专利名称：利用毕赤酵母表达系统生产猪圆环病毒2型衣壳蛋白颗粒样疫苗的方法
技术领域：
本发明提供了一种利用毕赤酵母表达系统生产猪圆环病毒2型(PCV-2)颗粒样疫苗的方法，属于生物 技术领域，目的用于加强猪对猪II型圆环病毒的免疫保护作用及减少猪场的经济损失。
背景技术：
猪圆环病毒2型(Porcine circovirusll, PCV-2)属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(circovirus), PCV-2 基因组全长 1767bp 或 1768bp,共包含11个开放阅读框(ORF)，其中0RF1、Cap是两个最大的开放阅读框，分别编码复制相关蛋白(Rep蛋白)和衣壳蛋白(Cap蛋白)。Cap蛋白是主要的结构蛋白，具有很好的免疫原性，可以作为疫苗的候选蛋白。目前，国内外已有相关方面的大量报道，洛阳普莱柯已用家蚕生物反应器成功的表达出了 PCV_2Cap蛋白，也有人成功的利用原核表达系统成功的表达出了PCV-2Cap蛋白。但因其生产成本高或蛋白免疫原性差等因素严重的影响了 PCV-2Cap蛋白的大规模生产和应用。
发明内容
鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种利用酵母表达系统生产猪圆环病毒2型颗粒样疫苗的方法，包括以下步骤:(I)猪圆环病毒2型衣壳蛋白的Cap基因的扩增；以GenBank中PCV2-TJ (序号AY181946)毒株基因序列为模板，用软件Primer5.0设计一对引物PU P2，分别在PU P2的5’端分别加入FokI和SalI酶切位点:Pl:5’ CGTGGTCTCCAGGTATGACGTATCCAAGGAGGCGT3’P2:5’ GGTCTCAGATCTTCAAGGGTTAAGTGGGGGGT3’以PCV-2感染的PK15细胞培养物中提取的DNA产物为模板，应用PCR技术扩增出了实验室分离毒株PCV-2的Cap蛋白全基因。该目的基因片段大小为722bp ；(2)以常规方法利用限制性内切酶FokI和SalI双酶切步骤⑴中PCR产物，实现与pP-secSUM03酵母表达质粒的连接，构建重组Cap基因的酵母表达质粒，并命名为pP-secSUM03-Cap ；(3)重组质粒pP-secSUM03-Cap的扩增、提取:具体操作为，大肠杆菌JM109按常规活化后制备感受态，取pP-secSUM03质粒DNAl yl，常规CaCl2法转化JM109，将转化后的JM109菌液涂布于低盐LB平板中，20-22h后取单菌落，扩增，并以质粒抽提试剂盒(Promega公司)抽提获得质粒；(4)以限制性内切酶SacI单酶切pP-secSUM03-Cap，0.8%琼脂糖电泳回收完全线性化的质粒DNA，与酵母GS115的感受态菌液混合进行电转化；将转化后的菌株涂布于含不同浓度Zeocin的YPDS平板上，筛选出高拷贝菌株。
(5)利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选重组阳性表达酵母菌；(6)取上述重组阳性表达酵母菌上清经镍柱纯化后，加入SUMO蛋白酶2同步进行透析和标签切除，再次过镍柱纯化，回收猪圆环病毒2型衣壳蛋白Cap，包装猪圆环病毒2型病毒样颗粒。(7)利用纯化的猪圆环病毒2型病毒样颗粒，辅以佐剂ISA206，制备猪圆环病毒2型颗粒样疫苗技术效果本发明利用PCV-2感染的PK15细胞培养物中克隆的Cap基因，构建出一种新型的Cap蛋白分泌型酵母表达系统。本系统采用SUM03为融合标签，一方面可以增强Cap蛋白可溶性和提闻Cap蛋白表达量，另一方面可以正确有效地切割目的蛋白与融合标签，保证表达Cap蛋白的不含任何多余的氨基酸；本系统具有因子分泌信号肽，可使产物分泌出胞，有利于产品的纯化和生产。真核表达获得的蛋白的活性和免疫原性要远远高于原核表达的蛋白，利用本发明的真核表达系统表达的全长PCV2 Cap蛋白，具有表达量高的优点，并且可以形成病毒样颗粒。本发明真核表达系统生产PCV2 Cap蛋白的方法安全可靠，成本较低，适合大规模生产，为大量生产猪 圆环2型特异性血清学检测抗原和猪圆环病毒2型疫苗的抗原成分蛋白Cap蛋白提供了基础。利用本系统生产的猪圆环病毒2型颗粒样疫苗可以诱导高水平的免疫抗体，并且可以提供良好的保护。
