专利名称：检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光pcr的引物、探针序列及方法
技术领域：
本发明涉及一种检测病原微生物的PCR引物、探针序列及方法，尤其是一种同时 检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光PCR的引物、探针序列及方法，属 于生物技术领域。
背景技术：
炭疽杆菌能引起羊、牛、马等动物及人类的炭疽病，严重威胁公众财产、健康和生 命安全。鼠疫耶尔森菌可引起烈性传染病鼠疫，疾病传播快，病死率高(70% -100% )，历 史上发生过多次毁灭性的流行，也是经典的致死性细菌。嗜肺军团菌可由气溶胶介导引起 军团菌病，流行致死率可高达30%以上，我国自1982年在南京首次证实军团菌病例以来， 全国已有多起散发与暴发流行的报道。炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌均可通过空气 飞沫传播，可形成气溶胶，易引发突发公共卫生事件。快速有效的病原检测技术在炭疽、鼠 疫、军团菌病疫情的预防、控制及应急反应决策中起着极其关键的作用，对保障公众的生命 财产安全具有重要意义。目前对炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌的检测方法，主要基于对病原体的培 养、毒素检测、染色镜检、血清学(抗原或抗体)检测等，但这些方法均不适合早期快速侦 检，难以适应疫情控制的需要。虽然近年来也发展了常规PCR及DNA探针杂交技术、胶体金 技术、基因芯片技术等，但常规PCR及DNA探针杂交技术存在特异性和敏感性的问题；胶体 金技术敏感性较差，假阳性和假阴性偏高；基因芯片技术的检测成本及硬件要求均较高，并 且重复性较差(一般一个样品需重复3次才能做出综合评价)，难于推广，目前仅适合学术 性科研。此外，这些检测方法均属开放式方法，检测烈性传染病病原体时均存在严重的生物 安全与传播隐患，而且对实验仪器和环境造成交叉污染的危险性较大，易导致假阳性结果 等。目前文献所报道的这些方法，除基因芯片外均为单重检测方法，所需设备、试剂、反应参 数迥异，难于整合，不能同时检测和预警上述三种病原体，耗时较长。实时荧光定量PCR是一种封闭快速检测技术，由光电倍增管(PMT)扫描扩增产物， 经计算机数据处理后得出结果，反应在全封闭的条件下进行，扩增过程中可避免由于以前 基因扩增产物如PCR产物气溶胶等的污染而可能引起的假阳性结果，还可避免病原体核酸 片断对人体产生的潜在危害，无须开盖PCR后处理，具有实时、直观、准确的特点，尤其在烈 性传染病病原体的检测上，有着明显的优势，有示范推广价值。实时荧光PCR技术检测病毒 或细菌，其灵敏度比常规PCR高出10 100倍以上，整个检测时间缩短至3 4小时内，探 针的应用使假阳性达到了最小化。多重实时荧光PCR是在同一反应体系中加入多组引物对和多个探针，同时检测多 个目的基因的方法。该方法在具有实时荧光定量PCR快速、敏感的特性同时，可以实现一管 多检，达到省时省力的目的，提高了检测速度和效率，尤其适合疫情早期预警、排除所必须 的同时筛查检测的需要。
目前，还没有一种能同时检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌的多重实时 荧光PCR的引物、探针序列及方法，而这种引物、探针序列及方法对于应对突发传染病疫情 和流行病学调查、突发公共卫生事件应急处置的早期检测等具有重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的问题，提供一种检测炭疽杆 菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光PCR的引物、探针序列及方法。