一种嗜肺军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒及其用图
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种嗜肺军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒及其用途。本发明提供一种嗜肺军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒，包括位于背板上的试剂条，试剂条从加样端开始依次为样品垫、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、包被有LP抗体的硝酸纤维素膜和吸水纸。本发明所提供的检测试剂盒以患者的尿液或痰液作为检测样本，结合近红外荧光检测技术，可快速，准确的检测出患者标本中特异性、可溶性LP抗原。
【专利说明】
-种嗜肺军团菌抗原近红外黄光检测试剂盒及其用途
技术领域
[0001] 本发明设及生物技术领域，特别是设及一种嗜肺军团菌抗原近红外巧光检测试剂 盒及其用途。
【背景技术】
[0002] 军团菌属的模式菌是嗜肺军团菌化egionella Pneumo地ila)，占军团菌的90% (路凤，程义斌，王仲，等.呼吸系统疾病就诊患者嗜肺军团菌感染的流行病学调查[J].环 境与健康杂质，2012, 27(3) :203-205),其散发病例占社区获得性肺炎的1% -15%、医院 内感染肺炎的3. 8%、诊断困难的不典型肺炎的4%-11% (陆风，金银龙，程义斌，等.军 团菌病的流行概况[J].国外医学：卫生学分册，2008, 35(2) :78)。军团病化egionnaires disease)主要是由嗜肺军团菌引起的一种细菌性呼吸道传染病。针对尿液中LP抗原的 检测方法主要有RIA、及EIA等（张旭，马妮，郑洪.环境中军团菌快速检测方法的研究进 展.[J].中国卫生检验杂志，2009, 19(1) :210-241)。但是，RIA法具有放射性，EIA耗时较 长且感染初期血清中抗体含量达不到检测水平，不适合临床检测应用。我国现阶段对于嗜 肺军团菌的检测技术水平仍相对滞后（朱家馨，陈文思，黄静，等.一种国产嗜肺军团菌抗 原检测试剂盒的初步评价[J].实用医学杂志，2010, 26巧）：1637-1638)。因此，开发一种可 W快速准确的检测嗜肺军团菌的方法已成为临床检测研究中亟待解决的问题。
【发明内容】
[0003] 鉴于W上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种嗜肺军团菌抗原近红 外巧光检测试剂盒及其用途，用于建立高效可行的嗜肺军团菌抗原近红外巧光检测技术， 解决现有技术中的问题。
[0004] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种嗜肺军团菌抗原近红 外巧光检测试剂盒，包括位于背板上的试剂条，试剂条从加样端开始依次为样品垫、标记有 免疫巧光探针的玻璃纤维素膜、包被有LP抗体的硝酸纤维素膜和吸水纸。 阳〇化]优选的，所述免疫巧光探针为LP抗体包被的近红外巧光乳胶微球颗粒。
[0006] 更优选的，所述巧光乳胶微球颗粒的直径为140-160nm。
[0007] 近红外光（NIR)，是介于可见光（VI巧和中红外光（MIR)之间的电磁波，ASTM定义 NIR为波长在780nm-2526皿范围内的电磁波。在近红外光区，生物体自吸收或巧光强度很 小，可避免背景干扰。同时由于散射光强度与波长的四次方呈反比，近红外区的散射干扰大 为减少。
[0008] 本发明第二方面提供所述嗜肺军团菌抗原近红外巧光检测试剂盒的制备方法，包 括如下步骤：
[0009] 1)用憐酸盐缓冲液将巧光乳胶微粒离屯、清洗并将乳胶颗粒分散（将巧光乳胶微 粒用PH7. 3,0.0 lmol/L的憐酸盐缓冲溶液清洗，10000巧m离屯、lOmin，离屯、后的沉淀物用憐 酸盐缓冲液复溶，并用超声波细胞粉碎机将乳胶微粒分散，此步骤重复两次），在清洗好的 乳胶颗粒中加入LP抗体；加入邸CA使抗体与颗粒偶联；再加入乙醇胺封闭乳胶颗粒上多 余的基团，制备获得探针溶液；
