专利名称：一种嗜肺军团菌检测试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及嗜肺军团菌检测的试剂盒，特别是饮用水供水系统中嗜肺军团菌的快 速检测试剂盒及其应用，属于分子检测技术领域。
背景技术：
饮用水供水系统中的嗜肺军团菌的检测方法主要有以下几类一是基于细菌培养 的形态学与生化鉴定检测技术，以国标GB/T4789. 7-2003为代表；二是免疫学检测技术， 包括血清特异抗体检测法、尿抗原检测法等；三是分子生物学检测技术，包括核酸探针及 PCR检测技术(刘广华等，军团菌的实验诊断方法及其研究进展.中国实验诊断学[J]， 2006(10) :427-429;林云万，嗜肺军团菌分子生物学检测及流行病学分型方法.热带医学 杂志[J]，2009 (9) :840-842)。其中第一类方法因基于对嗜肺军团菌的直接分离培养，存在 所需时间较长，阳性率低，培养基的配置复杂，价格昂贵等不利因素；而免疫学方法要求待 检样品中军团菌含量高，有的敏感性不高，且对试剂及操作经验要求较高等问题；近年来分 子生物学检测技术不需要对病原菌进行分离培养，越来越引起重视，聚合酶链式反应(PCR) 技术可直接取样品用于基因检测，在检测的快速性、安全性、准确性、灵敏性等方面均有优 势，成为嗜肺军团菌快速检测的重要方法。分子生物学检测是通过PCR扩增16S rRNA基因、5S rRNA基因、23S rRNA与5S rRNA基因间隔序列、巨噬细胞感染力增强因子基因(mip)来达到放大目的基因拷贝数，检 测目的菌的目的。其中针对各种rRNA基因的扩增主要是用于军团菌属(Legionella)的检 测，而针对mip基因的扩增则用于嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)的检测，mip基因 的表达产物是巨噬细胞感染力增强因子，它是一种分子量在M_27kD的外膜蛋白，在嗜肺 军团菌的感染过程中起重要作用，可以促进吞噬细胞对细菌的摄入，破坏细胞的杀菌作用。 存在于嗜肺军团菌各菌株中的mip基因有较高的同源性(一般> 98% )，近年来也发现在 一些非嗜肺军团菌中，如阿尼沙军团菌(Legionella anisa)、链球菌(Streptococcus)、麦 氏塔特洛克菌(Tatlockia micdadei)等中也存在mip基因，但与嗜肺军团菌的mip基因同 源性相对较低。但PCR技术在军团菌检测的实际应用中存在以下问题(1)常规操作繁琐，尤其是 扩增模板的制备方法较繁琐；( 特异性不够高，对相近菌属的检测会产生假阳性；(3)常 规检测时间与快速免疫学检测方法相比没有优势，检测时间需要4小时以上。饮用水供水系统中嗜肺军团菌的大量存在对饮用者的身体健康有极大的危害，因 此快速有效的检出方法对预防上述危害的发生就十分必要。由于饮用水供水系统中存在的 嗜肺军团菌数量相对较低，不易检出，因此简便、快速、灵敏的检测方法具有重要的实际意 义。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种嗜肺军团菌检测试剂盒及其应用。
一种嗜肺军团菌检测试剂盒，其特征在于，它含有如下引物
外引物Primer F2 5' TGCAAGACGCTATGAGTGGCGC 3' Primer R2 :5’ TCCCAAGTTGATCCAGCGGGCA 3’
内引物
Primer Fl :5’ TGAGTGGCGCTCAATTGGCT 3’ Primer Rl :5’ AACCTGGAACGTTGCTGGCT 3，。所述嗜肺军团菌检测试剂盒中的2XPCR反应液由双蒸水配制，其组分浓度为 Taq DNA 聚合酶0. 1 0. 2U/ μ LdNTP 混合物(dATP，dGTP, dCTP, dTTP)0. 4 0. 8mmol/L
0017]MgCl2 2 4mmol/L KCl80 120mmol/L16 Mmmol/L 。 上游内引物(Primer Fl)Tris-HCl(pH8. 3) 0. 14 0. 18ymol/L
