荧光素酶的慢病毒载体表达系统及其用途的制作方法

专利名称：荧光素酶的慢病毒载体表达系统及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及荧光素酶的慢病毒载体表达系统及其用途。
背景技术：
随着肿瘤分子生物学的不断发展，肿瘤起始和进展的相关机理研究获得了长足的进步。越来越多的癌基因和抑癌基因的发现，使人们对许多种肿瘤发生发展初期的生物学事件有了相对清晰的了解。然而，肿瘤发展的晚期事件——周围器官侵袭和远端组织转移， 则仍属于一个亟待探索的领域，而它们恰恰是导致肿瘤患者死亡的主要原因。数据显示，肿瘤转移导致的病人死亡占了肿瘤所致死亡事件的90%。肿瘤转移是一个复杂的生物学行为，包含了侵犯血管、随血液运输、远端种植等许多相关的连续步骤，因此简单的体外实验无法模拟，必须借助于有效的动物模型才有可能对其进行较好的研究。目前建立肿瘤转移模型的方法主要分两类一是利用转基因或者化学致癌物诱导的方法先建立动物肿瘤模型，然后观察其是否发生转移，第二种则是把人类肿瘤细胞或者肿瘤组织原位接种到免疫缺陷小鼠体内，再观察其转移的情况。实际上，这两种方法都是先建立体内肿瘤模型，然后让肿瘤进展，在动物衰竭前处死取样分析，以获得肿瘤转移的信息。该方法有两个明显的缺陷其一是只能检测动物在实验观察终点时的状态， 无法在肿瘤进展过程实时监测转移的发生位置，如前所述，转移是一个连续的复杂过程，只能观察一时间点的模型显然无法向本发明人展示转移过程的全貌，而若能实时获得肿瘤转移的量化数据则能为本发明人对转移的研究提供一个更好的平台；其二是对转移灶的鉴定一般只能通过免疫组化进行，要求必须对所有的可能转移器官进行大范围的切片，过程较为繁琐，如果切片不完全则有可能遗漏潜在的微小转移灶，使用更为敏感和高效的检测手段是改进的必由之路。荧光素酶(Luciferase，Luc)是一种生物体内催化底物荧光素(Iuciferin)发生氧化反应而发光的酶。目前，Luc基因不仅被广泛地应用于报告基因检测体系，通过采用活体成像技术，还可以准确地用于检测经荧光素酶修饰的细胞体内定位及增殖情况，为恶性肿瘤的体内增殖及转移的研究提供了有效的检测手段。已有研究表明带有Luc基因的肿瘤细胞在动物体内成瘤之后，借助于灵敏的活体成像系统，通过检测Luc发光强度，可间接反映出细胞的数量、肿瘤的大小和肿瘤转移位置。活体成像技术已经成为近年来动物模型研究最重要的进展。利用这一系统可以观测活体模型动物体内肿瘤的生长、转移及对药物的反应，是研究肿瘤发展及抗肿瘤药物筛选和评价的新兴手段。目前所建立的活体成像模型，多使用转染了表达荧光素酶的质粒，或者感染了表达荧光素酶的病毒的细胞系，而鲜有使用临床肿瘤组织的报道。本发明人的发明则是利用荧光素酶标记人的肝癌组织，建立了可进行持续传代，用于活体成像，可以实时监测肿瘤在体内的生长及转移情况的小鼠原位移植肝癌转移模型。由于本发明人使用的是肝癌的临床样本，所建立的模型更能体现肿瘤的生理特性，是对现有肿瘤转移模型的优化和改进。

发明内容
本发明第一方面提供一种荧光素酶慢病毒表达载体，该表达载体以rei2载体为骨架构建，含有CMV启动子及荧光素酶基因。在一具体实施方式
