克隆抗体的效价测定的结果。实施例1，抗烟曲霉菌GM抗原的多克隆抗体的制备一、免疫动物将GM抗原与弗氏完全佐剂等体积混合至合适体积。充分乳化后对新西兰大耳兔进行皮下多点注射，每只兔免疫剂量控制在0.01-0.Smg0免疫前3天取耳血，分离血清做阴性对照。初次免疫后每2周免疫I次，方法与第I次相同。二、多克隆抗体的获得I)效价测定:免疫过程中，免疫后每隔几天采血测效价I次，免疫次数不少于3次。2)分离抗血清:血清效价达到最高时，用颈动脉放血的方法大量采血。待血液凝固，血清分离出后，高速离心，取上清，-20 0C保存。3)用饱和硫酸铵盐析法进行初步纯化(I)取2ml抗血清样本，加等体积的生理盐水，再加入4ml饱和硫酸铵溶液，4°C沉淀过夜。(2) IOOOOg低温离心10分钟，弃上清，将沉淀用2ml PBS溶解，缓慢滴加Iml饱和
硫酸铵溶液，4°C静置I小时。(3) IOOOOg低温离心10分钟，弃上清，将沉淀用Iml PBS溶解，用PBS溶液4°C透析过夜。4)用亲和层析的方法进一步纯化(I)用5-10倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱；(2)用5-10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；
(3)将用饱和硫酸铵盐析法初步纯化过的样品上样；(4)用5-10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；(5)用2-5倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱，得到抗烟曲霉菌GM抗原的多克隆抗体。实施例2，抗体的检测1.SDS-PAGE 电泳检测对实施例1制得的抗体进行SDS-PAGE电泳，对得到的凝胶进行考马斯亮蓝染色。实验结果见图l(pAb泳道为多抗，M泳道为蛋白Marker)。由图中可看出，在25KD和50KD分子量区有清晰明显的条带，说明抗体纯度很高。2.效价测定用间接ELISA法对抗体效价进行测定。所用酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，阴性对照为PBS溶液，以抗体溶液的OD值大于阴性对照OD值的2倍为阳性判定标准。检测结果见图2。从结果可看出，该抗体效价较高，大于1: 1X105。应当知道只是用实施示例对本发明进行了描述，在本发明基础上做出的改进仍属本发明范畴。参考文献(其内容纳入本文作参考)[I]车小燕等，(2002)抗烟曲霉菌单克隆抗体鉴定和初步应用.中国免疫学杂志 18:175-177[2]郝卫等，(2 008) I组曲霉单克隆抗体的制备与鉴定.中国真菌学杂志.3(3):129-13权利要求
1.一种抗烟曲霉菌GM抗原的多克隆抗体，其特征是用烟曲霉菌GM抗原做为免疫原，经免疫动物、分离和纯化抗血清得到的多克隆抗体。
2.一种如权利要求1所述的抗烟曲霉菌GM抗原的多克隆抗体，其特征是用SDS-PAGE显不为均一抗体产物。
3.—种如权利要求1所述的抗烟曲霉菌GM抗原的多克隆抗体，其特征是用烟曲霉菌GM抗原包被，间接法ELISA检测显示其效价不低于1: 1X105。
4.一种如权利要求1所述的抗烟曲霉菌GM抗原的多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤: (a)用烟曲霉菌GM抗原作为免疫原免疫动物； (b)将(a)步骤得到的血清进行分离纯化，得到抗体。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，免疫的方法为皮下注射、脾内注射、静脉注射、腹腔注射；免疫剂量为0.lmg-0.8mg ;免疫的动物为大鼠、小鼠、豚鼠、兔、鸡、羊、马、猪、驴。
6.如权利要 求4所述方法，其特征在于，步骤(b)所使用的抗体纯化的方法为饱和硫酸铵盐析沉淀法和亲和层析法。
7.用权利要求1-6任一所述的方法制备的抗烟曲霉菌GM抗原的多克隆抗体。
全文摘要
本发明涉及抗体及其制备方法。具体而言，本发明涉及用于针对烟曲霉菌半乳甘露聚糖(Galactomannan，GM)抗原的一种多克隆抗体及其制备方法。本发明提供了一种用烟曲霉菌GM免疫动物，得到动物的抗血清，经分离纯化得到抗体的方法。用本发明方法制备得到的多克隆抗体效价高、纯度高、特异性好的特点。为国内首例用烟曲霉菌GM抗原制备的多克隆抗体，在医疗和科研领域应用前景广阔。
文档编号C07K16/14GK103204930SQ20121001179
公开日2013年7月17日 申请日期2012年1月16日 优先权日2012年1月16日
发明者史东东, 何永胜, 周泽奇, 李宁, 王东东, 粟艳, 彭洁 申请人:天津贻诺琦生物工程有限公司