本发明解决其技术问题的技术方案如下本发明提供一种检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光PCR的 引物、探针序列，其特征是，包括由capa引物对和capa探针、及pa引物对和pa探针构成的 炭疽杆菌引物探针序列集；所述capa引物对包括两组序列(l)capa-F :SEQ ID No 1 和 capa-R :SEQ ID No :2 ；(2) capa-Fc :SEQ ID No :19 禾口 capa-Rc :SEQ ID No :20 ;所述capa探针包括两个序列(3) capa-probe :SEQ ID No :3 ；(4) capa-probec :SEQ ID No :21 ;所述pa引物对包括两组序列(5)pa-F :SEQ ID No :4 和 pa_R :SEQ ID No :5 ;(6) pa-Fc :SEQ ID No :22 和 pa-Rc :SEQ ID No :23 ;所述pa探针包括两个序列(7)pa-probe :SEQ ID No :6 ；(8)pa-probec :SEQ ID No :24。进一步地，还包括由pla引物对和pla探针、及fl引物对和fl探针构成的鼠疫耶 尔森菌引物探针序列集；所述pla引物对包括两组序列(9)ρIa-F :SEQ ID No 7 和 ρIa-R :SEQ ID No :8 ；(lO)pla-Fc :SEQ ID No :25 和 pla-Rc :SEQ ID No :26 ；所述pla探针包括两个序列(ll)pla-probe :SEQ ID No :9 ；(12)pla-probec :SEQ ID No :27 ；所述fl引物对包括两组序列(13) fI-F :SEQ ID No :10 和 fl-R :SEQ ID No :11 ；(14) f I-Fc :SEQ ID No :28 和 fl-Rc :SEQ ID No :29 ；所述f 1探针包括两个序列(15)fl-probe :SEQ ID No :12 ；(16)fl-probec :SEQ ID No :30。更进一步地，还包括由mip引物对和mip探针、piIe引物对和pile探针构成的嗜 肺军团菌引物探针序列集；
所述mip引物对包括两组序列(17)mip-F :SEQ ID No :13 和 mip-R :SEQ ID No :14 ;(18)mip-Fc :SEQ ID No :31 禾口 mip-Rc :SEQ ID No :32 ；所述mip探针包括两个序列(19)mip-probe :SEQ ID No :15 ；(20)mip-probec :SEQ ID No :33 ；所述pile引物对包括两组序列(21)pile-F :SEQ ID No :16 和 pile-R :SEQ ID No :17 ;(2 piIe-Fc :SEQ ID No :34 和 piIe-Rc :SEQ ID No :35 ;所述pile探针包括两个序列(23)pile-probe :SEQ ID No :18 ；(24)pile-probec :SEQ ID No :36。再进一步地，所述capa探针、pla探针、fl探针、及mip探针序列中的第3位碱基、 所述Pa探针序列中的第4位碱基、所述pile探针序列中的第5位碱基均为RNA碱基。本发明还提供一种用于检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光 PCR方法，其特征是，包括如下步骤①选取引物对和探针从由SEQ ID No =I-SEQ ID No :36组成的引物、探针序列中 选取引物对和探针，用荧光染料在各探针序列的5'端标记报告荧光基团，用非荧光染料在 各探针序列的3'端标记淬灭荧光基团；所述荧光染料包括FAM、J0E、TRAMA、TET、R0X、HEX; 所述非荧光染料包括ECLIPSE、BHQ ；将所述各引物对分别制成引物对工作液，并将所述各 探针分别制成探针工作液；②制备目标基因的质粒标准品从灭活的炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌 中提取基因组DNA;按常规方法，从由SEQ ID No =I-SEQ ID No :36组成的引物、探针序列 中分别选取一组capa引物对、一组pa引物对、一组pla引物对、一组fl引物对、一组mip 引物对、及一组pile引物对进行PCR扩增，获得对应的各目标基因扩增产物；将各扩增产 物分别回收、纯化，并分别连接到PGEM-T easy质粒，转化，提取质粒DNA，从而获得所述各 目标基因的质粒标准品；测定所述各目标基因的质粒标准品的浓度后，根据需要稀释分装， 置-20°C备用；③建立反应体系A. dNTPs浓度的优化；B.