专利名称：榆钱菠菜转录活性蛋白AhPHD1及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种榆钱菠菜转录活性蛋白AhPHDl及其编码基因与应用。
背景技术：
环境中物理、化学因素的变化，例如干旱、盐碱、低温等胁迫因素对植物的生长发育具有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，因此培育耐逆性高的作物是种植业的主要目标之一。目前，应用基因工程技术进行育种已经成为提高作物耐逆性的重要方法之一。高等植物细胞具有多条途径应答环境中的各种逆境胁迫，其中转录因子起着调控耐逆相关效应基因表达的作用。现已在植物中发现了多类与植物耐逆性相关的转录因子，例如:EREBP/AP2中的DREB类，bZIP，MYB等等。PHD(Plant Homodomain)类具有转录活性的蛋白广泛存在于动植物以及细菌、病毒蛋白中，比如哺乳动物的CBP类蛋白，人的INGl家族，酵母Yng2p蛋白，病毒MIRl蛋白。PHD类蛋白结构域是C4HC3类的锌指结构，其功能主要为以下几类:(I)作为乙酰化或去乙酰化酶参与染色质相关的转录调控；(2)作为E3泛素连接酶参与蛋白降解；(3)作为PIPs受体感知PIPs信号参与染色质相关的转录调控。在拟南芥中首次发现了 PHD类蛋白，植物中该类蛋白的功能研究尚少。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种蛋白及其编码基因。本发明所提供的蛋白，名称为AhPHDl,来源于榆钱菠菜(Atriplex hortensis),是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。其中，序列表中的序列2由241个氨基酸残基组成，属于榆钱菠菜中的PHD家族。其编码基因的读码框包含726个核苷酸。上述蛋白中，一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述蛋白AhPHDl的编码基因AhPHDl也属于本发明的保护范围。上述基因可为如下(I)或⑵或(3)的DNA分子:(I)序列表中序列I所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交且编码与植物耐逆性相关蛋白的DNA分子；(3)与(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码与植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。
上述基因中的严格条件可为如下:50°C，在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaP04和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，2X SSC，0.1% SDS中漂洗；还可为:50°C，在7%SDS,0.5M NaPO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，I X SSC, 0.1 % SDS中漂洗；还可为:50°C，在 7% SDS,0.5M NaPO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，0.5X SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为:501:，在7%505、0.5M NaPOjP ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，0.1 X SSC, 0.1% SDS 中漂洗；还可为:50°C，在 7% SDS,0.5M NaPO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在65°C，0.1 XSSC,0.1% SDS中漂洗;也可为:在6XSSC，0.5% SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2 X SSC, 0.1% SDS和I X SSC, 0.1% SDS各洗膜一次。其中，序列表中的序列I由726个脱氧核苷酸组成，本序列为AhPHDl基因的读码框，编码具有序列表中序列2的氣基酸残基序列的蛋白质。含有上述基因的表达载体、细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。所述重组载体为将所述基因插入pBin438载体的BamH I和KpnI识别位点间得到的重组载体。扩增所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。所述引物对具体可为如下⑴或(II):(I)由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对；(II)由序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成的引物对。所述蛋白、所述基因或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育耐逆性植物中的应用是本发明保护的范围；上述应用中，所述耐逆性具体为耐盐性。
