专利名称：对嗜肺军团菌O9型的wzm基因特异的核苷酸及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种核苷酸及其应用，尤其涉及一种对嗜肺军团菌血清型09型{Legionella pneumophila serogroup 9)的 wzm (LPS 0-抗原的 ABC 转运子，ABCtransporter of LPS 0-antigen,以下简称似》)基因特异的核苷酸及其应用。
背景技术：
军团菌最初是在美国发现的，是一种的无芽胞革兰氏阴性杆菌，对自然环境因素抵抗力较强，主要是引起呼吸道传染疾病，可通过气溶胶的方式在空气中散布，人类会因为吸入含菌的气溶胶而感染，引起军团病(Legionnaires disease, LD)。目前已知军团菌有52个种70多个血清型，能引起人类疾病的约有20种。常见的有嗜肺军团舊(XegionellapneumophiIa，LP )、米氏军团鬼{Legionella micdadei )> 博氏军团菌QLegionella bozemanii)、菲氏军团菌QLegionellafeelei 1)、杜莫夫军团菌(.Legionella dumoffii、取长滩军团菌(Z6^io/ <977a longbeachae、等。其中嗜肺军团菌与人类疾病关系最为密切。根据0抗原的不同，嗜肺军团菌可分为15个血清型。其中大约有70%的军团菌感染是由嗜肺军团菌01引起的，20-30%是由其它血清型引起的，非嗜肺军团菌导致约5-10%的军团菌感染。嗜肺军团菌为需氧革兰阴性杆菌，兼性胞内寄生菌，无荚膜，不产酸，不产气，有一根至数根侧鞭毛或端鞭毛，可运动，菌体长2-50 ym，宽0.5-1 ym。该菌生长营养要求较高，生长时需要半胱氨酸，甲硫氨酸和铁离子等，在活性炭-酵母浸出液琼脂(BCYE)培养基上可生长，在GVPC平板上呈灰白色，边缘有紫蓝色光泽，挑起有拉丝；在含2.5 % -5.0 %的CO2环境中生长很好，厌氧条件下不生长。最适温度为35 0C - 36°C，具有一定的耐酸性和耐热性菌落颜色一般呈灰白色、紫色、蓝色或绿色，但在普通血平板、普通琼脂或巧克力琼脂上不生长。嗜肺军团菌在普通自来水中可存活400天以上，在60°C左右甚至在火山口附近的水塘里都能发现军团菌的踪迹。我国报告的病例多是嗜肺军团菌血清01型、05型、06型。在欧美各国嗜肺军团菌肺炎占肺炎病例中的2. 4 %-8.4 %。随着分子技术特别是PCR技术的发展，许多分子生物学方法被用于军团菌分子分型和流行病学研究。目前已用于军团菌分型的4种常用分子分型技术为随机扩增多态性 DNA (Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)、脉冲场凝胶电泳(Pulsed-FieldGel Electrophoresis, PFGE)、扩增片段长度多态性(Amplified fragment lengthpolymorphism, AFLP)、核酸测序分型(Sequence-based typing, SBT)。由于其一次即可分离出大量DNA片段，且具有操作简便，重复率好等优势，先后用于军团菌分子分型和流行病学调查。 聚合酶链式反应技术(Polymerase chain reaction,简称PCR技术)作为微生物检测的技术目前正在得到认同和推广，该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的预增菌或增菌过程，再通过离心及裂解制备细菌DNA模板，就可以在高特异性引物介导下的PCR过程中扩增目标序列，达到检测样品中是否含有待测的致病性微生物的目的。PCR的扩增过程仅需2个小时。这对检验检疫部门和临床检验无疑极大提高了工作速度和降低了工作成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对嗜肺军团菌血清型09型的基因特异的核苷酸，所述核苷酸为
1)SEQ ID NO: I所示的核苷酸和/或SEQ ID N0:2所示的核苷酸；
2)与I)所示的核苷酸互补的核苷酸。
上述核苷酸可以用于制备检测嗜肺军团菌血清型09型的wmt基因的PCR试剂盒、基因芯片或微阵列；所述嗜肺军团菌血清型09型可以取样于自来水、矿泉水、空调冷却水的培养物的粗提液，或是嗜肺军团菌血清型09型的纯培养物的粗提液等，均采用常规的酚氯仿法制备。本发明还提供一种PCR试剂盒，包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，所述PCR引物包括上述的核苷酸；其中所述的PCR引物优选为如SEQ ID N0:1和/或SEQ IDNO:2所示的核苷酸。SEQ NO: I ACAGATGGTTTGCCTTAC特异扩增嗜肺军团菌血清型09型的基因上游引物