[0010] 2)利用微量蛋白点膜系统将含有LP抗体的缓冲溶液喷加到硝酸纤维素膜上，烘 干备用；
[0011] 3)用制备好的探针溶液浸润玻璃纤维薄膜，真空干燥机中干燥备用；
[0012] 4)将包被LP抗体的硝酸纤维素膜、标记有免疫巧光探针的玻璃纤维素膜、样品 垫、吸水纸及背板组装制备成嗜肺军团菌抗原近红外巧光检测试剂盒。
[0013] 优选的，所述步骤1中，憐酸盐缓冲液为0. 009-0.0 llmol/l，PH7. 25-7. 35的憐酸 盐缓冲液。
[0014] 优选的，所述步骤1中，巧光乳胶微粒的直径为140-160nm。
[0015] 优选的，所述步骤1中，乳胶颗粒、LP抗体、邸CA的重量比为9-11 :0. 9-1. 1 : 0. 9-1. 1。
[0016] 在本发明一实施例中，乳胶颗粒、LP抗体、邸CA的投料量分别为lmg、100ug、 lOOugo
[0017] 所述步骤1中乙醇胺的加入量为适量，本领域技术人员可根据实际情况调整乙醇 胺的用量。
[0018] 优选的，所述步骤2中，所述缓冲溶液为PBS缓冲液。
[0019] 本领域技术人员可选取适当浓度和抑的PBS缓冲液。
[0020] 优选的，所述步骤2中，含有LP抗体的缓冲溶液中LP抗体的浓度为1. 8-2. 2mg/ ml。
[0021] 优选的，所述步骤2中，LP抗体的喷加量为0. 9-1. lul/cm。
[0022] 优选的，所述步骤2中，烘干的具体条件为36-38Γ烘箱烘干。
[0023] 优选的，所述LP抗体的制备方法如下：
[0024] 1)抗原的制备：将嗜肺军团菌菌株接种在培养基上，培养后用生理盐水从平板上 洗脱细菌，离屯、获取菌泥（同时去除平板被洗脱的液体成分），菌泥加适量PBS缓冲液超声 破裂，过阴离子柱纯化，用化C1水溶液洗涂，再用化C1水溶液洗脱，洗脱液装透析袋，用PEG 包埋吸水浓缩，获取抗原；
[0025] 优选的，所述嗜肺军团菌菌株购自ATCC。
[00%] 优选的，所述抗原的制备过程中的培养条件具体为：37°C、5% C02的条件下培养， 3-5天后洗下菌苔。
[0027] 优选的，所述抗原的制备过程中的培养基为缓冲活性碳酵母琼脂培养基度CYE)。
[0028] 优选的，所述离屯、获取菌泥的条件为4500-550化pm。
[0029] 优选的，所述用化化水溶液洗涂时，化Cl的溶液浓度为45-55mM。
[0030] 优选的，所述用化Cl水溶液洗脱时，化Cl的溶液浓度为135-165mM。
[0031] 2)单克隆抗体的制备：
[0032] 动物免疫对小鼠进行免疫；
[0033] 优选的，所述对小鼠进行免疫具体包括如下步骤：第一次免疫时抗原加等量的福 氏完全佐剂充分乳化，第二次及第Ξ次抗原加等量福氏不完全佐剂充分乳化，细胞融合前 腹腔直接注射抗原加强免疫，一免抗原加福氏完全佐剂，皮下免疫，抗原量为0.1 mg/鼠，15 天后2免，皮下免疫抗原加福氏不完全佐剂，抗原量为0. 2mg/鼠，25天后Ξ免抗原加福氏不 完全佐剂，皮下免疫，抗原量为0. 2mg/鼠，10天后剪尾己取血测化ISA效价，选取效价大于 10万倍的小鼠进行加强免疫，水剂腹腔注射抗原Img/鼠，Ξ天后取脾脏细胞融合；
[0034] 细胞融合：处死小鼠，无菌操作取出脾脏，制备B淋己细胞悬浮液，将B淋己细胞与 准备好的处于对数生长期的同系SP2/0骨髓瘤细胞混合，制备杂交瘤细胞，并进行杂交瘤 细胞筛选；
[0035] 优选的，所述单克隆抗体的制备过程中杂交瘤细胞筛选的具体方法为：用HAT培 养基培养细胞，2周后即可筛选出骨髓瘤细胞与B淋己细胞的杂交瘤细胞。
[0036] 杂交瘤细胞的克隆化：克隆细胞生长的各个孔检测100%抗体阳性为止；
[0037] 优选的，所述克隆化的方法是有限稀释法。
[003引抗体的制备：将小鼠首先腹腔注射石蜡，1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞，1-2周 后，用注射器抽取腹水，纯化后即可获得大量的单克隆抗体。优选的，所述腹腔内接种杂交 瘤细胞时，将杂交瘤细胞浓度调节到IX 105个/ml按每只小鼠腹腔注射1ml接种。
[0039] 优选的，所述单克隆抗体的制备过程中，小鼠为6-8周龄BALB/C小鼠。