下游内引物(Primer Rl)0. 14 0. 18ymol/L
上游外引物(Primer F2)1 1. 6 μ mol/L 下游外引物(Primer R2)1 L 6 μ mol/L上述嗜肺军团菌检测试剂盒在饮用水检测中的应用，步骤如下 (1)取水样，经滤膜过滤后，无菌双蒸水洗脱后，离心，取沉淀，并用无菌双蒸水漂 洗1-3次，得模板；(2)取步骤(1)制得的模板，加双蒸水至与2XPCR反应液等体积，然后与嗜肺军团 菌检测试剂盒中2 XPCR反应液混合，控制PCR反应条件如下反应1预变性93°C，2分钟；然后，变性92°C，15秒，退火58°C，15秒，延伸72°C，5秒， 25个循环后；延伸72 °C，2分钟；反应2预变性93°C，2分钟；然后，变性92°C，15秒，退火55°C，15秒，延伸72°C，5秒， 35个循环后；延伸72°C，2分钟。所述步骤(1)中的滤膜为0. 22 μ m的滤膜。所述步骤(1)中的离心的条件为12000rpm离心1分钟。原理说明本发明是根据嗜肺军团菌各菌株中的mip基因有较高同源性，针对嗜肺军团菌 (Legionella pneumophila)mip基因中的保守序列，设计两对引物，第一次PCR反应扩增一 对外引物之间的序列，扩增产物作为第二次PCR反应的模板，扩增内引物之间的mip基因中 329bp保守序列。对于嗜肺军团菌各菌株，即使菌的浓度极低，也可以通过两次PCR成功扩 增得到329bp mip基因此区域，而由于两对引物与非嗜肺军团菌基因组的同源性低，不能与 非嗜肺军团菌结合，无扩增产物，从而实现扩增的特异性、灵敏度。另外本发明基于研究发现，对于所收集的革兰氏阴性菌，其PCR反应所使用DNA模 板可以采用简单的方法制备，即收集菌体后以双蒸水洗涤1次，最后用双蒸水悬浮；由于饮
4用水供水系统中PCR反应干扰物较少，故可以采用此方法，使检测过程更简单、省时。本发明的有益效果如下1、本发明所述的试剂盒使用操作简便，PCR反应混合体系配制简单，检测快速；2、不需富集培养嗜肺军团菌、不需通过提取基因组DNA制备模板，检测步骤简单；3、本发明针对饮用水供水系统中嗜肺军团菌浓度低的特点，采用高特异性引物， 以及中途进退式巢式PCR扩增技术，实现检测的高特异性和敏感性；4、本发明针对饮用水的特点，采用无菌双蒸水漂洗1-3次的方法制备模板，大大 节省了检测时间。
图1是本发明所述嗜肺军团菌检测试剂盒检测结果的电泳图；图中，左泳道为分子量标准，右泳道为样品(检测为阳性)，扩增片断为329bp。
具体实施例方式为了更加详细地解释本发明，下面将给出本发明的实施例。这些实施例仅仅出于 解释和说明的目的，不应该被理解为对本发明范围的限制。实施例中的滤膜购自Millipole公司的0.22 μ m聚碳酸酯膜；DNA分子量标准 可采用 Fermentas FastRuler Low Range DNA Ladder、电泳上样缓冲液采用 Fermentas 6XOrange Loading Dye。实施例1
一种嗜肺军团菌检测试剂盒，其特征在于，它含有如下引物
外引物
Primer F2 5' TGCAAGACGCTATGAGTGGCGC3，
Primer R2 :5’ TCCCAAGTTGATCCAGCGGGCA3，
内引物
Primer Fl :5’ TGAGTGGCGCTCAATTGGCT 3，
Primer Rl :5’ AACCTGGAACGTTGCTGGCT 3，
PCR反应液QX)由双蒸水配制，其组分浓度为
Taq DNA聚合酶0. IU/μ L
dNTP 混合物(dATP, dGTP, dCTP, dTTP)0. 4mmol/L
MgCl23mmol/L
KCl1OOmmo1/L
Tris-HCl(pH8. 3)20mmol/L
上游内引物(Primer Fl)0. 16ymol/L
下游内引物(Primer Rl)0. 16ymol/L
