专利名称：军团菌的活菌检测方法及检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及军团菌活菌的检测方法，本发明还涉及 用于该方法的检测试剂盒。
背景技术：
准确地对环境中细菌进行定性定量检测，对于有效监测病原细菌的繁殖和 传播，预防疾病的发生，保障食品安全和维护公共卫生利益具有重要意义。由军团菌 (Legionella)引起的军团菌病是非典型肺炎的重要组成部分，该菌是水环境中一种常见的 微生物，它广泛存在于各种自然水体中，人工环境中的中央空调冷却塔水和冷凝水、冷热水 管道、温泉水、游泳池以及养鱼池水都是军团菌滋生繁殖的场所。军团菌的菌体微小，人在 正常呼吸时，会将空气中含有军团菌的气溶胶吸入呼吸道内，致使军团菌有机会侵染肺泡 巨噬细胞，导致军团菌病的发生。由于军团菌营养要求较高以及标本中杂菌较多等因素，分 离培养较为困难，因此提高空调冷却水中军团菌的检出率，对于预防军团病的发生非常重 要。目前，国内外军团菌活菌定量的检测方法主要有平板分离培养法，实时荧光定量 PCR方法。前者操作繁琐，耗时较长，花费高，对培养基的要求高，条件不同的实验室之间检 测的灵敏度存在较大的差异性，不易评价和质量控制。荧光定量PCR技术与细菌分离培养 法相比具有特异性强、灵敏度高和操作简单、快速等优点，有利于细菌的早期检测。但其检 测针对样品中核酸的存在与否以及拷贝数，并不能真正的反映样品中死菌和活菌的数量， 导致假阳性率高，对于环境标本的检测其重复性和稳定性并不理想。传统金标准的军团菌 检测法是当今国际上主流的军团菌检测方法。该方法被公认主要存在以下几方面不足。 (1)传统方法的检测结果误差大。条件不同的实验室之间检测的灵敏度存在较大的差异性， 不易评价和质量控制。由于各个现场提供的监测数据无法直接进行比较，因此导致对各现 场军团菌发生状况无法精确调查和统计，对大范围的疾病检测控制工作造成困难。(2)传 统方法检测步骤繁琐，检测周期较长，花费较高，无法第一时间对军团菌的发生状况进行掌 控。(刘文华，谢风，何成彦.军团菌的实验诊断方法及其研究进展[J].中国实验诊断学， 2006,10(4) :427-429)。普通PCR技术与其它检测方法相比具有特异性强、灵敏度高和操作 简单、快速等优点，更有利于军团菌的早期诊断。但其假阳性出现率较高，重复性和稳定性 有待进一步的研究。荧光PCR已经展现出独特的优点被应用于环境中军团菌的分离和数量 的检测。尽管荧光PCR的检测灵敏度比较高，但其检测结果针对样品中核酸的存在与否以 及拷贝数，并不能真正的反应样品中死菌和活菌的数量。在水质检测方面，死菌DNA长期存 在使基因水平的检测方法高估了样品中活菌的水平。如何快速准确的鉴定出环境水中军团 菌活菌的数量，并把其和死亡菌做出正确的对比是长期以来困扰我们的一大难题。溴乙锭类化合物是一种荧光核酸插入染料，同时也是一种抗寄生虫活性药物。单 叠氮溴乙啶(ethidium monoazidem EMA)是为了光学标记DNA而合成的一种叠氮乙锭衍 生物。近年来，利用其对活菌和死亡菌细胞壁的穿透作用的不同，能迅速区别活菌和死菌的技术在国外已有报道(Rueckert, A.，Rominus, R. S.，and Morgan, H. W. 2005. Rapid differentiation and enum eration of the total, viable vegetative celland spore content of thermophilic bacilli in milk powders with referenceto Anoxybacillus flavithermus. J. Appl. Microbiol. 99 :1246-1255.)。EMA 单纯只能进入那些损害细胞内的 细胞壁和细胞膜，随后共价结合在细菌的DNA上。随后，通过可视光的光解作用，EMA所产 生的氮烯共价链接到染色体DNA上，通过光活化反应将DNA裂解成小碎段。与此相比，未结 合EMA的完整细胞仍然能在水溶液中保持一种自由的状态。也就是说，活菌细胞因具有完 整的细胞壁和细胞膜，使其得到保护不受EMA共价反应的影响。EMA能选择性进入死菌的细 胞质，通过光活化反应裂解染色体DNA，从而使其在荧光定量PCR反应中不能发生扩增。因 此，EMA结合荧光定量PCR的方法将能区别活菌DNA和死菌DNA。
发明内容