[0040] 优选的，单克隆抗体的纯化：选择化Trap巧rotein A FF 5ml预装色谱柱纯化抗 体，收集纯化的抗体备用。
[0041] 本发明第Ξ方面提供所述嗜肺军团菌抗原近红外巧光检测试剂盒在嗜肺军团菌 抗原检测领域的用途。
[0042] 所述用途具体为使用所述嗜肺军团菌抗原近红外巧光检测试剂盒对嗜肺军团菌 抗原进行检测。 阳0创近红外光（NIR)是介于可见光（VI巧和中红外光（MIR)之间的电磁波，ASTM定义 NIR为波长在780nm-2526皿范围内的电磁波。在近红外光区，生物体自吸收或巧光强度很 小，可避免背景干扰。同时由于散射光强度与波长的四次方呈反比，近红外区的散射干扰大 为减少。随着激光巧光、传感器、免疫检测装置的建立，近红外巧光分析仪在免疫测定领域 中显示出极大的优越性。
[0044] 本发明所提供的检测试剂盒W患者的尿液或疲液作为检测样本，结合近红外巧光 检测技术，可快速，准确的检测出患者标本中特异性、可溶性LP抗原。LP抗原近红外巧光检 测法灵敏度高，特异性好，检测过程中样品收集及处理简单，可快速准确的获得结果，非常 适合突发事件现场和基层使用。
[0045] 嗜肺军团菌抗原近红外巧光检测技术灵敏度高，特异型好，可应用到临床检测中， 为临床治疗提供定性依据。
【具体实施方式】
[0046] 细菌培养是LP感染检测的金标准，但LP的培养条件苛刻，耗时长，不适合临床检 测及现场检测；因感染LP第3-6周后患者血清中抗体含量才能达到检测水平，达不到疾病 早期诊断的要求，故血清抗体检测常用于LP感染的流行病学回顾性调查。LD患者在感染 1-3天后即可由尿液排出具有热稳定性及抗膜蛋白酶活性的LP 0-多糖抗原，该抗原在尿 液中的浓度比血清中高30-100倍。与EIA相比，近红外巧光检测法操作更简便，耗时更短， 是更理想更有发展前景的检测手段。
[0047] 本发明所提供的嗜肺军团菌抗原近红外巧光检测法，实验室考核结果显示，该法 对LP1型抗原的最低检出量为lOng/ml，不与其他血清型抗原及多种细菌发生交叉反应，与 细菌培养结果较一致，具有较高的敏感性和特异性。由于嗜肺军团菌培养条件要求苛刻，可 能导致阳性样品漏检。整体而言，近红外巧光法检测嗜肺军团菌的可信度及各项性能均已 达到临床定性检测的要求，有望用于由嗜肺军团菌引发的军团病的快速早期诊断。
[0048] W下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所掲露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可W通过另外不同的具体实 施方式加 W实施或应用，本说明书中的各项细节也可W基于不同观点与应用，在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0049] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中 另外明确指出，单数形式"一个"、"一"和"运个"包括复数形式。
[0050] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点W及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可W使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。
[0051] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术 领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技 术及相关领域的常规技术。