图1PCV2 Cap基因PCR扩增结果注:M，DNA分子量标准；I，PCV2 0RF2基因的PCR产物；2，阴性对照。图2表达载体pP-secSUM03-Cap的酶切电泳鉴定结果；注:M，DNA分子量标准；I，重组空载体SUM03质粒的Hind III和SalI双酶切产物；2，重组质粒pP-secSUM03_Cap的Hind III和SalI双酶切产物。图3SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图；注:1，重组空载体SUM03质粒电转酵母后表达产物；2，3，4重组质粒pP-secSUM03-CAP电转酵母后表达产物；M，蛋白marker分子量标准。
具体实施例方式1、实例I毕赤酵母表达系统表达重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白(I)以GenBank中PCV2_TJ(序号AY181946)毒株基因序列为模板，用软件Primer5.0设计一对引物PU P2，分别在PU P2的5 ‘端分别加入FokI和SalI酶切位点:P 1:5’ CGTGGTCTCCAGGTATGACGTATCCAAGGAGGCGT3’P2:5’ GGTCTCAGATCTTCAAGGGTTAAGTGGGGGGT3’以PCV-2感染的PK15细胞培养物中提取的DNA产物为模板，应用PCR技术扩增出了实验室分离毒株PCV-2的Cap蛋白全基因。该目的基因片段大小为722bp ；(2)以常规方法利用限制性内切酶FokI和SalI双酶切目的基因，实现与pP-secSUM03酵母表达质粒的连接，构建重组Cap基因的酵母表达质粒，并命名为pP-secSUM03-Cap ；(3)重组菌株pP-secSUM03_Cap的扩增、提取:具体操作为，大肠杆菌JM109按常规活化后制备感受态，取pP-secSUM03-Cap质粒DNAl U 1，常规CaC12法转化JM109，将转化后的JM109菌液涂布于含不同浓度梯度的Zeocin(抗生素，Invitrogen公司)的低盐LB平板中，20_22h后取单菌落，扩增，并以质粒抽提试剂盒(Pix)Hiega公司)抽提质粒；上述低盐LB平板的配方为:酵母提取物0.5 %，蛋白胨I %，NaCl 0.5 %，琼脂1.5 %，pH7.5，最后筛选出高拷贝菌株；(4)以限制性内切酶SacI单酶切含pP-secSUM03-Cap，0.8 %琼脂糖电泳回收完全线性化的质粒DNA，与酵母GS115的感受态菌液混合进行电转化；电转化详细操作为:取GSl 15感受态菌液80 ill与10 ill线性化质粒DNA混合，冰浴5分钟后，加入0.2cm规格的电转杯，以电转仪(伯乐公司)，1500V电压电击，立即加入Iml的IM山梨醇溶液，转移至一无菌管中，30°C静置I小时30分钟后，分别取50、100、200、400iil涂布于含100 u g/mlZeocin的YPDS板上，30°C避光培养3天后，同时以不含Cap的空质粒pP_secSUM03电转化GS115作对照，挑取单克隆至ImlYPD中，30°C振荡培养至对数生长期，-20°C冻存；上述YPDS平板的配方为:酵母提取物1%，胰蛋白胨2%，D-葡萄糖2%，山梨醇1M，琼脂2% ；
