一种用于检测循环肿瘤细胞表型的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于检测循环肿瘤细胞表型的试剂盒，它包括：E?cadherin、Cadherin?11和EpCAM抗体分别与不同的寡核苷酸偶联得到的抗体?寡核苷酸探针；用于将上述抗体?寡核苷酸探针进行PCR扩增的扩增引物及缓冲液；还包括荧光探针。本发明所述的试剂盒通过将E?cadherin、Cadherin?11和EpCAM作为标识物，进行平行检测CTC中各抗原的含量，从而分析得到CTC中各表型的含量，区分出CTC的各表型。
【专利说明】
-种用于检测循环肿瘤细胞表型的试剂盒
技术领域
[0001] 本发明设及免疫法检测领域，具体地说是一种用于检测循环肿瘤细胞表型的试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 循环肿瘤细胞(CTC)是指自发或因诊疗操作由实体瘤原发灶或转移灶释放进入外 周血循环的肿瘤细胞，一般W单个细胞或细胞团（又称循环肿瘤微栓子，CTM)的形式存在于 循环系统中。转移是癌症相关死亡的主要原因，而CTC被视为转移的种子。CTC为了获得运动 性和侵袭性，会丢失某些上皮细胞的表型(包括形态、表面抗原、基因表达等)并获得某些间 充质细胞的表型，运就是上皮-间质转变化抓，化；[1：11611曰1-]\1636]1油5〇]1曰1化曰]13；[1：；[0]1)。多数 恶性肿瘤细胞在脱离原发灶的过程中发生EMT。因此CTC存在不同表型，包括上皮表型、间质 表型和中间表型。表型分析对于发现肿瘤、判断转移情况、判断预后、治疗情况等都有重要 意义。最近研究发现，CTM与间质表型CTC密切相关，并且高比例的间质表型CTC与化疗耐药 有关(Science 2013:339:580)。另外的研究显示，CTM可抵御失巢调亡(ano化is)、耐受细胞 毒药物(Journal of Clinical Oncology,2012;30:525)、比单个肿瘤细胞具有更强的转移 潜能（Clinical Cancer Research，2001 ;7:4080)。因此，CTM和间质细胞表型CTC(EMT CTC) 与单个普通CTC相比，与预后的相关性可能更强。
[0003] 现有的区分CTC表型的方法主要有通过密度、分子大小或基于生物标识物EpCAM (上皮细胞粘着分子)等。通过密度、分子大小容易导致CTC漏筛，而基于化CAM仅可检测出上 皮表型CTC，同时正常细胞表达相同标志物EpCAM会导致假阳性，而表型异质性会导致假阴 性，结果并不准确。
[0004] 同时，CTC在外周血中的浓度非常低，因此检测CTC需要的敏感度较高。多标志物抗 体的联合应用可有效提高检测敏感性和特异性（Journal of the National Cancer Institute，2009，101 (1): 61-66)。为了检测CTC的表型，需要能区分CTC表型的标识物及检 测平台。
【发明内容】
[0005] 本发明的主要目的是针对现有技术存在的不足提供一种用于检测CTC表型的试剂 盒，该试剂盒能够高效准确的检测出上皮表型、间质表型和中间表型的CTC，同时检测敏感 度高，操作快速便捷。
[0006] 本发明是通过如下技术方案实现的：一种用于检测循环肿瘤细胞表型的试剂盒， 它包括：
[0007] 由E-cadhe;rin、Ca化erin-ll和E：pCAM抗体分别与不同的寡核巧酸偶联得到的抗 体-寡核巧酸探针；
[000引用于将上述抗体-寡核巧酸探针进行PCR扩增的扩增引物及缓冲液；
[0009] 还包括巧光探针；