运些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook 等 MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor L油oratory Press，1989and Third edition，2001;Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons，化w York,1987and periodic updates ;the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego ；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998 ;METH0DS IN ENZYMOLOGY， Vol. 304,Chromatin(P. M. Wassarman and A. P. Wolffe，eds. )，Academic Press，San Diego， 1999;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, C虹omatin Protocols (P.B. Becker, ed. )Humana Press, Totowa，1999 等。
[0052] 本发明各实施例中试验菌种由军事医学科学院提供；交叉实验所用细菌由本实验 室培养保存。近红外巧光检测仪，由上海凯创生物技术有限公司开发提供。 阳〇5引实施例1
[0054] 1.疲液采集及保存 阳化5] 患者在医务人员指导下，用力咳出呼吸道深部的疲液，吐至无菌广口瓶内，立即盖 紧盖子保存备用，待处理的样本应置于4°C冰箱保存。
[0056] 2.尿液采集及保存
[0057] 患者在医务人员的指导下清洗并收集清晨第一次尿液，收集的尿液装在干净无菌 的容器中保存备用。尿液样本在2-8°C条件下可W保存72小时，如需保存更长时间，则必须 将样品保存在-20°C环境下。应避免反复冻融样品，否则会产生错误的实验结果。样品不可 保存在自动除霜冰箱中。 阳化引 3.抗原的制备：
[0059] 从ATCC购买嗜肺军团菌菌株，接种在缓冲活性碳酵母琼脂培养基度CY巧上， 37°C、5% C02的条件下培养，3-5天后用生理盐水从平板上洗脱细菌，500化pm离屯、获取菌 泥（同时去除平板被洗脱的液体成分），菌泥加适量PBS缓冲液超声破裂，过阴离子柱纯化， 用50mM化C1洗涂，再用150mM化C1洗脱，洗脱液装透析袋，用阳G包埋吸水浓缩，获取抗 原。
[0060] 4. LP单克隆抗体的制备： 阳06U 动物免疫：选择6-8周龄BALB/C小鼠进行免疫，第一次免疫时抗原加等量的福氏 完全佐剂充分乳化，第二次及第Ξ次抗原加等量福氏不完全佐剂充分乳化，细胞融合前3 天腹腔直接注射抗原加强免疫，一免抗原加福氏完全佐剂，皮下免疫，抗原量为0.1 mg/鼠， 15天后2免，皮下免疫抗原加福氏不完全佐剂，抗原量为0. 2mg/鼠，25天后Ξ免抗原加福 氏不完全佐剂，皮下免疫，抗原量为0. 2mg/鼠，10天后剪尾己取血测化ISA效价，选取效价 大于10万倍的小鼠进行加强免疫，水剂腹腔注射抗原Img/鼠，Ξ天后取脾脏细胞融合； 阳06引细胞融合：采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，制备B淋己细胞悬 浮液，将B淋己细胞与准备好的处于对数生长期的同系SP2/0骨髓瘤细胞混合，制备杂交瘤 细胞；
[0063] 杂交瘤细胞筛选：用HAT培养基培养细胞，2周后即可筛选出骨髓瘤细胞与B淋己 细胞的杂交瘤细胞；
[0064] 杂交瘤细胞的克隆化：克隆化的方法是有限稀释法，按照实验室的常规方法进行， 克隆化3-4次，直至克隆细胞生长的各个孔检测100%抗体阳性为止； W65] 抗体的制备：取BALB/C小鼠，首先腹腔注射石蜡，1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细 胞，将杂交瘤细胞浓度调节到1X 1〇5个/ml按每只小鼠腹腔注射1ml接种。1-2周后，用注 射器抽取腹水，即可获得大量的单克隆抗体。
[0066] 单克隆抗体的纯化：选择化Trap巧rotein A FF 5ml预装色谱柱纯化抗体，收集纯 化的抗体备用。