本发明的目的在于提供一种军团菌的活菌检测方法，用以克服现有技术中无法准 确快速鉴定出环境中军团菌活菌数量的问题；本发明还在于提供一种用于军团菌活菌检测的试剂盒。本发明提供了一种军团菌的活菌检测方法，该方法首先利用EMA降解待检样品中 死菌胞内DNA，再提取待检样品DNA，通过荧光定量PCR检测样品中军团菌的活菌数。具体地，本发明方法包括如下步骤1)水样品离心浓缩处理；2)向待检样品中加入EMA至终浓度为1 5 μ g/ml，暗处孵育8 12min，可视光 光照处理1 5min ；3)提取步骤2)处理后的样品DNA ；4)以步骤3)提取的样品DNA为模板进行荧光定量PCR检测目标菌的活菌数；当待检样品不是水溶液时，先将待检样品制成菌液。其中，步骤1)对样品离心浓缩处理的目的是为了获得较高浓度的菌体，以便后续 进一步操作。对于某些样本由于浓度菌体含量较低，通过浓缩后可以增加其检出率。水样 品的浓缩处理可以通过离心实现，例如在5000 7000g下离心10 15分钟。其中，步骤2)宜在4°C下进行相关操作，优选向待检样品中加入EMA至终浓度为 5μ g/ml，4°C下暗处孵育IOmin ；4°C下可视光离样本15厘米处，光照处理5min。然后离心 收集菌体，用于后续的DNA提取。光照处理可以使用卤素灯，例如在本发明实施例中优选使 用500W的卤素灯作为光源。其中，步骤3)提取军团菌DNA的方法可以是本领域所知的任何方法，包括但不限 于CTAB法、酚/氯仿法、chelexlOO等等。其中，步骤4)荧光定量PCR所用的引物可以是5s rRNA引物，优选引物序列为，上游5，-ACTATAGCGATTTGGAACCA-3，，下游5，-GCGATGACCTACTTTCGCAT-3，；所用探针为HEX-CCGCGCCAATGATAGTGTGAGGC-BHQ。此外，本发明还提供检测军团菌活菌的实时荧光定量PCR扩增反应体系，其中 20 μ 1反应液的具体配置为
权利要求
1.一种军团菌(Legionella)的活菌检测方法，该方法首先利用EMA降解待检样品中死 菌胞内DNA，再提取待检样品DNA，通过荧光定量PCR检测样品中军团菌的活菌数。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤1)水样品离心浓缩处理；2)向待检样品中加入EMA至终浓度为1 5μ g/ml，暗处孵育8 12min，然后光照处 理1 5min ；3)提取步骤2)处理后的样品DNA；4)以步骤3)提取的样品DNA为模板进行荧光定量PCR检测目标菌的活菌数； 当待检样品不是水溶液时，还包括在步骤1)前将待检样品制成菌液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，其中步骤2)向待检样品中加入EMA至 终浓度为5μ g/ml，4°C下暗处孵育IOmin ；4°C下500瓦卤素灯离样本15厘米处，光照处理 5min。
4.根据权利要求1 3任一项所述的方法，其特征在于，荧光定量PCR所用引物序列为，上游5，-ACTATAGCGATTTGGAACCA-3，， 下游5’ -GCGATGACCTACTTTCGCAT-3，； 所用探针为HEX-CCGCGCCAATGATAGTGTGAGGC-BHQ。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR扩增反应体系，其 中20 μ 1反应液的具体配置为
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述20 μ 1反应液的具体配置为
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应程序为 95°C预变性2min，1个循环；95°C变性5s，60°C退火20s，50个循环。
8.用于军团菌(Legionella)活菌检测的试剂盒，其包括EMA、军团菌荧光定量检测引 物和探针。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述引物为 上游5，-ACTATAGCGATTTGGAACCA-3，，下游5’ -GCGATGACCTACTTTCGCAT-3，；所述探针为HEX-CCGCGCCAATGATAGTGTGAGGC-BHQ。
全文摘要
本发明提供了军团菌活菌的检测方法，该方法利用EMA降解待检样品中死菌胞内DNA，再提取待检样品DNA，通过荧光定量PCR检测样品中军团菌的活菌数。本发明方法可以只检测出军团菌活菌并进行计数。本发明还提供了用于该方法的检测试剂盒。将此技术运用到环境水样军团菌的检测中，并与传统的细菌培养计数方法、普通PCR法、普通荧光定量PCR法进行比较，结果证明本发明灵敏快速、污染率低、成本低，能准确地对军团菌活菌进行定性和定量检测，可用于对环境水源军团菌污染的监测。
文档编号C12Q1/06GK102146480SQ201110109509
公开日2011年8月10日 申请日期2011年4月26日 优先权日2011年4月26日
发明者任红宇, 卢金星, 秦天, 邵祝军 申请人:中国疾病预防控制中心传染病预防控制所