[0010] 进一步的，所述抗体-寡核巧酸探针包括寡核巧酸探针部分和抗体部分;所述寡核 巧酸探针部分是将寡核巧酸的5 '端进行醒基修饰后得到的，所述抗体部分是将抗体进行阱 基修饰后得到的；所述寡核巧酸探针部分和所述抗体部分经过偶联得到所述抗体-寡核巧 酸探针。
[0011] 更进一步的，所述寡核巧酸探针部分是将5 '端带有氨基修饰的寡核巧酸，用摩尔 当量为5-20倍的SFB进行醒基修饰后得到的;所述抗体部分是将抗体用摩尔当量为10-50倍 的SANH进行阱基修饰后得到的。
[0012] 其中，上述的SFB是指4-甲酯苯甲酸N-班巧酷亚胺醋；上述的SANH是指4-(N-马来 酷亚胺基甲基)环己烧-1-簇酸班巧酷亚胺醋。
[0013] 所述抗体-寡核巧酸探针是将摩尔比为（7-10):1的寡核巧酸探针部分和抗体部 分，在室溫条件下反应4-24小时后得到的。
[0014] 优选的，所述寡核巧酸的长度为16-2化t，5'端为6-14nt长度的引物识别序列，3' 端用延伸引物进行延伸扩展。
[0015]进一步的，所述延伸引物的长度为50-8化t，它的3'端末端与寡核巧酸的3'端互补 配对，5'端可W形成发卡结构，且中间序列与巧光探针的序列互补。延伸引物的序列优选为 沈Q ID NO: 14所示。
[0016] 优选的，所述寡核巧酸的序列为SEQ ID NO: 1-13中所示的任一个。
[0017] 所述扩增引物中包括一对用于将抗体-寡核巧酸探针进行PCR扩增的正向、反向引 物，所述正向引物的5'端与寡核巧酸互补。
[0018] 优选的，所述循环肿瘤细胞为宫颈癌、乳腺癌或前列腺癌循环肿瘤细胞中的一种 或多种。
[0019] 发明原理
[0020] E-ca化erin抗原在大多数上皮组织中表达。E-ca化erin的表达调控在EMT过程中 起重要作用。当CTC从上皮表型向间质表型转变时，E-cadher in的表达量降低。而且选择性 的E-ca化erin能导致人类癌组织的去分化和侵略性。E-ca化erin在上皮表型CTC和中间表 型CTC中是存在的，但是在间质表型CTC中是不存在的。运是一个很好的标识物，用来区分上 皮表型CTC/中间表型CTC和间质表型CTC。
[0021] 化CAM抗原是一个细胞膜表面的糖蛋白，在上皮癌症细胞中高度表达，而在正常上 皮细胞中低表达。EpCAM常常在间质表型CTC中表达下调，但是在上皮表型CTC和中间表型 CTC中均有表达。
[0022] 化化erin-11抗原是一种细胞粘附分子，常常在成骨细胞和肿瘤细胞中表达。在中 间表型CTC和间质表型CTC中都有Ca化erin-11。因此Ca化erin-11可W作为区分上皮表型 CTC和中间表型CTC/间质表型CTC的依据。在前列腺癌的CTC中，Ca化erin-11的表达量更高。
[0023] 各种表型CTC中抗原的表达情况如文献《化ture Reviews Clinical Oncology》， 2014化1;11(7):401-12公开的，通过将6-。日化日1'；[]1、〔日化日1'；[]1-1巧日化〔41作为标识物，可^ 进行CTC中各表型的分析。
[0024] 本发明具有如下有益效果：
[0025] 1.本发明所述的试剂盒通过将E-ca化erinXa化erin-ll和EpCAM作为标识物，进 行平行检测CTC中各抗原的含量，从而分析得到CTC中各表型的含量，区分出CTC的各表型。
[0026] 2.本发明通过偶联醒基和阱基得到抗体-寡核巧酸的方式，可W制备得到上述抗 体分别与寡核巧酸偶联的Ξ种探针，每种抗体-寡核巧酸探针的寡核巧酸都不相同。从而可 W通过寡核巧酸的PCR扩增，来平行检测CTC中各抗体分别对应的抗原含量。