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本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物方法。本发明提供的方法是将上述基因导入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物。上述方法中，该基因通过上述重组载体导入所述目的植物中；上述方法中，所述耐逆性为耐盐性；上述方法中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；在本发明的实施例中具体为拟南芥。上述转基因植物理解为不仅包含将所述基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。将所述基因导入目的植物，会使所述蛋白质目的植物中合成，进而是目的植物的耐逆性性状得到改良。上述基因可先进行如下修饰，再导入宿主中，以达到更好的表达效果:I)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述核苷酸序列编码的氨基酸的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35 %,优选为多于45 %,更优选为多于50%，最优选多于约60% ；2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接。5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV，MCMV和AMV)。在实际操作中，也可以将本发明基因进行细胞靶向定位。可利用本领域现有的技术实现。例如，将来源于靶向细胞器的靶基因序列与本发明基因序列融合，再导入植物细胞中，就可定位了。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。本发明的实验证明，本发明发现了一个新蛋白 及其编码基因AhPHDl，该基因的表达明显受高盐和低温诱导，也受植物激素脱落酸ABA的诱导。将AhPHDl基因经农杆菌的介导，导入拟南芥Col-O中，获得了过量表达AhPHDl的纯系株系，上述转基因株系与野生型拟南芥相比，其耐盐性有显著提高，说明AhPHDl基因能够显著提高植物的耐盐性。因此，本发明提供的蛋白AhPHDl对于培育耐逆植物品种，特别是培育耐非生物胁迫(耐盐)的作物、林草等新品种具有重要价值，可用于农牧业和生态环境治理所需的耐逆性植物品种的培育和鉴定，对提高农作物产量具有重要意义；并且从分子生物学角度证明了 PDH家族中的一些成员确实参与植物对非生物胁迫应答的调控，其表达与植物的耐非生物胁迫呈正相关。
图1为AhPHDl基因在不同处理时的转录特征图2为植物表达载体pBin438_AhPHDl的示意3为AhPHDl过表达株系的分子鉴定图4为AhPHDl过表达株系与对照的耐盐性鉴定
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值土标准差。所有植物材料均生长于22°C每天的光照为16h/8h (光照/黑暗)。pBin438载体(双元表达载体)记载在(李太元，田颖川，秦晓峰,等.高效抗虫转基因烟草的研究，中国科学(B辑)，1994，24 (3):276-282.)，由方荣祥院士惠赐。经方荣祥先生同意，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。农杆菌GV3101 菌株记载在 Clough-SJ, Bent-AF.Floral dip:a simplifiedmethod for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.PlantJournal.1998,16:6,735-743中，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。哥伦比亚生态型拟南芥(Col-O):种子购自Arabidopsis Biological ResourceCenter(ABRC)，以下简称野生型拟南芥。实施例1、榆钱菠菜AhPHDl基因cDNA克隆1、榆钱菠菜AhPHDl基因的发现前期的研究表明具有转录活性的PHD蛋白家族参与植物对非生物胁迫的应答反应，并与植物耐逆性相关。榆钱菠菜(Atriplex hortensis)又名山菠菜,是一种盐生植物，参考拟南芥和大豆等物种PHD的保守氨基酸序列，设计一对简并引物:AhHDFl: GYATHAAYTTYGCYAGRGATGG,AhHDRl:GCffGGDGTDATYTTMACACA,榆钱菠菜发芽,生长7天后分别以300mM NaCl水溶液处理0hr、5hr, IOhr,混合样本，按照常规方法提取cDNA。以该cDNA为模板，应用上述引物，经PCR扩增出大小在400bp左右的条带，克隆到PMD18-T载体后测序，获得4个不同的序列，用DNAStar Megal i gn软件，与大豆PHD氨基酸序列比对，发现相似度均在50%以上，且具有共同的保守结构域，分别命名为 AhPHD1、AhPHD2、A hPHD3，AhPHD4。对其中的 AhPHDI 进行了 进一步研究。根据已获得的部分cDNA序列各设计两对巢式引物，采用Smart RACE的方法PCR扩增cDNA的5’ -端和5’ -端序列，结果获得了包括完整⑶S在内的cDNA序列。Smart RACE 通用引物:SMART II Oligo (12 μ Μ):5’ -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3’3，-CDS (12 μ Μ):5’ -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC (T) 30V N_3’ (N = A, C, G, or T ；V = A, G, orC)再以下述引物经RACE，克隆全长AhPHDl基因AhPHDlRACE 特异引物:SF1 (Specific forward primer for AhPHD I RACE):TAAGGACAAGCCTAGTGTGGATAGTG 194-NSFl(Nested specific forward primer for AhPHDIRACE):GGCAAGTGATGGGCAGATCAAGAG 248-SRl(Specific reverse primer for AhPHDIRACE):CTCTTGATCTGCCCATCACTTGCC -271NSRl(Nested specific reverse primer for AhPHDIRACE):CTATCCACACTAGGCTTGTCCTTAAC -217所克隆的序列包括ATG前面239bp，和终止密码子TGA后的375bp。