中，所述荧光素酶基因的序列如SEQ ID NO 1所示。本发明第二方面提供一种荧光素酶慢病毒载体表达系统，该表达系统含有本发明的荧光素酶慢病毒表达载体和包装质粒。在一具体实施例中，所述包装质粒选自pRSVREV、pMDLg/pRRE和pHCMVG。本发明第三方面提供一种分离的癌细胞，该细胞被本发明的荧光素酶慢病毒表达载体感染并稳定表达荧光素酶。本发明第四方面提供一种细胞培养物，该培养物含有本发明所述的癌细胞。在一具体实施例中，培养物中80%以上的细胞为表达荧光素酶的阳性细胞。本发明第四方面提供一种分离的癌组织，所述癌组织含有本发明所述的癌细胞。本发明第五方面提供一种标记肿瘤组织的方法，所述方法包括将本发明所述的分离的癌细胞注射到由其来源与所述分离的癌细胞的来源相同的肿瘤组织皮下移植生长形成的瘤块中，并允许注射入的表达荧光素酶的癌细胞生长增殖成为被荧光素酶成功标记的肿瘤组织。本发明第五方面提供一种构建肿瘤转移模型的方法，所述方法包括将本发明的肿瘤组织移植到该动物模型的同源组织中，从而构建得到原位移植的肿瘤转移模型。本发明还提供所述分离的癌细胞或细胞培养物在标记组织肿瘤中的应用；或所述分离的癌细胞、细胞培养物或分离的癌组织在标记肿瘤组织或构建肿瘤转移模型中的应用。


图IA显示感染表达荧光素酶的慢病毒后的AGS细胞明场照片。图IB显示由于表达荧光素酶的慢病毒载体上带有GFP报告基因，因此可以使用GFP进行分选得到80%以上表达荧光素酶的阳性细胞。图中所示为A图细胞的绿色荧光照片。图IC显示加入荧光素酶底物后进行生物发光测定，感染了慢病毒的AGS细胞有很强的荧光素酶活性(纵坐标显示出Luc值)。图2显示标记有荧光素酶的PVTT-I原位移植瘤的生长和转移情况。图3A显示荧光素酶标记的人肝癌原位移植的裸鼠模型中，裸鼠所荷的肝原位移植瘤的HE染色，体现了典型的肝癌组织特征。图:3B和3C检测移植瘤是否有门静脉癌栓形成，如图所示为典型的门静脉癌栓。图4A显示荧光素酶标记的原位移植肝癌转移模型建立示意图。图4B显示荧光素酶标记的肿瘤进行传代(肝原位移植)。
具体实施例方式本发明第一方面提供一种荧光素酶慢病毒表达载体，该载体以rei2载体为骨架构建，含有CMV启动子及荧光素酶基因。可采用本领域周知的各种荧光素酶基因来构建本发明的荧光素酶慢病毒表达载体。在一优选实施例中，本发明的使用SEQ ID NO :1所示的荧光素酶基因构建该慢病毒表达载体。用于构建本发明的CMV启动子可以是，例如pCSCG载体中所包含的CMV启动子。用于构建本发明慢病毒表达载体的骨架载体rei2也是本领域周知的，例如，可参见Qin XF et al,Inhibiting HIV-Iinfection in human T cells bylentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5, ProcNatl Acad Sci USA. ,2003, 100(1) :183-8。慢病毒表达载体的构建可采用本领域常规的方法进行。例如，可按照本申请“质粒构建和转染”所述的方法进行构建。在一优选实施例中，本发明的荧光素酶慢病毒表达载体还含有报告基因。在一个具体实施例中，该报告基因是GFP报告基因。当构建得到本发明的荧光素酶慢病毒表达载体后，可将其与包装质粒共转染包装细胞中。包装质粒可选自 pRSVREV，pMDLg/pRRE(DullT et al, Athird-generation lentivirus vector with a conditional packaging system, J Virol,1998,72(11) 8463-71)禾口 pHCMVG(Yee JK et al, Generation ofhigh-titer pseudotyped retroviral vectors with very broad host range, Methods Cell Biol. , 1994;43PtA :99-112)。包装细胞可采用细胞。