[0027] 3.用延伸引物对寡核巧酸的3 '端扩增，可W保证寡核巧酸链过短时的PCR扩增要 求，并且延伸引物5'端的发卡结构可W增加碱基的堆搁力，从而增强探针敏感性，使通用型 抗体-寡核巧酸探针检测更加灵敏。
[00%] 4.由于寡核巧酸与延伸引物是在3'端互补配对的，因此延伸扩展的过程在PCR扩 增过程中可自行反应，延伸扩展之后再W延伸后的抗体-寡核巧酸为模板进行扩增，一步反 应即可，反应效率高。
[0029] 5.由于采用了PCR扩增的方式，比传统化ISA方法检测的敏感度提高了几个数量 级，即使CTC的浓度很低，也可W对微量抗原进行检测。
【具体实施方式】
[0030] W下通过具体实施例来进一步说明本发明：下列实施例中未注明具体条件的实验 方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0031] 本发明要得到抗体-寡核巧酸探针，其是通过先将寡核巧酸与抗体分别进行醒基 和阱基的定向修饰得到寡核巧酸部分和抗体部分，再进行腺键偶联得到。优选的，所述寡核 巧酸探针部分是将5 '端带有氨基修饰的寡核巧酸，用摩尔当量为5-20倍的Si^进行醒基修 饰后得到的，优选摩尔当量为10倍;所述抗体部分是将抗体用摩尔当量为10-50倍的SANH进 行阱基修饰后得到的，优选摩尔当量为25倍。其中，SFB为4-甲酯苯甲酸N-班巧酷亚胺醋， SANH为4-(N-马来酷亚胺基甲基)环己烧-1-簇酸班巧酷亚胺醋。用SFB修饰寡核巧酸的5'端 上的氨基可W得到醒基活化的寡核巧酸，用SANH修饰抗体可W得到阱基活化的抗体蛋白。 运两个反应为公开技术可W得到的，如中国文献"基于核酸分子杂交的免疫忍片抗体固定 新方法"，《分析化学》，2013年第2期，沙莎等公开的。反应时间、反应溫度等条件可根据文献 内容做出本领域技术人员公知的调整。本发明优选的技术方案为:将5'端带有氨基修饰的 寡核巧酸用pH值为7.4的PBS缓冲液溶解，然后与摩尔当量为寡核巧酸10倍的sra溶液混合， 室溫反应2.5小时，再纯化得到醒基修饰的寡核巧酸探针部分。将抗体用pH值为7.4的PBS缓 冲液稀释后，与摩尔当量为抗体25倍的SAN田容液混合，室溫反应2.5小时，再纯化得到阱基 修饰的抗体部分。最后将摩尔比为(7-10): 1的寡核巧酸探针部分和抗体部分在室溫下偶联 反应得到所述抗体-寡核巧酸探针。
[0032] W下通过实施例1来进行进一步说明，其余未说明的具体条件及实验方法，按照常 规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0033] 本实施例中所述的"室溫"是指常规的室内溫度，一般为15-3(TC。
[0034] 本实施例将序列为沈Q ID顯：（1-13)的011旨〇简写为011旨〇(1-13)，011旨〇为寡核 巧酸。
[0035] 本实施例中的PBS缓冲液为憐酸缓冲液，MES缓冲液为2-(N-吗嘟代）乙横酸缓冲 液。
[0036] 本实施例中的QPCR为实时巧光定量PCR。
[0037] 本实施例中的Nano化op为分光光度计。
[0038] 本实施例中的BCA法是指蛋白质浓度测定的定量方法。
[0039] 本实施例所用的缓冲液为:配置不同pH值的PBS缓冲液，在本发明的【具体实施方式】 中，具体包括抑值为6.0的PBS缓冲液，W及抑值为7.4的PBS缓冲液，并且配置抑值为5.0的 MES缓冲液，过滤除菌处理，4 °C存放。
[0040] 实施例化-ca化er in-寡核巧酸探针
[0041] (1)寡核巧酸探针的醒基修饰