该基因的读码框架包括726bp，为AhPHDl的cDNA，为序列I中的核苷酸序列，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列。氨基酸序列分析表明，在序列表中序列2由241个氨基酸残基组成。2、榆钱菠菜AhPHDl基因的获得根据AhPHD I基因序列设计引物:
AhPHDlsense:5 ‘-ATGGAAGGAGGAACTGCGCAC-3，，(序列 3)AhPHDlantisense:5 ‘-CTAGGGTCGTGCTCTTTTGTT_3’(序列 4)应用RT-PCR方法，从榆钱菠菜，又名山菠菜，(肖岗，张耕耘，刘凤华，王军，陈受宜，李聪，耿华珠，山菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因研究，科学通报，1995,40 (8) =741-745,公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)总RNA中扩增AhPHDl基因，具体如下:取榆钱菠菜叶片，置于液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，并用酸性苯酚、氯仿抽提，向上清中加入无水乙醇进行沉淀，最后将沉淀溶于水中得到总RNA。取5μ g总RNA用反转录试剂盒(Promega公司)按试剂盒的方法进行反转录，以得到的cDNA片段为模板进行PCR扩增反应。20 μ IPCR反应体系为:1μ I 一链cDNA (0.05 μ g)、I μ I引物(AhPHDlsense、AhPHDl antisense:20 μ Μ)、2 μ I 10XPCR 缓冲液、0.4 μ I dNTP (IOmM)和 IU TaqDNA聚合酶，用超纯水补足20 μ 1，液面覆盖液体石蜡油。反应在ΡΕ9600型PCR仪上进行，其程序为 94°C变性 5min ;再 94°C lmin,56°C lmin,72°C lmin，共 30-32 个循环；然后 72°C延伸IOmin ;4°C保存。PCR产物经回收后序列分析，结果表明该PCR产物具有序列表中序列I的核苷酸序列，然后克隆于PMD18-T质粒的多克隆位点，得到重组载体pMDAhPHDl。3、AhPHDl基因在非生物胁迫下的表达特征对榆钱菠菜进行聚乙二醇(PEG)模拟的干旱、NaCl, ABA和低温处理，用于分析榆钱菠菜AhPHDl在非生物胁迫和脱落酸(ABA)处理下的转录特征。将榆钱菠菜种子种在盆中，生长2星期后，对幼苗分别进行下述胁迫处理:生长条件除指明外均为22_23°C，光照16h/天。干旱处理: 将榆钱菠菜幼苗的根系置于20% (质量百分含量)PEG溶液中，分别培养O小时、I小时、3小时、6小时、12小时和24小时后取样。盐处理:将幼苗的根系置于300mM NaCl水溶液中，分别在光照培养O小时、I小时、3小时、6小时、12小时和24小时后取样。ABA处理:将幼苗的根系置于100 μ MABA水溶液中，分别在光照培养O小时、I小时、3小时、6小时、12小时24小时后取样。低温处理:将幼苗置于4°C培养箱中，分别在光照培养O小时、I小时、3小时、6小时、12小时和24小时后取样。应用Real Time PCR分析AhPHDl基因在上述处理时的转录特征，总RNA的提取同实施例1。所用引物如下:QRT-AhPHD IF I:TATTTGCGAGAGGTGGTTCCQRT-AhPHD IR I:GCCCTGTCTTCTTCAAGCTG以Actin作为内对照，引物为:QRT-AhactinFl:CTGCTGGTATCCACGAGACTQRT-AhactinRl:GCAATGCCAGGGAACATAGT结果如图1所示，AhPHDl基因的转录明显受脱落酸ABA诱导，分别在胁迫12小时和24小时时受低温和高盐诱导，受干旱诱导不明显。植物激素ABA与植物与非生物胁迫的应答反应相关，因此上述结果表明AhPHDl可能参与植物对非生物胁迫的应答。
实施例2、AhPHDl编码蛋白的功能1、重组表达载体pBin438_AhPHDl的构建载体构建引物:BamHI/Kpn IAhPHDlFl:GGATCCATGTCATCCTCAAATCCTCGAAC (序列 5)AhPHDlRl:GGTACCGTCGACTCAGTGACTACGCCCTGTC (序列 6)以实施例1获得的pMDAhPHD I为模板，用限制性内切酶BamHI和Kpn I双酶切由AhPHDlFl和AhPHDlRl作为引物获得的PCR产物，回收酶切产物，将该酶切产物与经过同样酶切植物表达载体pBin438得到的载体骨架连接，得到连接产物。将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子。提取转化子的质粒，送去测序，该质粒为将序列表中的序列I插入pBin438的BamH I和KpnI酶切位点之间得到的载体，将该载体命名为pBin438_AhPHDl，且序列表中的序列I位于CaMV 35S启动子之后。重组表达载体PBin438_AhPHDl结构示意图如图2所示。2、转AhPHDl拟南芥株系的获得将上述获得的重组载体 pBin438-AhPHDl用电击转化法导入农杆菌GV3101中，得到重组菌，提取重组菌的质粒，测序，验证该质粒中的插入片段为AhPHDl，其读码框架无误。将含有该质粒的重组菌命名为GV3101/pBin438-AhPHDl。