镁离子浓度的优化；C.耐热性RNase H 酶——Tli RNase H II用量的优化；D. Taq DNA聚合酶——ExTaq HS用量的优化；E.引物 浓度的优化；F.探针浓度的优化；G.目标基因的质粒标准品线性范围的确定；④选择荧光检测通道根据标记在步骤①所选各探针上的报告荧光基团选择荧光 检测通道。本技术方案的进一步改进如下1.所述步骤①中，选取的引物对和探针由六组引物对和六个探针构成一组capa引物对和一个capa探针、一组pa引物对和一个pa探针、一组pla引物 对和一个Pla探针、一组fl引物对和一个fl探针、一组mip引物对和一个mip探针、及一 组pile引物对和一个pile探针。2.所述步骤①中，选取的引物对和探针由三组引物对和三个探针构成
一组capa引物对和一个capa探针、或一组pa引物对和一个pa探针；以及，一组pla引物对和一个pla探针、或一组fl引物对和一个fl探针；以及，一组mip引物对和一个mip探针、或一组pile引物对和一个pile探针。3.所述步骤①中，选取的引物对和探针由两组引物对和两个探针构成一组capa引物对和一个capa探针、及一组pa引物对和一个pa探针；或者，一组pla引物对和一个pla探针、及一组fl引物对和一个fl探针；或者，一组mip引物对和一个mip探针、及一组pile引物对和一个pile探针。4.所述步骤③中，所述反应体系由以下组分构成反应体系终浓度为0. 3mmol/L 的各dNTP，反应体系终浓度为5mmol/L的镁离子，反应体系终浓度为4U/ μ 1的Tli RNase ΗΙΙ，反应体系终浓度为1.25υ/25μ 1的Ex Taq HS，反应体系终浓度为0. 4 μ mol/L的各 引物，反应体系终浓度为0.2 μ mol/L的各探针，各目标基因质粒标准品拷贝数为IO1 IO8Copy/每反应体系，CycleavePCR Buffer适量，双蒸水适量；整个反应体系的总体积 为 25 μ 1。5.还包括以下步骤⑤检测待测样品提取待测样品的基因组DNA，得到待测液； 按步骤③的反应体系加入除质粒标准品外的所有组分，并加入4μ 1所述待测液；进行实时 荧光定量PCR反应程序第一阶段初期变性，85_104°C 8-12秒；第二阶段PCR反应，为85-104 V变性4-6秒，45-65 °C退火8-12秒，然后 55-850C 20-30秒延伸同时监测荧光曲线；重复40-60个循环；判断阳性的标准是CT值在35个循环内，且所述荧光曲线呈S形。炭疽杆菌致病性与其产生的外毒素和多肽荚膜有关，二者分别由2个质粒(pXOl 及pX02)编码。pXOl质粒含有编码保护性抗原的PA基因，PA结合于细胞表面受体，是形成 主要致病性的水肿毒素(ET)的关键因子。PX02含荚膜合成相关基因capA，编码的荚膜有 抗吞噬作用，capA缺失的菌株不能形成荚膜，易被白细胞吞噬并杀死，因而没有致病作用。 炭疽杆菌同时具有PXOl质粒和pX02质粒时才显示病原性，如果只有其中一种质粒，即为 弱毒株或无毒株。鼠疫耶尔森菌的基因组中，Pla基因和cafl基因是相当稳定和非常特异 的分子生物学特征，不论是典型的或是非典型的鼠疫菌均具有这两种特征。pla基因表达 的含312个氨基酸的纤维蛋白溶酶原活性因子是一种多功能蛋白，可介导鼠疫菌对宿主上 皮细胞、内皮细胞及胞外基质的黏附和侵袭，是一种关键的毒力因子，肺鼠疫引起的侵袭性 肺炎和快速死亡依赖于其活性。cafl基因表达的Fl荚膜抗原，为一种糖蛋白，有高度免疫 原性和特异性，是最重要的鼠疫保护性抗原。嗜肺军团菌基因组中PilE基因编码的IV型 菌毛蛋白，参与细菌的黏附、活动力以及对特异性靶细胞的识别等多种生物功能活动，且与 军团菌的毒力紧密相关，为嗜肺军团菌1 15血清型所共有，具有种属特异性和高度保守 性；此外，国外相关研究表明，某些嗜肺军团菌含有的巨噬细胞感染增强因子(mip)基因可 调控M 27kD外膜蛋白的形成，这种蛋白介导气溶胶进入肺泡巨噬细胞，可以使正常身强 体壮的人患病，这使过去认为军团菌为条件致病菌的理论受到了极大冲击。