[0042] 将50nmol的01igol(寡核巧酸）用0.1M的pH7.4的憐酸缓冲液配置成溶液。称取 500皿01的SFB(4-甲酯苯甲酸N-班巧酷亚胺醋），用无水DMF(N，N-二甲基甲酯胺)溶解后，在 室溫反应2.化，过柱纯化得到01ig〇-FB(醒基修饰的寡核巧酸）。
[0043] 检测Oligo-FB的浓度：用化no化op分光光度计检测A26Q的值，计算Oligo-FB的浓度 为0.65醒〇1/化。
[0044] 检测醒基修饰率：用定量的2-阱化晚-2-盐酸盐溶液检测醒基修饰率。取上述 Oligo-FB加入到2-阱化晚-2-盐酸盐溶液中，振荡混匀后于37°C反应化，用化no化op检测 360nm处的吸光值为1.31，计算其修饰率，A360下的修饰率为0.87。
[0045] (2)抗体E-ca化er i η的阱基修饰
[0046] 对抗体E-ca化erin进行脱盐纯化后用Nano化op检测抗体蛋白浓度为6.5mg/mL。
[0047] 用抑值为7.4的憐酸缓冲液稀释抗体E-ca化erin至浓度为2mg/mL。称取25倍量的 SANH(抗体与SANH的摩尔比为1: 25)，溶解在无水DMF中，再加入到抗体中，在室溫反应2.化， 过柱纯化得到E-ca化erin-SANH(阱基修饰的E-ca化erin)。
[004引检测E-ca化erin-SANH的浓度：通过BCA法计算修饰后的E-ca化erin-SANH的浓度 为1.60mg/mL。
[0049]检测阱基修饰率：用定量的2-甲酯苯横酷钢盐溶液检测阱基修饰率。取纯化后的 抗体-SANH加入到的2-甲酯苯横酷钢盐溶液中，满旋混匀后于37 °C反应化，Nanodrop检测 348nm处的吸光值为0.36。通过348nm处的吸光值和E-cadherin-SANH的浓度计算出E- ca化er in-SANH的阱基修饰率为3.2。
[(K)加](3)01ig〇-FB 与 E-ca 化 erin-SANH 的偶联
[0051] 将Oligo-FB与E-ca化erin-SANH按照摩尔比7:1混合满旋混匀，室溫反应地，最后 得到的产物经过过柱纯化后即可得到所述通用型E-ca化er in-01 igo探针。
[0化2] 取E-ca化erin-Oligo探针进行化no化op检测。在354皿下有明显吸收峰出现，说明 01 ig〇-FB 与 E-ca 化 er in-SANH 的偶联成功。
[0053] 取E-ca化erin-Oligo探针进行SDS-PAGE检测，分析E-ca化erin与oligo偶联程度， 跟纯的E-ca化erin比较，得到多条电泳条带，说明E-ca化erin上偶联了不同数量的寡核巧 酸。
[0054] 取E-ca化erin-Oligo探针进行BCA法浓度检测。BCA法浓度检测计算偶联物抗体的 浓度。用单链定量试剂盒定量E-ca化erin-Oligo中Oligol的浓度。可W计算出E-ca化erin 与Oligol的比例，并可W和修饰率结果比较。说明了E-cadherin-Oligo分子中Oligol与抗 体的偶联比，结果如表1所示。
[005日]表1 E-ca化erin-Oligo分子中Oligo与抗体的偶联比
[0化6]
[0化7]实施例201igo分子的QPCR扩增特异性检测
[0化引将Oligol-13分子稀释至浓度为25000分子数/μ1、83333分子数/μ1和250000分子 数/μΙΞ个浓度。然后W0ligol-3为例，将Oligol-3在相同浓度下混合，得到混合样品Α、Β、 C，如表2所不。
[0059] 表2实施例2样品配方
[0060]