可采用常规的转染方法进行转染，例如可采用磷酸钙转染法实施转染。在转染之前，可对所述荧光素酶慢病毒表达载体和包装质粒进行高纯度无内毒素抽提。因此，本发明也包括一种荧光素酶慢病毒载体表达系统，该表达系统含有本发明的荧光素酶慢病毒表达载体和包装质粒。经转染后，可收集慢病毒颗粒，用于感染癌细胞。癌细胞可来自各种癌症。在本申请中，尤其优选来自肝癌的细胞。更具体地，本申请优选来自肝癌患者门静脉癌栓的细胞。感染可采用本领域常规的技术实施。例如，可按照本发明“慢病毒感染靶细胞”部分所述的方法进行。因此，本发明也包括一种分离的癌细胞，该细胞被本发明的荧光素酶慢病毒表达载体感染并稳定表达荧光素酶。本发明还包括一种细胞培养物，含有本发明的细胞。在某些实施方式中，培养物中80%以上、优选90%以上的细胞为表达荧光素酶的阳性细胞。培养物中除细胞外，还可含有细胞培养基。在一个具体实施方式
中，使用普通高糖DMEM培养
基培养。在获得本发明分离的癌细胞后，可用其标记肿瘤组织。肿瘤组织可包括任意来源的肿瘤组织。但在优选的实施例中，肿瘤组织优选来自肝癌患者的肝组织。在一具体实施例中，本发明人将获得的肝癌临床组织样本一部分进行皮下移植； 另一部分进行原代细胞培养，用本发明的表达荧光素酶的慢病毒进行感染，得到本发明的分离的癌细胞。然后使用本发明的分离的癌细胞注射到前述同一组织来源的、皮下移植后已长成的皮下瘤块中(见“皮下移植瘤模型的构建”)，3周后，取出皮下肿瘤，剪成小块并用 IVIS Imaging System鉴定表达荧光素酶的阳性瘤块。由此可获得被荧光素酶标记的肿瘤组织。因此，本申请也包括一种分离的癌组织，这种癌组织含有本发明的细胞。在一具体实施例中，所述分离的癌组织按照标记肿瘤组织的方法获得。在一个具体实施方式
中，所述分离的癌组织能稳定表达荧光素酶。在一个具体实施方式
中，所述分离的癌组织是由本发明的分离的癌细胞长成。在另一具体实施例中，本发明的分离的癌组织可种植到实验动物的同源组织上，并能稳定传代。“同源组织”在本文中指同种类型及相对应解剖位置的组织。 例如，如果本发明的癌组织为肝癌组织，则可将其种植到动物的肝脏上。在进一步的实施例中，可将本发明的分离的癌组织种植于裸鼠同源组织上，继续培养并适时传代(见“原位移植肿瘤模型的构建”)。按照此法所得到的被rei2-Luc2成功标记的可传代的瘤块阳性率则可达到90%以上。因此，本发明也提供一种构建肿瘤转移模型的方法，该方法包括将本发明的成功标记的肿瘤组织(癌组织)原位移植到动物的器官上。所述模型为非人哺乳动物模型。在其它优选实施方式中，所述模型为小鼠模型。所述动物中被移植的器官优选是与所述肿瘤组织为同种组织，例如都为肝脏。在优选实施例中，所述小鼠模型为裸小鼠，即免疫缺陷型小鼠，对所植入的肿瘤组织基本不产生免疫反应。本发明因此也包括所述分离的癌细胞、细胞培养物、或分离的癌组织在构建肿瘤转移模型中的应用。具体而言，本发明也涉及所述分离的癌细胞、细胞培养物、或分离的癌组织在构建肿瘤转移模型中的用途，其中，所述肿瘤转移模型按本发明所述的构建肿瘤转移模型的方法构建。本发明也涉及所述分离的癌细胞或细胞培养物在标记肿瘤组织中的应用。具体而言，本发明也涉及所述分离的癌细胞或细胞培养物在标记肿瘤组织中的用途，其中，所述肿瘤组织按本发明所述的标记肿瘤组织的方法标记。以下将以具体实施例的方式对本发明进行描述。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的。除非另有说明，实施例中所使用到的方法、试剂、用量等均为本领域常规的技术。此夕卜，应理解，本发明所用术语“含有”、“包含”等也包括了“由……组成”、“由……构成”的含义。“分离的”在本文中指与其母体分开的、独立存在的细胞或组织。例如，分离的细胞指与其原本所存在的组织分开的细胞；分离的组织指与其原本存在的组织或动物体分开的组