由此可见，在疫情和突发公共卫生事件(例如疫区空气、水源污染，公众收到装 有不明粉末的信件，研究机构中病原菌的意外散播等等)中，因预警、控制及应急反应决策 的需要，对于炭疽杆菌，需同时检测PA和capA，以区分是否存在强毒株或弱毒、无毒株；对于鼠疫耶尔森菌，因涉及国家法定甲类传染病(最高级别)，应尽可能准确可靠定性，所以 宜同时检测Pla基因和cafl基因，这样即可双重复核又可避免漏诊；对于嗜肺军团菌，因亚 型较多，如能同时检测其特异性结构分子PilE基因和主要毒力因子Mip基因，将提高检出 率和增强预警水平。本发明采用实时荧光Cyc IeavePCR方法，其中包括由RNA和DNA构成的杂合 Cycling探针、及核糖核酸酶H(RNaSe H)，本方法灵敏度高，能够高效率地检出目的基因。 当探针与扩增产物中的互补序列杂交后，RNase H在RNA部分将探针切断，淬灭抑制作用解 除，荧光物质发出荧光，通过测定荧光强度，能够实时监测扩增产物量。如果探针的RNA部 分或与其相邻的2-3个碱基部分，与模板间有一个碱基不互补，RNase H就不能在RNA部分 将探针切断。与实时荧光PCR的常规标记方法如STOR、Taqman探针法相比，本发明方法的荧光 背景更低，信噪比更高，稳定性更好，特异性非常强(可识别一个碱基的差异)，非常适合炭 疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、及嗜肺军团菌的快速侦检。本发明充分利用PCR技术的高效扩增性、核酸杂交的良好特异性和荧光检测技术 的快速敏感性，对一个样品仅需进行一个批次的检测操作，就可以完成对样品中炭疽杆菌、 鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌的检测，并同时确定强毒株、弱毒株等信息，具有结果可靠和准 确灵敏、操作简便、省时省力、成本低、效率高等优点。
图1为本发明多重实时荧光PCR方法的检测原理图。图2为本发明实施例1第一反应体系的荧光曲线图。图3为图2实施例第二反应体系的荧光曲线图。图4为本发明实施例2反应体系的荧光曲线图。图5为本发明实施例3反应体系的荧光曲线图。图6为本发明实施例4反应体系的荧光曲线图。
具体实施例方式1.引物对、探针序列的设计通过分析NCBI (美国国立生物技术信息中心)GenBank数据库中炭疽杆菌的PA和 capA基因序列，鼠疫耶尔森菌的pla和cafl基因序列，嗜肺军团菌的pilE和Mip基因序 列，使用Beacon Designer等多种生物学软件，结合经验判断和人工比对、修正，进行比较分 析，选择无二级结构且高度保守的核苷酸区域设计多对引物和探针，引物长度一般为20个 碱基左右。探针的长度一般为11个碱基，内嵌合一个RNA碱基，其余为DNA碱基。引物间 和引物内无互补序列，而且应分别特异性地针对各靶基因，相互间不存在交叉反应，可以在 同一套反应体系中同时应用于检测和区分炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌、嗜肺军团菌。具体的引 物对、探针序列见表1。表1引物对、探针序列
权利要求
1.一种检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光PCR的引物、探针序 列，其特征是，包括由capa引物对和capa探针、及pa引物对和pa探针构成的炭疽杆菌引 物探针序列集；所述capa引物对包括两组序列 (Dcapa-F :SEQ ID No 1 和 capa-R :SEQ ID No :2 ；(2)capa-Fc:SEQ ID No :19 禾口 capa-Rc :SEQ ID No :20 ； 所述capa探针包括两个序列(3)capa-probe:SEQ ID No :3 ；(4)capa-probec:SEQ ID No :21 ; 所述pa引物对包括两组序列(5)pa-F:SEQ ID No :4和 pa-R :SEQ ID No :5 ;(6)pa-Fc:SEQ ID No :22和 pa-Rc :SEQ ID No :23 ; 所述pa探针包括两个序列(7)pa-probe:SEQ ID No :6 ；(8)pa-probec:SEQ ID No :24。