[0061] 将上述样品按照表3配置QPCR扩增液，得到QPCR扩增试剂盒，然后按照表4所示的 程序对Oligol-3进行QPCR扩增，W及对混合样品A、B、C中的Oligol-3各自进行QPCR扩增，W 各自延伸扩展后的Oligol-3为模板，扩增结果的Ct值如表5所示。其中，延伸引物为RT-P，它 的3'端末端与寡核巧酸的3'端互补配对，5'端可W形成发卡结构，且中间序列与MGB探针 (MGty)的序列互补即可，本实施例的RT-PW序列为SEQ ID ^:14所示为例。正向引物为尸口， 反向序列为3?。。？^序列为569 10顯：15所示为例，1??^序列为569 10顯：16所示为例， MGtyW序列为SEQ ID ^:17所示为例，5'端的巧光基团用。41标记，3'端为168。
[0062] 表3 01 igo分子的QPCR扩增试剂盒
[0063]
[0064] 表4 QPCR扩增程序
[00 化]
[0066] 表5扩增结果Ct值[0067]
[006引从表5可W看出，混合样品A、B、C中的Oligol-3,在相同浓度下扩增的ct值与单个 Oligo的扩增Ct值为0.1左右。同时，根据每条Oligo的不同浓度样品绘出回归直线，算得回 归直线方程及相关系数R2如下：
[0069 ] 01igo1：y = -3.3664x+40.11,R2 = 0.99937；
[0070] 01igo2：y = -3.384x+40.809,R2 = 0.99997；
[0071 ] 01ig〇3:y = -3.3824x巧8.928，R2 = 0.99463。
[0072]将每条Oligo对应的A-C号样品根据各个方程进行计算，算得分子数除W对应理论 分子数，所得检测效率如下：
[0073][0074]
[0075] 因此，平行样品间扩增Ct差值为0.1左右，检测效率为98.5%-110.5%之间，说明 Ξ条Oligo分别与其余两条没有非特异性扩增，相互之间不会影响扩增效率。其余Oligo经 鉴定可W得到同样结果，说明本实验设计的多条Oligo之间无交叉影响，可W保证多重PCR 的特异性、精确性和灵敏度。其他Oligo可W得到同样的结论，由于篇幅原因不一一详细说 明。
[0076] 实施例3制作标准曲线
[0077] W〇ligol-13可W得到同样的结果，为了简化过程，W下实施例W〇ligol-3为例。 [007引按照实施例1的步骤，用摩尔当量为5倍的SFB对01igo2进行修饰得到Oligo-FB，用 摩尔当量为10倍的SANH对EpCAM进行阱基修饰得到化CAM-SANH，将摩尔比为10:1的Oligo- FB与化CAM-SANH在室溫条件下反应16小时后得到化CAM-01igo2。
[0079] 按照实施例1的步骤，用摩尔当量为20倍的sra对01igo3进行修饰得到Oligo-FB， 用摩尔当量为50倍的SANH对Ca化erin-11进行阱基修饰得到化化erin-11-SANH，将摩尔比 为8:1的Oligo-FB与Cadherin-11-SANH在室溫条件下反应24小时后得到Cadherin-11- 01igo3。
[0080] 将 E-ca 化 erin-Oligol、化CAM-01igo2 和 Ca 化 erin-ll-01igo3 按照表 3 的试剂盒和 表4的程序进行QPCR扩增，W延伸扩展后的Oligol-3为模板，得到的扩增结果与Oligol-3单 独扩增一致，说明偶联的抗体部分对Oligo的PCR扩增没有影响。
[0081 ]用标准品稀释液将 E-ca 化 erin-Oligol、E；pCAM-〇ligo2 和化化日1'；[]1-11-011旨〇3各 自稀释成浓度为:833、2500、8333、25000、83333和250000分子数/2.541，共六个浓度，空白 对照组为去离子水。