SEQ NO: 2 TTCATACCAAAACCGCAG特异扩增嗜肺军团菌血清型09型的基因下游引
物
上述多重PCR检测试剂盒可以包括如下试剂10 mM dNTP 20 y L ; 10X酶特异性反应缓冲液50 ii L ;5 U/u L耐热DNA聚合酶8 y L ;引物各10 y L ;阳性对照品10 y L，阴性对照Ftn 10 u L ； ddH20 5mL。上述针对嗜肺军团菌血清型09型的PCR试剂盒，整个检测步骤包括样品预处理一扩增一电泳检测结果。引物和PCR反应体系所需要的试剂已预先加入扩增管中，使用者只需将预处理后的样本加入扩增管启动扩增反应即可，简单快速的完成检测工作。本发明还提供一种基因芯片，包括固相载体和固定在固相载体上的寡核苷酸探针，其中所述寡核苷酸探针包括上述的核苷酸；其中所述核苷酸优选为如SEQ ID N0:1和/或SEQ ID N0:2所示的核苷酸。本发明还提供一种微列阵，其包括上述的核苷酸；其中所述核苷酸优选为如SEQID NO: I和/或SEQ ID NO: 2所示的核苷酸。由上述的技术方案可见，本发明建立的一种PCR反应体系，可检测嗜肺军团菌血清型09型，该试剂盒有如下优点
(I)方法简便，周期短、速度快、可操作性强本发明所配制的PCR试剂盒配制方法简便，检测速度快、周期短，可操作性强，易于产业化生产，而检测成本却较低，市场应用前景广。本发明PCR试剂盒若用嗜肺军团菌09型的菌悬液进行PCR扩增，与经提取得到的DNA作为模板扩增所得结果一致，且敏感度和特异性无差别，可省去模板DNA的提取步骤，使操作方法得以简化。同时，相比常规生化检测方法而言，本方法所采用的待测样品可以直接是临床样品培养液，或者对检测样品进行简单分离培养就可进行检测，因而节省了物力人力。
(2)检测灵敏度高本发明提供的PCR检测试剂盒及其检测方法敏感性高，检测精度高，可以检测到lng/U L的DNA模板。对常见致病菌可以进行全面、系统、准确的检测与鉴定。(3)检测成本相对较低可以推广应用于食品卫生监督、环境监测、商品检验检疫等领域，并为其他不同致病菌检测组合提供技术模式。(4)准确性高本发明根据嗜肺军团菌09型的wzm基因的特异核苷酸序列，设计出引物。从而利用弓I物组合成复合PCR检测体系，能够直接将嗜肺军团菌血清型09型和其他近源菌分开。
图I为本发明的试剂盒检测结果图，其中1为待测样品，检测到病原菌；P为阳性对照品；N为阴性对照品；M为DL2000 DNA marker ；
图2为本发明试剂盒检测嗜肺军团菌其他血清型标准菌株电泳结果图，其中1，嗜肺军团菌09型G2774 ;2，嗜肺军团菌01型G2756 ;3，嗜肺军团菌02型G2773 ;4，嗜肺军团菌03型G2772 ;5，嗜肺军团菌04型G2781 ;6，嗜肺军团菌05型G3408 ;7，嗜肺军团菌06型G2771 ;嗜肺军团菌07型G3410 ;9，嗜肺军团菌08型G2820 ;10，嗜肺军团菌010型G2818 ；11，嗜肺军团菌011型G2824 ;12，嗜肺军团菌012型G2822 ; 13，嗜肺军团菌013型G2819 ；14，嗜肺军团菌 014 型 G2817 ;15，嗜肺军团菌 015 型 G2829 ；M, DL2000 DNA marker ；
图3为本发明试剂盒检测军团菌属非嗜肺军团菌电泳结果图，其中1，嗜肺军团菌09型G2774 ;2，戈氏军团菌；3，麦氏军团菌；4，长滩军团菌；5，沃氏军团菌；6，施氏军团菌；7，博兹曼军团菌；8，安氏军团菌；M, DL2000 DNA marker ；
图4为本发明检测军团菌属临床菌株电泳结果图，其中1，嗜肺军团菌09型G2774;2，嗜肺军团菌01型G2759 ;3，嗜肺军团菌01型G2760 ;4，嗜肺军团菌02型G2761 ;5，嗜肺军团菌03型G2762 ;6，嗜肺军团菌07型G2763 ;7，嗜肺军团菌07型G2764 ；M, DL2000 DNAmarker ；
图5为本发明试剂盒检测其它种属近源菌种标准菌株电泳结果图，其中1，嗜肺军团菌09型G2774 ;2，沙门杆菌；3，痢疾志贺菌；4，金黄色葡萄球菌；5，小肠结肠炎耶尔森菌；6铜绿色假单胞菌；7，嗜水气单胞菌；M，DL2000 DNA marker ；
具体实施例方式 为保证本发明的上述和其它目的特征和优点更明白易懂，下面特举较佳实施例，同时结合说明书附图及具体实例对本发明进一步详细描述。实施例I :
基因组的提取