幺口
/Ν ο一.材料与方法实验动物BALB/c-nu/nu雄性裸鼠由上海中科院斯莱克实验动物中心提供，雄性裸鼠在标准条件下饲养在 SPF(Specific Pathogen Free Condition)级条件，恒温 25_27°C，恒湿 45-50 %，置于层流超净架内，每个饲养笼内饲养5只裸小鼠。动物实验的操作严格遵守上海生命科学研究院的实验动物管理和使用指南，并得到了动物管理和使用委员会的批准。 在实验中主要使用4 8周龄的裸鼠，并根据具体实验要求进行选择。肝癌组织样本所有正常肝组织、原发性及门静脉转移的肝癌样本来自东方肝胆外科医院，所有的标本均保存于液氮中。本发明人的工作得到了中国科学院营养科学研究所的鉴审批准。细胞系AGS细胞购自ATCC。PVTT-I为本实验室和东方肝胆外科医院程树群教授合作建立的一株来源于肝癌患者门静脉癌栓的细胞系。
肝癌患者信息上海东方肝胆外科医院患者刘X (住院号115851)，男，60岁， 术前征得患者本人同意，签署了知情同意书。本发明人将术中切除的取自患者门静脉癌栓组织的样本，种植于裸鼠肝脏及皮下(腋窝、腹股沟)，如此连续传代(方法见“原位移植模型的构建”)。从该细胞的第5代移植瘤取材，进行原代细胞培养及“细胞岛”克隆扩大培养，成功培养出一株来源于人门静脉癌栓的细胞系PVTT-I (亦名为CSQT-2，见T Wang 等，British Journalof Cancer(2010) 102,1618-1626 ；Weixing GUO 等，Journal of ProteorneResearch 2010,9,4170-4175)。细胞在最初几代时生长速度不稳定，5-7代后，生长趋于稳定，约4天传一代，20代后，生长明显加速，每2天即可传代一次，至今已在体外稳定传至100代左右，时间约为1年。20代前使用DMEM/F12培养基培养，20代后则使用普通高糖DMEM培养基进行培养。试剂和仪器用于活体成像的仪器IVIS Imaging System，以及底物D-Luciferin均购自 Xenogen Biotechnology(Xenogen, Alameda, CA, USA)。质粒构建和转染本发明人将!Iomega公司的改良荧光素酶Luc2基因克隆入改造过的，以CMV启动子替换掉U6启动子的rei2慢病毒表达载体中，用于构建慢病毒表达系统。克隆的具体方法为，先将Luc2基因(SEQ ID NO 1)克隆入pCSCG载体(Miyoshi H et al, Development of a self-inactivating lentivirus vector. J Virol. 1998 ；72 8150-8157)中，所用引物为LuciCSCGF :5，-CATGCTAGCGCCACCATGGAAGATGCCAAAAAC-3，(SEQ IDNO 2).LuciCSCGR :5，-AACCTCGAGTTACACGGCGATCTTGCC-3，(SEQ ID NO :3)。然后，用BamHI和BioI切下带有CMV启动子及Luc2基因的片段，连入 pBS_hU6_l 载体(Qin XF et al, Inhibiting HIV-Iinfection in human T cellsby lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA againstCCR5, Proc Natl Acad Sci USA.