[0082] 按照表3所示的配方配置QPCR扩增试剂盒，然后按照表4所示的程序对W上各浓度 的6-。日化日1'；[]1-011肖〇1、化〔41-011肖〇2和化化日1'；[]1-11-011肖〇3进行0?〔巧广增，^延伸扩展后 的01 igol-3为模板，扩增结果如表6所示：
[0083] 表6标准曲线QPCR扩增结果Ct值
[0084]
[0085] 根据抗体-Oligo的不同浓度的Ct值，绘出标准曲线，进行线性回归计算，得到回归 直线方程及相关系数如下：
[0086] E-caclherin-01 igol:y = -3.2951X+42.554，R2 = 0.9978;
[0087] 化CAM-01igo2:y = -3.3332X+40.384，R2 = 0.9961;
[0088] Ca化erin-11-01igo3:y = -3.872X+43.542，R2 = 0.9659。
[0089] 实施例4CTC细胞抗原的QPCR检测
[0090] 取不同癌症病人的外周血血液，对血液中的CTC抗原量进行检测。要求受试者血常 规白细胞值位于2 X 106~1.2 X 107个/mL之间，并且血液样本在处理过程中，样本没有出现 W下异常现象:如样本红细胞裂解不完全导致样本细胞粘连、样本红细胞裂解后剩余细胞 偏少/白细胞偏少，全血样本出现溶血或血块凝结。并且受试者相关信息完整，样本采集、保 存方法规范，实验操作规范，具体步骤如下：
[0091] (1)取不同癌症病人血液3ml，加入12mL细胞裂解液，轻轻颠倒充分混匀。然后将样 品置于2-8°C冰箱中裂解15min后离屯、弃上清，加入lOmLPBS洗涂细胞;离屯、弃上清，再加入 400yLPBS重悬细胞。
[0092] (2)加入100μΙ blocking buffer后室溫封闭20min;再加入E-ca化erin-Oligol、 化CAM-01igo2和化化erin-ll-01igo3探针后，在室溫解育40min后终止反应并离屯、去上清。
[0093] (3)使用PBS洗涂细胞3遍后加入120ul洗脱液混合均匀，冰上解育2min，离屯、取 lOOul上清，洗脱未反应的探针;最后加入20yL反应中和液中和。
[0094] 用实施例3制作标准曲线相同的QPCR条件检测E-ca化erin-Oligol、化CAM-01igo2 和化化e;rin-ll-01igo3探针的Ct值，结果如表7所示：
[0095] 表7 CTC的QPCR检测结果
[0096]
[0097]实施例5 CTC抗原的免疫巧光检测
[009引为了检测本发明试剂盒检测结果的可靠性，对与实施例4相同的血液进行免疫巧 光检测，其步骤如下：
[0099] (1)取与实施例4相同的病人血液3ml，加入12mL细胞裂解液，轻轻颠倒充分混匀。 然后将样品置于2-8°C冰箱中裂解15min后离屯、弃上清，加入lOmLPBS洗涂细胞；离屯、弃上 清，再加入40化LPBS重悬细胞。
[0100] (2)使用CD45磁珠去除部分白细胞，离屯、后使用lOOul PBS重悬细胞。
[0101] (3)加入浓度为4%的多聚甲醒溶液固定后涂片，PBS洗Ξ遍后封闭30分钟，PBS再 洗Ξ遍。
[0102] (4)分别加入各个标记的一抗E-ca化e;rin、EpCAM和化化erin-ll抗体，在4°C湿盒 内过夜，PBS洗Ξ遍。
[0103] (5)DAPI染核并封片后，用巧光显微镜鉴定计数，结果如表8所示：
[0104] 表8 CTC的免疫巧光检测结果
[0105]
[0106] 从表7和表8的检测结果可w看出，Ct值越低的样品，含有的抗原分子个数越高。而 镜检所得巧光阳性CTC个数越多，即E-ca化erin、化CAM及化化erin-11含量越多，表明Ct值 与镜检个数二者呈负相关，一致性良好。