[0067] 5.免疫巧光LP抗体颗粒制备： W側用0. 01mol/L，PH7. 3 + 0. 05的憐酸盐缓冲液将直径为150皿的巧光乳胶微粒离屯、 清洗2遍并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒中加入LP抗体；加入邸CA使抗体与颗粒 偶联；加入乙醇胺封闭乳胶颗粒上多余的基团按每毫克微球乳胶100微克的待标记抗体， 100微克的邸CA用量标记。每毫克的微球乳胶最后加20微克的乙醇胺进行封闭。
[0069] 6.试剂盒的制备： 阳070] 用0. 01M pH7. 2的PBS缓冲液稀释LP抗体至最适浓度2. Omg/ml，利用微量蛋白点 膜系统将溶液喷加到适当孔径的硝酸纤维素膜上，按lul/cm的量进行喷膜，37°C烘箱烘干 备用。
[0071] 用制备的巧光乳胶微粒-抗体复合物浸润玻璃纤维薄膜，真空干燥机中干燥备 用。
[0072] 将包被LP抗体的硝酸纤维素膜、标记有免疫巧光探针的玻璃纤维素膜、样品垫、 吸水纸及背板组装制备成嗜肺军团菌抗原近红外巧光检测试剂盒。 阳〇7引 实施例2
[0074] 嗜肺军团菌抗原近红外巧光检测法与疲液细菌培养对比实验： 阳0巧]疲液细菌培养：
[0076] 将疲液进行预处理（采用lug/ml膜酶溶液与玻璃碎片振荡相结合的方法对疲液 进行前处理后再接种培养），预处理后的样品立即接种在GVPC选择性培养基上，对疑似嗜 肺军团菌的菌落进行革兰染色，并将革兰染色阴性的疑似菌落接种在BCYE-a和BCYE-Cys 琼脂平板上，37°C溫箱培养2d。凡是在BCYE-a培养基上生长而在BCYE-切S培养基上不生 长的菌落即可认为是嗜肺军团菌。
[0077] 试剂盒检测： 阳07引待测样品为疲液稀释液，使用0. 01M pH7. 2的PBS缓冲液稀释，稀释比例为1 :1。
[0079] 待测样品及试剂盒均平衡至室溫开始检测，用滴管在每个试剂盒的加样孔内滴加 3滴样本（约120-150U1)。15分钟时，用近红外巧光检测仪检测巧光信号，并用巧光仪器 进行判断，分析仪的对巧光信号的检测范围是AD值0-10000,根据仪器的性能，CUTOFF值为 50,检测AD值大于等于50为阳性结果。
[0080] 实验结果与细菌培养结果对比验证。用于细菌培养的疲液样本与尿液样本来自相 同的患者。嗜肺军团菌抗原近红外巧光检测法与疲液细菌培养结果如表1所示： W81]表 1
[0082]
[0084] Sensitivity = 75%
[00 化]Specificity = 94. 11 %
[0086] 此外，W尿液为待测样品时，其检测结果与疲液细菌培养检测结果相符。
[0087] 实施例3
[0088] 交叉实验：
[0089] 在嗜肺军团菌抗原近红外检测试剂盒分别滴加制备好的粪肠球菌、尿肠球菌、大 肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、克雷伯菌、乳酸杆菌、淋病奈瑟菌、绿脈假单胞菌、大肠杆菌、人型 支原体、解脈脈原体、金黄色葡萄球菌、链球菌及幽口螺旋菌菌液（1 X l〇6cFU/ml)，进行交 叉实验检测，检测W上细菌是否对本试剂盒检测结果产生影响，嗜肺军团菌抗原近红外巧 光检测试剂与细菌交叉实验结果如表2所示，各细菌交叉实验中均无交叉反应发生：
[0090] 表 2
[0091]
[0092] 由实施例2中的表1和实施例3中的表2可W看出，在共30份临床样本的检测中， 经近红外巧光检测法检测LP阳性为4例，阴性为26例；疲液细菌培养LP阳性样本为3例， 阴性样本为27例。本方法的灵敏度为75%，特异性为94. 11% ;不与其他细菌发生交叉反 应；最低测出量为lOng/ml，稳定性及重复性良好。
[0093] 综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
[0094] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟 悉此技术的人±皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因 此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所掲示的精神与技术思想下所完 成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