(5)利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选重组阳性表达酵母菌；电转化后的单克隆冻存菌10 Ul经活化后，以1: 100接种于IOOmlYPD培养液中，30°C振荡培养，每隔24小时取菌液1ml，高速离心后去菌体沉淀，将上清分装，-20°C保存待测；电泳前，取500iil培养上清，加入2倍体积无水乙醇，_20°C 30分钟，12000rpm离心5分钟，沉淀浓缩蛋白，蛋白浓缩后溶于20iU 6X载样缓冲液中，10(TC 3分钟变性后，上样于12%聚丙烯酰胺凝胶，50mA电泳；(6)取上述重组阳性表达酵母菌培养上清经镍柱纯化分离，制得猪圆环病毒2型衣壳蛋白Cap，分子量约为28KD，包括全长234个氨基酸。具体操作为:取2L重组阳性酵母菌及(命名为酵母菌B1-3)及2L转化空载体pP-secSUM03的酵母菌(定名为酵母菌SC3-1，作为对照组)第4天培养上清，分别经SOOOrpm离心15分钟后，去除沉淀，上清经超滤20倍浓缩(分别定名为B1-3浓缩液和SC3-1浓缩液)，通过HIS标签纯化柱分离后，加入SUMO蛋白酶2同步进行透析和标签切除，再次过镍柱纯化后，即可获得猪圆环病毒2型衣壳蛋白Cap,并包装成猪圆环病毒2型病毒样颗粒。(7)采用Western blot鉴定表达的重组PCV2 Cap蛋白。取冻干样品进行SDS-PAGE电泳，然后在进行转膜，将凝胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，封闭液封闭后，加上针对PCV2Cap蛋白的单抗，再加上带有标记物的二抗。然后判定重组PCV2 Cap蛋白的表达。结果说明表达的重组PCV2-Cap蛋白能够同猪圆环2型抗体特异性结合，说明重组PCV2 Cap蛋白具有特异的猪圆环2型免疫原性。(8)利用纯化的猪圆环病毒2型病毒样颗粒，辅以佐剂ISA206，制备猪圆环病毒2型颗粒样疫苗准备不同浓度的抗原稀释物，并与ISAQ206佐剂混合乳化。ISA206佐剂经121°C、60分钟高压湿热灭菌，按照抗原/佐剂体积比例1: 1.5混合。使用胶体磨乳化，乳化时先将佐剂加入筒内，在搅拌状态下(200rpm)缓缓将抗原水相加入佐剂中，加完后，继续搅拌5分钟。12000rpm，乳化3分钟，得到PCV2 Cap蛋白颗粒样疫苗成品。(9)制备好的疫苗经粘度检测、离心检测、剂型检测、稳定性检测后，各项指标均符合规定。疫苗保存于4°C。
2、实例2重组PCV2 Cap衣壳蛋白颗粒样疫苗的效力检测:按照实例I中乳化方法制备含不同剂量重组Cap蛋白的颗粒样疫苗(分别包含重组衣壳蛋白0.g/头份、I ii g/头份、g/头份、g/头份、IOii g/头份)，筛选10 14日龄的无猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪蓝耳病病毒等主要病原的猪。将符合条件的仔猪随机分成7组，每组10头，5组给予包含不同量重组Cap蛋白的颗粒样疫苗，I组做为攻毒对照组，另一组做为阴性对照组。疫苗组进行两次免疫，间隔2周，攻毒组注射相同剂量的PBS，接种方式采血滴鼻1ml，颈部肌肉注射2.5ml，隔离饲养。在第二次免疫后21天对疫苗组和功毒对照组进行攻毒，阴性对照组不攻毒，单独隔离饲养。攻毒后21天进行剖杀。所有猪在第一次免疫前、攻毒前和剖杀前收集血样。收集的血样，通过Elisa法进行PCV2血清抗体检测。攻毒后21天剖检全部猪只，观察各组织器官的病理变化、拍照记录。符合以下3项中的任何2项，即可判为发病。A临床症状:仔猪体温升高(彡40°C )，至少持续3天，出现明显食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长缓慢出病理变化:腹股沟淋巴结和气管淋巴结肿大、肺脏轻度水肿、肾脏发黄或有点状坏死。组织学病变为淋巴结有明显淋巴细胞侵入，或有多核巨细胞；0病毒检测:用PCR检测淋巴结组织，检测到PCV2。
权利要求
1.猪圆环病毒2型衣壳蛋白CAP颗粒样疫苗是通过以下方法制得的: (1)Cap蛋白基因的扩增 以GenBank中PCV2-TJ (序号AY181946)毒株基因序列为模板，用软件Primer5.0设计一对引物，在两条引物的5端分别加入FokI和SalI酶切位点:Pl:5’ CGTGGTCTCCAGGTATGACGTATCCAAGGAGGCGT3’P2:5’ GGTCTCAGATCTTCAAGGGTTAAGTGGGGGGT3， 以PCV-2感染的PK15细胞培养物中提取的DNA产物为模板，应用PCR技术扩增出了实验室分离毒株PCV-2的Cap蛋白全基因。该基因片段大小为722bp ； (2)分泌型表达载体的构建、筛选、鉴定: 通过设计的Fokl/Sall双酶切位点，将目的基因Cap克隆入赤酵母分泌型表达载体pP-SeCSUM03中，转入大肠杆菌JM109，用PCR和双酶切方法鉴定得到重组菌株pP-secSUM03-Cap。