，2003，100 (1) :183-8)中，最后，用 XbaI 和 XhoI 切下 CMV 启动子及 Luc2 基因片段，连入阳12(出处同上)载体中，从而得到了以CMV启动子替换掉TO启动子的 FG12-Luc2慢病毒表达载体。慢病毒载体包装及滴度测定慢病毒包装细胞为细胞，将rei2_Luc2慢病毒表达质粒及辅助包装载体质粒 (pRSVREV，pMDLg/pRRE和pHCMVG)进行高纯度无内毒素抽提，用磷酸钙转染法共转染细胞。转染他后更换为完全培养基，于24h及4 各收集一次富含慢病毒颗粒的细胞上清液，合并后先使用0. 45 μ m的滤膜过滤，再进行冷冻高速离心QOOOOrpm，140min)，然后用不含血清的培养基溶解病毒，将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，于-80°C保存。取其中1支进行病毒生物学滴度测定，方法为孔稀释法。慢病毒感染靶细胞将处于对数生长期的靶细胞进行胰蛋白酶消化，以合适的密度接种于3. 5cm盘中，37°C、5% CO2培养箱培养。18 20h后，根据所测定的滴度，加入适宜量的病毒，1 后观察细胞状态。如果没有明显的细胞毒性作用，继续培养24h后更换为含有10%胎牛血清的培养基；如果有明显的细胞毒性作用，立即更换培养基。感染2 3d后通过荧光显微镜观察rei2-Luc2慢病毒上报告基因GFP的表达情况，感染效率> 50 %的继续培养，感染效率 < 50%的则重新进行感染实验。当被感染的细胞达到一定数量后，通过GFP进行分选，得到阳性率更高的细胞(分选后，阳性率一般可以达到80% 90%以上)。将分选得到的细胞进行扩增，取一部分进行Luc值的体外测定，具体方法为在M孔板中进行铺种，1.0X105 细胞/ ？L，铺种三个复孔。第二天，待细胞贴壁后，测定Luc值，达到400万以上才可用于活体成像实验。低于该值的则进行重复感染，直至达标。荧光素酶标记肿瘤组织本发明人将获得的肝癌临床组织样本一部分进行皮下移植，另一部分进行原代细胞培养，使用rei2-Luc2病毒感染原代细胞(见“慢病毒感染靶细胞”)，然后将成功感染的细胞注射到同一组织来源的，已长成的皮下瘤块中(见“皮下移植瘤模型的构建”)，3周后， 取出皮下肿瘤，剪成小块并用IVIS ImagingSystem鉴定表达荧光素酶的阳性瘤块，再将其种植于裸鼠肝脏，继续培养并适时传代(见“原位移植肿瘤模型的构建”)。按照此法所得到的被荧光素酶成功标记的可传代的瘤块阳性率则可达到90%以上。体内成瘤实验对6周大的雄性裸鼠在身体两侧和/或背部进行皮下注射，每一处注射个肝癌细胞。每隔四到五天，使用游标卡尺测量生成的肿瘤，其体积(cm3)使用标准公式“长 χ宽χ高χ 0.5236”进行计算。最后，麻醉并处死动物取出皮下肿瘤。皮下移植瘤模型的构建(1)将手术切除的标本用D-Hank’ s冲洗干净，剔除纤维组织和血污，取鲜鱼肉状即活力强的部位剪成1 2mm3大小碎块，备用。O) 6%的水合三氯乙醛按100uL/20g小鼠的剂量对实验小鼠进行麻醉。(3)裸鼠腋窝和大腿腹股沟侧用碘酒、酒精皮肤消毒，切开皮肤，将新鲜的肝癌组织或者癌栓组织碎块包埋到皮下后缝合皮肤，一只裸鼠种植四个点双侧腋窝及腹股沟。(4)待裸鼠苏醒后放回笼子。(5)术后观察裸鼠2次/日，皮下移植瘤长至直径为1. 0-1. 2cm左右时取出，去除坏死组织，剪切成约1. O 2. Omm3大小，种植于裸鼠的双侧腋窝及腹股沟，按照此法进行传代，每次使用3-4只裸鼠。