【主权项】
1. 一种嗜肺军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒，包括位于背板上的试剂条，试剂条从 加样端开始依次为样品垫、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、包被有LP抗体的硝酸纤 维素膜和吸水纸。2. 如权利要求1所述的一种嗜肺军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒，其特征在于，所 述免疫荧光探针为LP抗体包被的近红外荧光乳胶微球颗粒。3. 如权利要求1-2任一权利要求所述的嗜肺军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒的制 备方法，包括如下步骤： 1) 用磷酸盐缓冲液将荧光乳胶微粒离心清洗并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒 中加入LP抗体；加入EDCA使抗体与颗粒偶联；再加入乙醇胺封闭乳胶颗粒上多余的基团， 制备获得探针溶液； 2) 利用微量蛋白点膜系统将含有LP抗体的缓冲溶液喷加到硝酸纤维素膜上，烘干备 用； 3) 用制备好的探针溶液浸润玻璃纤维薄膜，真空干燥机中干燥备用； 4) 将包被LP抗体的硝酸纤维素膜、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、样品垫、吸 水纸及背板组装制备成嗜肺军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒。4. 如权利要求3所述的嗜肺军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒的制备方法，其特征在 于，所述步骤1中，荧光乳胶微粒的直径为140-160nm。5. 如权利要求3所述的嗜肺军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒的制备方法，其特征在 于，所述步骤1中，乳胶颗粒、LP抗体、EDCA的重量比为9-11 :0.9-1. 1 :0.9-1. 1。6. 如权利要求3所述的嗜肺军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒的制备方法，其特征在 于，所述步骤2中，LP抗体的喷加量为：1. 8-2. 2mg/ml的抗体溶液按0. 9-1. lul/cm的喷量 制备免疫硝酸纤维素膜。7. 如权利要求3所述的嗜肺军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒的制备方法，其特征在 于，所述LP抗体的制备方法如下： 1) 抗原的制备：将嗜肺军团菌菌株接种在培养基上，培养后用生理盐水从平板上洗脱 细菌，离心获取菌泥，菌泥加适量缓冲液超声破裂，过阴离子柱纯化，洗涤后洗脱，洗脱液装 透析袋，用PEG包埋吸水浓缩，获取抗原； 2) 单克隆抗体的制备： 动物免疫：对小鼠进行免疫； 细胞融合：处死小鼠，无菌操作取出脾脏，制备B淋巴细胞悬浮液，将B淋巴细胞与准备 好的处于对数生长期的同系SP2/0骨髓瘤细胞混合，制备杂交瘤细胞，并进行杂交瘤细胞 筛选； 杂交瘤细胞的克隆化：克隆细胞生长的各个孔检测100%抗体阳性为止； 抗体的制备：将小鼠首先腹腔注射石蜡，1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞，1-2周后， 用注射器抽取腹水，纯化后即可获得大量的单克隆抗体。8. 如权利要求1-2任一权利要求所述的嗜肺军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒在嗜 肺军团菌抗原检测领域的用途。
【文档编号】G01N33/543GK105823874SQ201510006063
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2015年1月6日
【发明人】姜小华
【申请人】中国人民解放军第八五医院