2.根据权利要求1所述的检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光 PCR的引物、探针序列，其特征是，还包括由pla引物对和pla探针、及fl引物对和fl探针 构成的鼠疫耶尔森菌引物探针序列集；所述Pla引物对包括两组序列(9)ρIa-F=SEQID No 7和 pla_R :SEQ ID No :8 ；(10)pla-Fc:SEQ ID No :25 和 pla-Rc :SEQ ID No :26 ； 所述Pla探针包括两个序列(11)pla-probe:SEQ ID No :9 ；(12)pla-probec:SEQ ID No :27 ； 所述fl引物对包括两组序列(13)fI-F=SEQID No :10 和 fl-R :SEQ ID No :11 ；(14)fI-Fc:SEQ ID No :28 和 fl-Rc :SEQ ID No :29 ； 所述Π探针包括两个序列(15)fl-probe:SEQ ID No :12 ；(16)fl-probec:SEQ ID No :30。
3.根据权利要求2所述的检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光 PCR的引物、探针序列，其特征是，还包括由mip引物对和mip探针、pile引物对和pile探 针构成的嗜肺军团菌引物探针序列集；所述mip引物对包括两组序列(17)mip-F:SEQ ID No :13和 mip-R :SEQ ID No :14 ;(18)mip-Fc:SEQ ID No :31和 mip-Rc :SEQ ID No :32 ； 所述mip探针包括两个序列(19)mip-probe:SEQ ID No :15 ；(20)mip-probec:SEQ ID No :33 ；所述pile引物对包括两组序列(21)pile-F:SEQ ID No :16 和 pile-R :SEQ ID No :17 ；(22)pile-Fc:SEQ ID No :34和 pile-Rc :SEQ ID No :35 ；所述Pile探针包括两个序列(23)pile-probe:SEQ ID No :18 ；(24)pile-probec:SEQ ID No :36。
4.根据权利要求3所述的检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光 PCR的引物、探针序列，其特征是，所述capa探针、pla探针、fl探针、及mip探针序列中的第 3位碱基、所述pa探针序列中的第4位碱基、所述pile探针序列中的第5位碱基均为RNA碱基。
5.根据权利要求1所述的检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光 PCR的引物、探针序列，用于检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光PCR 方法，其特征是，包括如下步骤①选取引物对和探针从由SEQID No =I-SEQ ID No :36组成的引物、探针序列中选取 引物对和探针，用荧光染料在各探针序列的5'端标记报告荧光基团，用非荧光染料在各探 针序列的3'端标记淬灭荧光基团；所述荧光染料包括FAM、JOE、TRAMA、ΤΕΤ、ROX、HEX ；所 述非荧光染料包括ECLIPSE、BHQ ；将所述各引物对分别制成引物对工作液，并将所述各探 针分别制成探针工作液；②制备目标基因的质粒标准品从灭活的炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌中提 取基因组DNA;按常规方法，从由SEQ ID No =I-SEQ ID No :36组成的引物、探针序列中分别 选取一组capa弓丨物对、一组pa引物对、一组ρIa引物对、一组f 1引物对、一组mip引物对、 及一组pile引物对进行PCR扩增，获得对应的各目标基因扩增产物；将各扩增产物分别回 收、纯化，并分别连接到PGEM-T easy质粒，转化，提取质粒DNA，从而获得所述各目标基因 的质粒标准品；测定所述各目标基因的质粒标准品的浓度后，根据需要稀释分装，置-20°C③建立反应体系A.dNIPs浓度的优化；B.镁离子浓度的优化；C.耐热性RNase H 酶——Tli RNase H II用量的优化；D. Taq DNA聚合酶——Ex TaqHS用量的优化；E.引物 浓度的优化；F.探针浓度的优化；G.目标基因的质粒标准品线性范围的确定；④选择荧光检测通道根据标记在步骤①所选各探针上的报告荧光基团选择荧光检测 通道。