原位移植肿瘤模型的构建采用完整组织块原位移植法(SurgicalOrthotopic Implantation ofHistologically Intact Tumor Tissue, SOI)。具体步骤包括(1)脱颈处死稳定传代的皮下荷瘤裸鼠，用碘酒、酒精皮肤消毒，取出皮下肿瘤。(2)将皮下肿瘤立即浸入含青霉素、链霉素各100U/ml的培养基中。剔除周围结缔组织，取肿瘤生长旺盛的部分，剪成约1. 0 2. Omm3大小碎块，备用。(3)用6%的水合三氯乙醛按100uL/20g小鼠的剂量对实验小鼠进行麻醉后，碘酒、酒精皮肤消毒，0.5%碘伏消毒，取左上腹横切口约1.5厘米，进入腹腔暴露肝左叶。先用8/0丝线穿过肝脏行8字缝合准备，然后用手术刀于丝线之间的肝包膜上戳一小孔，生理盐水纱布按压片刻止血，将肿瘤组织小块移植于肝包膜下，将8字缝合线拉紧固定，彻底止血后逐层关腹。(4)待裸鼠苏醒后放回饲养的笼子。
(5)观察指标主要包括肝脏、肺脏、腹腔的转移瘤，肝脏病理切片观察有无门静脉癌栓的形成。荧光素酶标记的小鼠原位肝癌移植模型本发明人将成功标记荧光素酶的瘤块(见“荧光素酶标记肿瘤组织”)，种植于6周龄的雄性裸鼠的肝叶上，继续培养并适时传代(见“原位移植肿瘤模型的构建”)。经过原位肝移植手术的小鼠存活率在95%以上，传代成功率为100%，每一次使用4-6只裸鼠进行皮下及肝包膜下原位移植传代，目前与PVTT-I细胞同一组织来源的瘤块已经稳定传至第17 代。按照此法经过持续传代扩增和筛选，即得到荧光素酶标记的小鼠原位肝癌移植模型。二.实验结果实施例1 荧光素酶的慢病毒载体表达系统的构建和一般的质粒转染方法相比，慢病毒表达系统有转染效率高、整合稳定、表达持续的优势，因此本发明人构建了荧光素酶的慢病毒载体表达系统。本发明人将本实验室的 rei2载体中的TO启动子换为适用于真核表达的CMV启动子，再将改良的荧光素酶报告基因(Luc2)插入，置于CMV启动子之后，同时保持原来的GFP报告基因模块不变，即得到共表达GFP和荧光素酶的FG12慢病毒载体。通过与相应的包装质粒共转染细胞，收取细胞培养上清并纯化浓缩，便可得到高滴度的病毒颗粒，用于体内外标记实验，所感染的细胞 (图1)显示出极强的荧光素酶活性。实施例2 高效的荧光素酶标记肿瘤组织的方法的建立在慢病毒表达系统构建完成后，本发明人对肝癌组织进行了标记。长期以来，肿瘤组织的活体标记一直是一个公认的难题，可供参考的相关文献十分有限，一些已有的报道如电转法等所取得的效果也并不理想。经过多次尝试和优化，本发明人建立起了较为高效的标记方法(见“材料与方法”)。实验数据表明，使用这种方法，能有效的感染肿瘤组织块中的大部分细胞，阳性率可达90%以上。并且，成功感染的瘤块可以在裸鼠体内(包括皮下和肝原位)继续生长，成为研究体内肿瘤生长，恶化，以及迁移的良好模型(图2)。图2显示了标记有荧光素酶的PVTT-I原位移植瘤的生长情况。被rei2_Luc2慢病毒成功感染的PVTT-I细胞先被注射至裸鼠皮下先前形成的同一组织来源的瘤块(见“材料与方法”中的“荧光素酶标记肿瘤组织”)中。3周后，长大的皮下瘤块被取下，剪成小块，经IVIS Imaging System鉴定的阳性瘤块种植至新鲜裸鼠的肝脏。通过IVIS Imaging System，本发明人监测了该原位移植肿瘤在裸鼠体内生长及转移的情况。实施例3 建立起人肝癌原位移植的裸鼠模型本发明人将肝癌的新鲜样本，及时种植到裸鼠的肝脏上，建立起人肝癌原位移植的裸鼠模型。相比于由体外细胞系产生的肝癌模型，基于病人肿瘤组织的肝癌模型更接近肿瘤的体内生理状态。