(I)在超净工作台中，从菌种保藏管中吸取少量菌液，划线接种到军团菌BCYE生长平板上,37° C，5. 0% CO2 培养 5-7 天。(2)向BCYE生长平板中加入2mL无菌水，用无菌圆头玻璃棒轻轻刮起菌苔，然后将菌悬液吸到I. 5 mL离心管中，8000 rpm离心5分钟，弃上清，重复洗一次。(3)加入 250 u L 50 mM Tris-HCl 缓冲液(pH 8. 0)重悬，12000 rpm离心 5 分钟，
弃上清。
(4)加入 250 uL 50 mM Tris-HCl 缓冲液(pH 8.0)重悬，再加 10 u L 0. 45MEDTA (pH 8. 0)，充分悬浮，37°C温浴20分钟。(5)加入 10 UL 20 mg/mL 溶菌酶，37°C温浴 20 分钟。(6)加入I. 5 U L 20 mg/mL蛋白酶K,轻柔混勻。 (7)加入15 ii L 10%SDS, 50°C水浴2小时至溶液澄清，期间轻轻颠倒混匀若干次。(8)加 2 u L 20 mg/mL RNAse，65°C水浴 30 分钟。(9)用剪去尖头的枪头将上述溶液移到新的洁净离心管中。(10)在通风橱中加入250 UL苯酚氯仿异戊醇(25 :24 :1)，充分混匀，12000rpm，4°C离心10分钟，上清液转移到新的离心管，重复一次。(11)在通风橱中加入250 y L氯仿异戊醇(24 :1)，充分混匀，12000 rpm，4°C离心10分钟，上清液转移到新的离心管。(12)加入2. 5倍体积的提前预冷的无水乙醇，轻摇，于_80°C沉淀DNA。12000 rpm,4。。离心 15 min。(13)用I mL 70%冰乙醇洗涤DNA沉淀，然后在65°C，10 min烘干。(14)用30 UL TE溶解，并于-20 ° C冰箱备用。用I. 0 %的琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取效果，同时用NanoDrop2000 OD仪测量DNA的纯度和浓度。实施例2
引物的设计
嗜肺军团菌血清型09型的0-抗原基因簇序列是本实验室自测的，通过比对分析，选取wzm基因作为该菌的特异靶基因，针对嗜肺军团菌09型的wzm基因的特异区设计引物；如表I所示，上游引物是5’- ACAGATGGTTTGCCTTAC _3’，见序列SEQ ID NO: I ;下游引物是5’ - TTCATACCAAAACCGCAG _3’，见序列 SEQ ID NO: 2。表I嗜肺军团菌血清型09型的特异引物序列
权利要求
1.一种对嗜肺军团菌09型的wzm基因特异的核苷酸，其特征在于，所述的核苷酸具有 DSEQ ID NO: I所示的核苷酸和/或SEQ ID N0:2所示的核苷酸； 2)与I)所示的核苷酸互补的核苷酸。
2.—种PCR试剂盒，包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，所述PCR引物包括上述的核苷酸；其中所述的PCR引物为如SEQ ID N0:1和/或SEQ ID N0:2所示的核苷酸。
3.权利要求I所述的试剂盒，其中的SEQNO: I ACAGATGGTTTGCCTTAC为特异扩增嗜肺军团菌血清型09型的wzm基因上游引物；SEQ NO: 2TTCATACCAAAACCGCAG为特异扩增嗜肺军团菌血清型09型的wzm基因下游引物。
4.权利要求I所述的试剂盒，其中还包括如下试剂10mM dNTP 20 u L ；10X酶特异性反应缓冲液50iiL ;5 U/u L耐热DNA聚合酶8yL;SEQ NO: I引物和SEQ NO: 2引物各IOuL ;阳性对照品IOuL,阴性对照品IOuL ；ddH20 5mL。
5.一种基因芯片，包括固相载体和固定在固相载体上的寡核苷酸探针，其中所述寡核苷酸探针为如SEQ ID N0:1和/或SEQ ID N0:2所示的核苷酸。
6.权利要求I所述PCR试剂盒在制备用于检测嗜肺军团菌血清型09型方面的应用。
全文摘要
本发明涉及一种对嗜肺军团菌血清型O9型的wzm基因特异的核苷酸及其应用，所述核苷酸为SEQ ID NO:1所示的核苷酸和/或SEQ ID NO:2所示的核苷酸；与上述的核苷酸互补的核苷酸。这些核苷酸可用于制备检测嗜肺军团菌血清型O9型的PCR试剂盒、基因芯片或微阵列。本发明的对嗜肺军团菌血清型O9型的wzm基因特异的核苷酸及包含该核苷酸的PCR试剂盒、基因芯片或微阵列的实用性强，PCR试剂盒配制方法简便，检测周期短、速度快，可操作性强，易于商品化生产，而检测成本却相对较低；准确性高；灵敏度高。
文档编号C40B40/06GK102628042SQ20121010530
公开日2012年8月8日 申请日期2012年4月12日 优先权日2012年4月12日
发明者冯露, 刘向前, 周光朋, 曹勃阳, 王磊, 陈敏 申请人:天津生物芯片技术有限责任公司