专利名称：一种扩增嗜肺军团菌gyrB基因特异区的引物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种对嗜肺军 团菌(Legionella pneumophila)中gyrB基因(DNA gyrase B subunit gene，以下简称gyrB)的特异的核苷酸，特别是涉及对嗜肺军团菌中的 gyrB特异的寡核苷酸及其应用。
背景技术：
军团菌属于革兰阴性杆菌，是广泛存在于自然界的土壤和水环境中的一种条件致 病菌。军团菌可以引发军团菌病，它是一种以呼吸道感染症状为主，伴全身中毒症状的细菌 感染性疾病。自1976年首次在美国发现军团病以来，该病已呈现出世界性分布及病死率高 的两大特点。军团菌有42个种，64个血清型，其中至少有22个种与人类疾病有关，与人类 关系最密切的是嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)。嗜肺军团菌是引发军团菌病的主 要致病菌种在军团菌病例中，由嗜肺军团菌引发的病例占致病性军团菌引发病例的95%以 上，它的生长与繁殖与环境因素密切相关，集中空调的冷却塔冷却水、冷凝水以及温泉水是 军团菌在外界适宜的生存环境。当环境水中的军团菌繁殖到一定浓度，则会形成气溶胶进 而感染人。宿主感染主要受其易感性和细菌毒力的影响，任何年龄均可发生，但中老年、基 础免疫较差者、长途旅行者、吸烟者为高危人群，并以医院、宾馆、大型建筑工地等公共场所 好发。目前，细菌学培养法对疾病的诊断具有良好的敏感性和特异性，可以作为临床确 诊和鉴定的标准。但是由于军团菌不易分离培养，而且种类又繁多。利用细菌学培养法对 其进行鉴定需要价格昂贵的特殊培养基，而且细菌生长比较缓慢，要3 7d以上才能出结 果，不利于临床的快速诊断，同时要求实验人员要有比较高的技术，费时费力。近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的鉴定、检测及病害诊断中，近年来，越 来越多的分子技术用于病原菌的鉴定、检测及病害诊断中，包括特定基因序列分析、随机扩 增长度多态性(RAPD)分析、核糖体DNA限制性片段长度多态性(RFLP)分析等。和传统检 测技术相比，这些基于多聚酶链式反应(PCR)的分子检测技术，不需要经过病原菌的分离、 纯培养等过程，而且具有快速、灵敏、特异性强等优点。DNA链或染色体高级结构的变化是需要拓扑异构酶(Topoisomerase)参与的，包 括I型和II型。DNA解螺旋酶gyrase是一种II型拓扑异构酶，最早是在E. coli中发现 的，它由A、B两个亚基形式组成，gyrB就是编码B亚基的基因。和16S rRNA 一样，gyrB和 ISR均广泛存在于各种细菌细胞中，是细胞生命过程所必须的基因，但gyrB的进化速率却 是16S rRNA的3 6倍，ISR的进化速率也比16S rRNA更快，可以作为细菌分子进化和系 统分析的模式分子，近年来，人们已经开始使用它来区分、鉴定和检测许多用16S rRNA无能 为力区分的细菌，相关报道及文献也越来越多。聚合酶链式反应技术(Polymerase chain reaction，简称PCR技术)作为微生物 检测的技术目前正在得到认同和推广，该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特 异性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的预增菌或增菌过程，再通过离心及裂解制备细菌DNA模板，就可以在高特异性引物介导下的PCR过程中扩增目标序列，达到检测样品 中是否含有待测的致病性微生物的目的。PCR的扩增过程仅需2个小时。这对检验检疫部 门和临床检验无疑极大提高了工作速度和降低了工作成本
发明内容
本发明的一个目的是提供一种扩增嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)中 gyrB基因(DNA gyrase B subunit gene，以下简称gyrB)特异区的引物；本发明的另一个目的是提供一种包括扩增嗜肺军团菌gyrB基因特异区的引物的 PCR试剂盒，并利用该PCR试剂盒检测嗜肺军团菌的存在。本发明的目的通过以下技术方案实现一种对嗜肺军团菌的gyrB的特异核苷酸，所述核苷酸包含a) SEQ ID NO=I所示的核苷酸序列或者其互补DNA序列；b)上述a)中缺失、替换或插入一个或多个碱基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸 序列。所述的SEQ ID NO 1所示的分离的核苷酸，全长为2418个碱基；上述的一种对嗜肺军团菌的gyrB高度特异的核苷酸为源于gyrB的寡核苷酸，具 有SEQ ID NO 4的序列，是位于SEQ ID NO 1中的1404至1423的碱基。其中SEQ ID NO: 权利要求
一种扩增嗜肺军团菌gyrB基因特异区的引物，其特征在于a)该引物具有SEQ ID NO2 SEQ ID NO3所示的核苷酸序列或者其互补核苷酸序列；b)上述a)中缺失、替换或插入一个或多个碱基，仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于所述嗜肺军团菌gyrB基因特异区具有SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列或者其互补核苷酸序列。
3.—种权利要求1所述的扩增嗜肺军团菌gyrB基因特异区的引物的制备方法，其特征 在于包括下述步骤1)基因组的提取；2)通过PCR扩增嗜肺军团菌中的gyrB基因；3)构建gyrB基因的克隆；4)gyrB基因克隆的测序；5)核苷酸序列的拼接及分析；6)特异引物的筛选。
4.权利要求1所述的扩增嗜肺军团菌gyrB基因的引物在制备PCR试剂盒中的应用。
5.一种用于检测嗜肺军团菌的PCR试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的扩增嗜 肺军团菌gyrB基因特异区的引物。
6.根据权利要求5所述的PCR试剂盒，其特征在于还包括dNTP、缓冲液和DNA聚合酶。
7.权利要求5所述的PCR试剂盒在检测嗜肺军团菌中的应用。
8.一种利用权利要求5-7中任一项所述的PCR试剂盒检测嗜肺军团菌的PCR检测方 法，其特征在于包括以下步骤1)提取待测样品的DNA模板；2)在PCR管中加入dNTP、MgCl2UOX酶特异性反应缓冲液、Taq聚合酶、引物、待测样 品DNA模板和ddH20，混勻；3)将步骤2)中混勻的PCR管在PCR仪上扩增；4)在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果；5)分析并进行结果判断。
全文摘要
本发明涉及一种扩增嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)中gyrB基因(DNA gyrase B subunit gene，以下简称gyrB)特异区的引物，还提供了一种包括扩增嗜肺军团菌gyrB基因特异区的引物的PCR试剂盒，利用该PCR试剂盒对嗜肺军团菌进行检测，简便快速、特异性好、灵敏度高，可用于水体和临床样品的监督和检测、饮用水中病原菌检测、细菌学分类及流行病学调查等领域，具有深远的社会效益和较大的经济效益。
文档编号C12P19/34GK101967474SQ200910152070
公开日2011年2月9日 申请日期2009年7月28日 优先权日2009年7月28日
发明者周光朋, 曹勃阳, 杨磊, 王磊 申请人:天津生物芯片技术有限责任公司