(与发明内容中的范围不一致，请修改)
上游外引物(Primer F2) 1 2 μ mol/L
下游外引物(Primer R2) 1 2 μ mol/L。
实施例2
嗜肺军团菌检测试剂盒在饮用水检测中的应用，步骤如下1.水样浓缩与菌样收集取5L体积水样，通过0. 22 μ m滤膜收集菌样，过滤过程中视水样量即水样浊度可 更换滤膜；过滤后将滤膜置于50mL无菌的离心管中，加无菌双蒸水5mL，如果多张滤膜可两 张置入一管，漩涡振荡10秒；取出滤膜，合并洗脱液，12000rpm离心1分钟，弃上清液，保留沉淀。2.模板制备将获得的沉淀用l_2mL双蒸水悬浮混勻，转移至1. 5或2mL离心管中，12000rpm离 心ι分钟，弃上清液，保留沉淀；重复上述步骤1次；最后用100 μ L双蒸水悬浮沉淀、混勻， 即为制得的模板。3. PCR反应扩增mip片断将制备的模板12. 5μ L与12. 5μ L的嗜肺军团菌检测试剂盒中检测试剂混合，对 于阳性对照可采用下表
权利要求
1.一种嗜肺军团菌检测试剂盒，其特征在于，它含有如下引物 外引物Primer F2 5' TGCAAGACGCTATGAGTGGCGC 3' Primer R2 :5’ TCCCAAGTTGATCCAGCGGGCA 3’ 内引物Primer Fl 5' TGAGTGGCGCTCAATTGGCT 3' Primer Rl :5’ AACCTGGAACGTTGCTGGCT 3，。
2.如权利要求1所述的嗜肺军团菌检测试剂盒，其特征在于，所述肺军团菌检测试剂 盒中的PCR反应液由双蒸水配制，其组分浓度为Taq DNA聚合酶0.1 0. 2U/ μ LdNTP混合物0.4 — 0. 8mmol/LMgCl22 - 4mmol/LKCl80 120mmol/LTri s-HCl16 24mmol/L上游内引物0.14 0. 18ymol/L下游内引物0.14 0. 18ymol/L上游外引物1 L 6 μ mol/L下游外引物1 L 6 μ mol/L。
3.权利要求1所述嗜肺军团菌检测试剂盒在饮用水检测中的应用，步骤如下(1)取水样，经滤膜过滤后，无菌双蒸水洗脱后，离心，取沉淀，并用无菌双蒸水漂洗 1-3次，得模板；(2)取步骤⑴制得的模板，加双蒸水至与2XPCR反应液等体积，然后与嗜肺军团菌检 测试剂盒中2 XPCR反应液混合，反应1预变性93°C，2分钟；然后，变性92°C，15秒，退火58°C，15秒，延伸:72°C，5秒，25 个循环后；延伸72°C，2分钟； 反应2预变性93 V，2分钟；然后，变性92 V，15秒，退火55 °C，15秒，延伸:72 °C，5秒，35 个循环后；延伸72 °C，2分钟。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中的滤膜为0.22μ m的滤膜。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中的离心的条件为12000rpm 离心1分钟。
全文摘要
本发明涉及嗜肺军团菌检测的试剂盒，特别是饮用水供水系统中嗜肺军团菌的快速检测试剂盒及其应用，属于分子检测技术领域。一种嗜肺军团菌检测试剂盒，它含有如下引物外引物Primer F25’TGCAAGACGCTATGAGTGGCGC 3’，Primer R25’TCCCAAGTTGATCCAGCGGGCA 3’；内引物Primer F15’TGAGTGGCGCTCAATTGGCT 3’，Primer R15’AACCTGGAACGTTGCTGGCT 3’。本发明针对饮用水供水系统中嗜肺军团菌浓度低的特点，采用高特异性引物，以及中途进退式巢式PCR扩增技术，实现检测的高特异性和敏感性。
文档编号C12Q1/68GK102134588SQ20101055605
公开日2011年7月27日 申请日期2010年11月24日 优先权日2010年11月24日
发明者李力, 贾瑞宝 申请人:山东大学