挑取GV3101/pBin438-AhPHDl的单菌落在5mlLB中，于28°C培养8小时，再转接到200mlLB中继续培养3小时，收菌后重悬于LB培养基中得到转化液。将野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)Col-O的花浸泡于转化液中10秒，取出后放入MS培养基中避光培养8小时，获得Ttl代转化种子，将其播于含卡那霉素(50mg/L)的MS培养基上，获得25株Ttl代转AhPHDl拟南芥。提取上述25株Ttl代转AhPHDl拟南芥植株叶的RNA，并反转录获得cDNA，进行RT-PCR鉴定，以野生型拟南芥为对照，探针为:AhPHDlFl:TATTTGCGAGAGGTGGTTCCAhPHDlRl:GCCCTGTCTTCTTCAAGCTG结果如图3所示，经RT-PCR鉴定后，筛选2个Ttl代转AhPHDl拟南芥作进一步研究，命名为0X5和0X10，在0X5和0X10中AhPHDl均有较高的转录水平，而在对照野生型拟南芥Col-O中，未能检测到AhPHDl的转录。将T1单株收获种子，此为T2代种子，各单株种子分别播种，用卡那霉素继续筛选以观察T2代的分离情况，如此重复筛选，直至T3代获得遗传稳定的转基因株系，获得稳定遗传的AtPHD6基因过表达株系0X5和0X10。采用同样的方法，将空载体pBin438转入野生型拟南芥中，得到Ttl代转空载体拟南芥，按照上述方法进行RT-PCR，结果没有目的产物，因此，得到阳性Ttl代转空载体拟南芥，播种、收种，得到T3代转空载体拟南芥。3、转AhPHDl拟南芥株系的耐盐性鉴定实验样本如下(每个株系15粒种子):T3代转AhPHDl基因植株(0X5和0X10两个株系)、T3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥。将各个株系植株的种子同时播种在MS平板上，萌发后5天后将幼苗分别移栽到含有150mM NaCl的1/2MS培养基上生长14天，将NaCl处理14天后的幼苗移栽到蛭石中在正常条件下恢复生长25天。以正常生长(OmM NaCl)为对照处理。观察盐胁迫后恢复7天和25天比较表型，结果如图4A和4B所示，其中，图4A为移栽到含有150mM NaCl的1/2MS培养基上生长14天的结果，可以看出，150mM NaCl处理后的幼苗生长均受到严重抑制；图4B为盐胁迫后恢复7天(移栽后7天)和25天(移栽后25天)时野生型拟南芥和转基因株系的表型，可以看出，与OmM NaCl处理下，150mM NaCl处理后所有植株的生长均受到抑制，而野生型拟南芥较之T3代转AhPHDl基因植株(0X5和0X10两个株系)更为严重。统计恢复培养第25天野生型拟南芥和转基因株系的存活率，结果如图4C所示，可以看出，野生型拟南芥(ColO)的存活率约为21%，而T3代转AhPHDl基因植株的两个株系0X5和0X10的存活率分别为44%和42%，明显高于野生型拟南芥。T3代转空载体拟南芥和野生型拟南芥的结果无显著差异。
上述结果表明，有榆钱菠菜AhPHDl参与了植物在高盐胁迫下的调控，其编码基因AhPHDl的过量表达，提高了转基因植株的耐盐性。
权利要求
1.一种蛋白，是如下(a)或(b): (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列表中序列2所示的 氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因是如下⑴或(2)或(3)的DNA分子: (1)序列表中序列I所不的DNA分子； (2)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交且编码与植物耐逆性相关蛋白的DNA分子； (3)与(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码与植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于: 所述重组载体为将权利要求1所述蛋白的编码基因插入pBin438载体中，得到表达权利要求I所述蛋白的重组载体。
6.扩增权利要求2或3所述基因全长或其任意片段的引物对。
7.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育耐逆性植物中的应用；所述耐逆性具体为耐盐性。
8.一种培育转基因植物的方法，为将权利要求1所述蛋白的编码基因导入目的植物，得到转基因植物，所述转基因植物的耐盐性高于所述目的植物。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于: 所述蛋白的编码基因通过权利要求4或5所述的重组载体导入目的植物； 所述耐逆性为耐盐性； 所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于:所述双子叶植物为拟南芥。
全文摘要
本发明公开了一种榆钱菠菜转录活性蛋白AhPHD1及其编码基因与应用。该蛋白命名为AhPHD1，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的序列2；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与植物耐逆性相关的蛋白质。本发明的实验证明，该榆钱菠菜蛋白及其编码基因可用于培育耐逆植物品种特别是耐盐双子叶植物品种。
文档编号C07K14/415GK103204913SQ20121000989
公开日2013年7月17日 申请日期2012年1月13日 优先权日2012年1月13日
发明者张劲松, 陈受宜, 陶建军, 张万科, 林晴, 马彪 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所