6.根据权利要求5所述的检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光 PCR方法，其特征是，所述步骤①中，选取的引物对和探针由六组引物对和六个探针构成一组capa引物对和一个capa探针、一组pa引物对和一个pa探针、一组pla引物对 和一个pla探针、一组fl引物对和一个fl探针、一组mip引物对和一个mip探针、及一组 pile引物对和一个pile探针。
7.根据权利要求5所述的检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光 PCR方法，其特征是，所述步骤①中，选取的引物对和探针由三组引物对和三个探针构成一组capa引物对和一个capa探针、或一组pa引物对和一个pa探针；以及，一组Pla引物对和一个pla探针、或一组fl引物对和一个fl探针；以及，一组mip引物对和一个mip探针、或一组pile引物对和一个pile探针。
8.根据权利要求5所述的检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光 PCR方法，其特征是，所述步骤①中，选取的引物对和探针由两组引物对和两个探针构成一组capa引物对和一个capa探针、及一组pa引物对和一个pa探针；或者，一组Pla引物对和一个pla探针、及一组fl引物对和一个fl探针；或者，一组mip引物对和一个mip探针、及一组pile引物对和一个pile探针。
9.根据权利要求5所述的检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧 光PCR方法，其特征是，所述步骤③中，所述反应体系由以下组分构成反应体系终浓度 为0. 3mmol/L的各dNTP，反应体系终浓度为5mmol/L的镁离子，反应体系终浓度为4U/ μ 1的Tli RNase ΗΙΙ，反应体系终浓度为1. 25U/25 μ 1的Ex Taq HS，反应体系终浓度为 0.4umol/L的各引物，反应体系终浓度为0. 2ymol/L的各探针，各目标基因质粒标准品拷 贝数为IO1 IO8copy/每反应体系，CycleavePCR Buffer适量，双蒸水适量；整个反应体 系的总体积为25 μ 1。
10.根据权利要求9所述的检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光 PCR方法，其特征是，还包括以下步骤⑤检测待测样品提取待测样品的基因组DNA，得到 待测液；按步骤③的反应体系加入除质粒标准品外的所有组分，并加入4 μ 1所述待测液； 进行实时荧光定量PCR反应程序第一阶段初期变性，85-104°C 8-12秒；第二阶段PCR反应，为85-104°C变性4-6秒，45-65°C退火8-12秒，然后55-85°C20-30 秒延伸同时监测荧光曲线；重复40-60个循环；判断阳性的标准是CT值在35个循环内，且所述荧光曲线呈S形。
全文摘要
本发明涉及一种检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌多重实时荧光PCR的引物、探针序列及方法，该引物、探针序列包括炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌引物探针序列集；该方法的步骤包括选取引物对和探针、制备目标基因的质粒标准品、建立反应体系和选择荧光检测通道。本发明涉及的各引物对和探针特异性和工作性能良好，可建立检测炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌及嗜肺军团菌的多重实时荧光PCR方法，具有结果可靠和准确灵敏、操作简便、省时省力、成本低、效率高等优点。
文档编号C12Q1/68GK102134594SQ20101060303
公开日2011年7月27日 申请日期2010年12月23日 优先权日2010年12月23日
发明者张锦海, 王忠灿, 王长军, 邓小昭 申请人:中国人民解放军南京军区军事医学研究所