在本发明人所构建的肝癌模型中，所用的样本来自恶性程度较高的肝癌组织，其中一个重要特征是患者发生了肝癌细胞的肝门静脉转移。因此，这一肝癌模型包含了来自原发灶以及相应门静脉癌栓，可发生血管内转移的肝癌组织，显示出极强的转移能力，为研究肝癌的转移提供了理想的模型(图3)。实施例4 建立活体成像的原位移植肝癌转移模型在得到成功标记荧光素酶的肝癌组织后，本发明人对裸鼠进行肝原位移植，将被标记的肝癌组织块接种到裸鼠的肝脏内。基于荧光素酶的标记，本发明人可以通过Xenogen公司的IVIS Imaging System实时监测原位癌组织的生长情况，同时，还可以监测肝癌的转移以及转移灶的生长情况。当瘤块在裸鼠体内发生转移后，将转移灶利用荧光素酶进行定位并分离，接种于另一只裸鼠的肝脏内，利用IVIS Imaging System进行肿瘤转移的监测和筛选。通过这样连续的体内传代和筛选，得到一系列具有不同转移能力的原位移植肝癌转移模型小鼠(图4)。 虽然上文以具体实施方式
的形式对本申请进行了描述，但应理解，这些实施例仅仅是阐述性的。在不偏离本申请精神的情况下，本领域技术人员可对本发明做出各种改动。 这些改动都在本申请的保护范围之内。
权利要求
1. 一种荧光素酶慢病毒表达载体，其特征在于，该表达载体以rei2载体为骨架构建， 含有CMV启动子及荧光素酶基因。
2.如权利要求1所述的荧光素酶慢病毒表达载体，其特征在于，所述荧光素酶基因的序列如SEQ ID NO 1所示。
3.一种荧光素酶慢病毒载体表达系统，其特征在于，该表达系统含有权利要求1或2所述的荧光素酶慢病毒表达载体和包装质粒。
4.一种分离的癌细胞，其特征在于，该细胞被权利要求1或2所述的荧光素酶慢病毒表达载体感染并稳定表达荧光素酶。
5.一种细胞培养物，其特征在于，该培养物含有权利要求4所述的癌细胞。
6.如权利要求5所述的细胞培养物，其特征在于，培养物中80%以上的细胞为表达荧光素酶的阳性细胞。
7.一种分离的癌组织，其特征在于，所述癌组织含有权利要求4所述的癌细胞。
8.—种标记肿瘤组织的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求4所述的分离的癌细胞注射到由其来源与所述分离的癌细胞的来源相同的肿瘤组织皮下移植生长形成的瘤块中，并允许表达荧光素酶的癌细胞生长增殖成为被荧光素酶成功标记的肿瘤组织。
9.一种构建肿瘤转移模型的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求7所述的癌组织移植到该动物模型的同源组织中，从而构建得到原位移植的肿瘤转移模型。
10.权利要求4所述的分离的癌细胞、权利要求5所述的细胞培养物在标记肿瘤组织中的应用；或权利要求4所述的分离的癌细胞、权利要求5所述的细胞培养物、或权利要求 7所述的分离的癌组织在构建原位移植的肿瘤转移模型中的应用。
全文摘要
本发明涉及荧光素酶的慢病毒载体表达系统及其用途。具体而言，本发明成功构建了以FG12-Luc2为核心质粒的荧光素酶慢病毒表达系统，并使用该系统建立了来自肝癌患者癌栓组织的PVTT-1细胞系。通过该慢病毒表达系统，成功标记了肝癌组织，并通过皮下移植瘤，原位肝癌移植等实验方法，建立了可进行持续传代，用于活体成像，可以实时监测肿瘤在体内的生长及转移情况的小鼠原位移植肝癌转移模型。
文档编号C12N15/52GK102477445SQ20101055548
公开日2012年5月30日 申请日期2010年11月23日 优先权日2010年11月23日
发明者冯宇雄, 李晶晶, 程树群, 谢东 申请人:中国科学院上海生命科学研究院