[0107] A号病人的Ca化erin-11抗原表达量低，说明CTC处于上皮型。B、D号病人的E- ca化e;rin、EpCAM及化化erin-ll抗原的表达量均略高，说明CTC处于中间型。而C、E号病人的 E-ca化erin抗原的表达量较低，且E号病人的化CAM抗原表达量也很低，说明他们处于CTC的 上皮细胞的特性逐渐丢失，经过EMT从上皮型转化为了间质型。
[0108] 对上述A-E编号的病人进行术后跟踪，术后复发的结果如表9所示：
[0109] 表9术后复发结果
[0110]
[0111] 通过表9可W看出，C、E组的病人术后3个月复发。与C、E组病人的间质型CTC具有更 强的转移潜能和侵袭能力结果是一致的。[0112] 对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还 可W做出若干改进和润饰，运些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。
【主权项】
1. 一种用于检测循环肿瘤细胞表型的试剂盒，其特征在于:它包括： 由E-cadherin、Cadherin-ll和EpCAM抗体分别与不同的寡核苷酸偶联得到的抗体-寡 核苷酸探针； 用于将上述抗体-寡核苷酸探针进行PCR扩增的扩增引物及缓冲液； 还包括焚光探针。2. 根据权利要求1所述的用于检测循环肿瘤细胞表型的试剂盒，其特征在于：所述抗 体-寡核苷酸探针包括寡核苷酸探针部分和抗体部分;所述寡核苷酸探针部分是将寡核苷 酸的5'端进行醛基修饰后得到的，所述抗体部分是将抗体进行肼基修饰后得到的；所述寡 核苷酸探针部分和所述抗体部分经过偶联得到所述抗体-寡核苷酸探针。3. 根据权利要求2所述的用于检测循环肿瘤细胞表型的试剂盒，其特征在于:所述寡核 苷酸探针部分是将5'端带有氨基修饰的寡核苷酸，用摩尔当量为5-20倍的SFB进行醛基修 饰后得到的;所述抗体部分是将抗体用摩尔当量为10-50倍的SANH进行肼基修饰后得到的。4. 根据权利要求1所述的用于检测循环肿瘤细胞表型的试剂盒，其特征在于：所述抗 体-寡核苷酸探针是将摩尔比为(7-10):1的寡核苷酸探针部分和抗体部分，在室温条件下 反应4_24小时后得到的。5. 根据权利要求1所述的用于检测循环肿瘤细胞表型的试剂盒，其特征在于:所述寡核 苷酸的长度为16_22nt，5'端为6-14nt长度的引物识别序列，3'端用延伸引物进行延伸扩 展。6. 根据权利要求5所述的用于检测循环肿瘤细胞表型的试剂盒，其特征在于:所述延伸 引物的长度为50_80nt，它的3 '端末端与寡核苷酸的3 '端互补配对，5 '端可以形成发卡结 构，且中间序列与荧光探针的序列互补。7. 根据权利要求1所述的用于检测循环肿瘤细胞表型的试剂盒，其特征在于:所述寡核 苷酸的序列为SEQ ID NO: 1-13中所示的任一个。8. 根据权利要求1所述的用于检测循环肿瘤细胞表型的试剂盒，其特征在于:所述扩增 引物中包括一对用于将抗体-寡核苷酸探针进行PCR扩增的正向、反向引物，所述正向引物 的5 '端与寡核苷酸互补。9. 根据权利要求1所述的用于检测循环肿瘤细胞表型的试剂盒，其特征在于:所述循环 肿瘤细胞为宫颈癌、乳腺癌或前列腺癌循环肿瘤细胞中的一种或多种。
【文档编号】G01N33/574GK105823878SQ201610206088
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月5日
【发明人】蔡红东, 李静, 陈昌岳, 邓文斌, 甘广利, 张祥林
【申请人】上海美吉生物医药科技有限公司