专利名称：转基因奶牛早期胚胎性别鉴定的分子生物学方法
技术领域：
本发明属于动物繁殖技术领域，具体涉及牛早期胚胎性别鉴定领域。
背景技术：
为了充分发挥转基因奶牛的潜力，扩大转基因奶牛的规模，可以通过胚胎移植技术来提高转基因奶牛的繁殖速度，并且通过胚胎移植技术可以大大降低生产转基因奶牛的成本。对转基因奶牛早期胚胎进行性别鉴定，再进行移植，可以便外源基因有效的遗传给下一代，在生产中具有重要的科学研究价值和商业价值。到目前为止，性别控制的方法主要分为两个方面一是X、Y精子的分离技术，结合人工受精，来控制后代性别，但目前分离速度太慢(1. 8 X 107个/h)，精液价格昂贵，且分离后精液不耐冷冻，后代有一定的畸形率，因而应用受到限制。一是通过胚胎性别鉴定，结合胚胎移植来进行性别控制。家畜胚胎的性别鉴定已成为家畜胚胎移植技术的一项重要内容。用分子生物学方法鉴定家畜胚胎性别是20世纪80年代后期才开始的。目前，已被国内外研究人员广泛应用于家畜，尤其是牛胚胎的性别鉴定。其主要方法有雄性特异性DNA 探针检测法、PCR扩增DNA片段检测法、PCR扩增SRY法等。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，研究出一种可在牛生产实践中推广应用的快速、简便的鉴别方法，并通过该发明加快转基因奶牛生产。实现本发明的技术方案是1、试样的制备与保存从待检牛胚胎中分离4 6个细胞，用无菌超纯水冲洗3次后，放入0. 5mL PCR管中，加入IOuL无菌超纯水，100°C煮沸IOmin 15min，立即置于碎冰中，冷却后在4°C下离心5min，取上清液保存于4°C冰箱中备用。2、引物设计根据牛Y染色体和常染色体基因序列设计引物，利用生物学引物设计软件I^rimer 5，设计PCR扩增引物。引物序列如下Y-染色体特异性引物正向5' -TGATAGTTGATCCCACAGAAGG-3 ‘反向5' -TGAACTTACAAGCAGCTGAGG-3‘常染色体特异性引物正向5' -TGAGGCATGGAACTCCGCTTG-3‘反向5' -GGTGGTTCCACATTCCGTAGG-3‘3、PCR 反应以Y-染色体特异性引物和常染色体内标引物扩增，PCR扩增的反应体系总体积为 20uL，其中 IOXPCRBuffer 2uL，4dDNTP 的浓度均为 200pmol/L，引物浓度为 5 20pmol/L， Tap酶2. 5U，模板DNAlO 100ng/uL。反应程序为94°C预变性5min ；94°C变性30s ；53°C退火25s ；72°C延伸30s，共进行30个循环；最后在72°C延伸5min。4、PCR扩增产物检测取5uL PCR扩增产物，1 % 5%琼脂糖凝胶电泳，所述的条件是3V/cm 5V/cm， 电泳20min 50min，用溴化乙锭染色，凝胶成像系统检查，电泳图参见附图1。5、结果判定检测电泳图谱中是否出现131bp和250bp两条带；如果电泳图谱中出现131bp和 250bp两条带，即判定为雄性胚胎；如果只出现250bp条带，即可判定为雌性胚胎。
图1为DNA样鉴定性别的电泳图
具体实施例方式1、试样的制备与保存从待检牛胚胎中分离4 6个细胞，用无菌超纯水冲洗3次后，放入0. 5mL PCR管中，加入IOuL无菌超纯水，100°C煮沸IOmin 15min，立即置于碎冰中，冷却后在4°C下离心5min，取上清液保存于4°C冰箱中备用。2、引物设计Y-染色体特异性引物正向5' -TGATAGTTGATCCCACAGAAGG-3 ‘反向5' -TGAACTTACAAGCAGCTGAGG-3‘常染色体特异性引物正向5' -TGAGGCATGGAACTCCGCTTG-3‘反向5' -GGTGGTTCCACATTCCGTAGG-3‘3、PCR 反应以Y-染色体特异性引物和常染色体内标引物扩增，PCR扩增的反应体系总体积为 20uL，其中 IOXPCRBuffer 2uL，4dDNTP 的浓度均为 200pmol/L，引物浓度为 5 20pmol/L， Tap酶2. 5U，模板DNAlO 100ng/uL。反应程序为94°C预变性5min ；94°C变性30s ；53°C退火25s ；72°C延伸30s，共进行30个循环；最后在72°C延伸5min。4、结果判定取5uL PCR扩增产物，1 % 5%琼脂糖凝胶电泳，所述的条件是3V/cm 5V/cm， 电泳20min 50min，用溴化乙锭染色，凝胶成像系统检查，电泳图参见附图1。检测电泳图谱中是否出现131bp和250bp两条带；如果电泳图谱中出现131bp和 250bp两条带，即判定为雄性胚胎；如果只出现250bp条带，即可判定为雌性胚胎。
权利要求
1. 一种用于转基因奶牛早期胚胎性别鉴定的分子生物学方法，其特征在于下列步骤(1)试样的制备与保存从待检牛胚胎中切取4 6个细胞，用无菌超纯水冲洗3次后，放入0. 5mLPCR管中， 加入IOuL无菌超纯水，100°C煮沸IOmin 15min，立即置于碎冰中，冷却后在4°C下离心 5min,取上清液保存于4°C冰箱中，备用。(2)PCR反应以Y-染色体特异性引物和常染色体内标引物扩增，PCR扩增的反应体系总体积为 20uL，其中 IOXPCRBuffer 2uL，4dDNTP 的浓度均为 200pmol/L，引物浓度为 5 20pmol/L， Tap酶2. 5U，模板DNAlO 100ng/uL。反应程序为94°C预变性5min ；94°C变性30s ；53°C退火25s ；72°C延伸30s，共进行30个循环；最后在72°C延伸5min。(3)PCR扩增产物检测取5uL PCR扩增产物，1 % 5%琼脂糖凝胶电泳，所述的条件是3V/cm 5V/cm，电泳 20min 50min，用溴化乙锭染色，凝胶成像系统检查，得到电泳图。其中，步骤(2)所用引物如下
全文摘要
本发明属于动物繁殖技术领域，具体涉及一种转基因奶牛早期胚胎的性别鉴定领域。其步骤是应用显微操作技术从待检胚胎中切取4～6个细胞，用无菌超纯水冲洗后放入PCR管中，加入适量无菌超纯水，煮沸，置于碎冰中，冷却后在低温下离心，取上清夜进行PCR反应，PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，得到电泳图，观察电泳图中同时出现131bp和250bp两条带的为公牛，只出现250bp条带的为母牛。
文档编号C12Q1/68GK102477459SQ20101055572
公开日2012年5月30日 申请日期2010年11月23日 优先权日2010年11月23日
发明者张俊瑜, 王巍, 王洋, 董钧, 许静, 马毅 申请人:天津梦得集团有限公司