(3)Cap蛋白的表达: 阳性重组质粒经纯化、线性化处理后用BioRad公司电转仪电转化毕赤酵母菌株GS115, Zeocin Tm浓度梯度筛选高拷贝菌株，挑取单克隆菌培养，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选阳性表达菌。将重组阳性表达酵母菌上清经镍柱纯化分离后，加入SUMO蛋白酶2同步进行透析和标签切除，再次过镍柱纯化后，制得猪圆环病毒2型衣壳蛋白Cap。
(4)利用纯化的猪圆环病毒2型衣壳蛋白，辅以佐剂，制备猪圆环病毒2型颗粒样疫苗。
2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型衣壳蛋白，其特征在于，所述引物P1、P2为:Pl:5’ CGTGGTCTCCAGGTATGACGTATCCAAGGAGGCGT3’P2:5’ GGTCTCAGATCTTCAAGGGTTAAGTGGGGGGT3’。
3.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型衣壳蛋白，其特征在于，所述的聚合酶链式反应(PCR)的条件为:50 μ I 的 PCR体系如下:5 XPrimeSTAR Buffer (Mg2+Plus) 10 μ 1,2.5mmol/LdNTPs4 μ 1，20mmol/L 引物各 I μ I, PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5U/μ I) 0.5 μ I,灭菌三蒸水33μ 1，DNA 模板 1μ I ;PCR 的反应程序为:98°C 10s，55°C 5s, 72°C 40s，35 个循环，72°C延伸7min，4°C 保存。
4.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型衣壳蛋白，其特征在于，所述酵母表达载体是pP-secSUM03。
5.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型衣壳蛋白，其特征在于，毕赤酵母菌株GS115。
6.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型衣壳蛋白，其特征在于，所述步骤(4)中所述佐剂为水性佐剂或油性佐剂。
7.根据权利要求1 5任意一项方法生产的重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白。
8.根据权利要求1 6任意一项方法生产的重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白颗粒样疫苗。
全文摘要
本发明提供了生产猪圆环病毒2型衣壳蛋白Cap颗粒样疫苗的方法，该方法以GenBank中PCV2-TJ毒株基因序列为模板，运用常规PCR方法扩增得到PCV-2衣壳蛋白Cap的成熟编码序列。将此基因与毕赤酵母分泌型表达载体pP-secSUMO3连接，构建pP-secSUMO3-Cap重组质粒，并用热激法转化大肠杆菌JM109进行扩增。阳性重组质粒经纯化处理后用BioRad公司电转仪电转化毕赤酵母菌株GS115。抗生素ZeocinTm浓度梯度筛选高拷贝菌株，分别提取这些高拷贝菌株的基因组DNA，以此为模板做PCR反应鉴定阳性克隆。通过仔猪攻毒试验，验证该颗粒样疫苗具有良好的免疫保护作用。
文档编号C07K14/01GK103169961SQ201210011758
公开日2013年6月26日 申请日期2012年1月16日 优先权日2012年1月16日
发明者文贤子, 张志刚, 杜恩岐, 廖峰 申请人:北京伟嘉人生物技术有限公司