基因治疗载体和胞嘧啶脱氨酶的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2009年9月26日，发明名称为"基因治疗载体和胞嘧啶 脱氨酶"、PCT国际专利申请PCT/US2009/058510进入中国国家阶段的中国专利申请号 200980147509. 6的分案申请。
[0002] 与相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求于2008年9月26提出的美国临时申请系列号61/100, 666、于2008年 12月8日提出的美国临时申请系列号61/120,618和于2009年6月13日提出的美国临时 申请系列号61/186, 823的优先权，它们的公开内容通过引用并入本文。
技术领域
[0004] 本公开涉及修饰的胞嘧啶脱氨酶（⑶）。本公开还涉及表达此类修饰⑶的细胞和 使用此类修饰CD治疗疾病和病症的方法。
【背景技术】
[0005] 酵母或细菌胞嘧啶脱氨酶将无毒性的抗生素前体药物5-FC转变成细胞毒性的化 学治疗剂5-氟尿嘧啶（5-FU)。尚不知晓人（一般而言，哺乳动物）具有编码具有显著胞嘧 啶脱氨酶活性的酶的天然存在基因。酵母和细菌胞嘧啶脱氨酶在使用基因递送和病毒载体 用于递送酶、然后用5-FC治疗的癌症治疗中得到认可，其中5-FC然后被酶转变成细胞毒性 药物（Miller等，CanRes62:773-780 2002;Kievit等，CanRes59:1417-1421 1999)〇
【发明内容】
[0006] 本文提供将5-FC转变成5-FU的多肽。还提供编码此类多肽的核酸分子、表达此 类多肽的细胞、包含此类多核苷酸和多肽的载体以及适宜地使用此类多肽合成5-FU或其 衍生物的方法。因此，在多个实施方案中，提供了包含具有SEQIDN0 :2所示序列的胞嘧啶 脱氨酶的分离的或重组的多肽。在其它实施方案中，多肽包含具有选自A23L、V108I、I140L 及其任何组合的突变的SEQIDNO:2。在又一实施方案中，多肽包含SEQIDNO:4中所示 序列并且包括除残基：（a) 23、108和140之外的可达50、25、10或5个保守氨基酸取代。通 常，本文提供的多肽表现出用于将5-FC转变成5-FU的胞嘧啶脱氨酶活性。
[0007] 本公开还提供包含与SEQIDN0 :4至少80%、90%、95%、98%或99%相同的序列 的多肽，其中多肽在第23位具有亮氨酸，在第108位具有异亮氨酸并且在第140位具有亮 氨酸，并且其中多肽具有胞嘧啶脱氨酶活性。在又一实施方案中，多肽包含SEQIDN0 :4中 所示序列。
[0008] 本公开还提供包含可操作连接至尿嘧啶磷酸核糖基转移酶（UPRT)或乳清酸磷酸 核糖基转移酶（0PRT)的任何一种前述多肽的融合构建体。在一个实施方案中，融合构建 体包含连接至具有UPRT或0PRT活性的第二多肽的第一多肽，所述第一多肽包含具有选自 A23L、V108I、I140L及其任何组合的突变的SEQIDN0:2。在又一实施方案中，融合构建 体包含具有SEQIDN0 :4中所示序列的第一多肽并且包括除残基23、108和140之外可达 50、25、10或5个保守氨基酸取代，其中第一多肽连接至具有UPRT或OPRT活性的第二多肽。 本公开还提供融合构建体，其包含具有胞嘧啶脱氨酶活性并且含有与SEQIDNO:4至少 80%、90 %、95 %、98 %或99%相同的序列的第一多肽，其中该多肽在第23位具有亮氨酸， 在第108位具有异亮氨酸并且在第140位具有亮氨酸，并且其中第一多肽连接至包含UPRT 或0PRT活性的第二多肽。在一个实施方案中，具有UPRT或0PRT活性的多肽包含分别在 SEQIDNO:8和10中所示序列或其变体。在又一实施方案中，包含胞嘧啶脱氨酶活性的第 一多肽连接至具有UPRT或0PRT活性的多肽，其中多肽通过肽连接体分开。在另一实施方 案中，融合构建体包含选自SEQIDNO:12、14、16或18的序列。
[0009] 本公开还提供编码任何前述多肽的多核苷酸。例如，本公开提供多核苷酸，所述 多核苷酸编码包含具有选自A23L、V108I、I140L及其任何组合的突变的SEQIDN0:2的多 肽。在又一实施方案中，多核苷酸编码包含SEQIDNO:4所示序列的多肽并且包括除残基： (a) 23、108和140外可达50、25、10或5个保守氨基酸取代。在进一步的实施方案中，本公开 提供多核苷酸，所述多核苷酸编码包含与SEQIDN0:4至少80%、90%、95%、98 %或99 % 相同的序列的多肽，其中多肽在第23位具有亮氨酸，在第108位具有异亮氨酸并且在第140 位具有亮氨酸，并且其中多肽具有胞嘧啶脱氨酶活性。在又一实施方案中，多核苷酸编码包 含SEQIDN0:4的多肽。在又一实施方案中，多核苷酸编码包含SEQIDN0:4、6、8、10、ll、 12或13所示序列的多肽。
[0010] 本公开提供编码胞嘧啶脱氨酶的人密码子优化的多核苷酸。在一个实施方案中， 人密码子优化的多核苷酸包含SEQIDN0 :3所示序列。在又一实施方案中，多核苷酸包含SEQIDN0 :5、7或9所示序列。
[0011] 在其它实施方案中，本公开的胞嘧啶脱氨酶或融合构建体使用基因递送系统 (GDS)递送。在另一方面中，编码胞嘧啶脱氨酶的多核苷酸使用其为病毒或病毒衍生载体的 GDS递送。病毒载体可以是复制型或者非复制型，并且可以是腺病毒载体、麻疹病毒载体、 疱疹病毒载体、反转录病毒载体（包括慢病毒载体）、弹状病毒载体例如水泡性口炎病毒载 体、呼肠孤病毒载体、矽尼卡谷病毒载体、痘病毒载体（包括动物疹或痘病毒衍生的载体）、 细小病毒属载体（包括AAV载体）、甲病毒属载体或本领域技术人员已知的其它病毒载体。 在一个实施方案中，病毒载体可以是能感染正在复制的哺乳动物细胞的可复制型反转录病 毒载体。可复制型反转录病毒载体可以包括正反转录病毒（Orthoretrovirus)或更有代表 性的γ反转录病毒载体。在一个方面中，可复制型反转录病毒载体包含在编码本公开胞嘧 啶脱氨酶的多核苷酸5'端的内部核糖体进入位点（IRES)。在一个实施方案中，编码胞嘧啶 脱氨酶的多核苷酸在反转录病毒载体ENV多核苷酸的3'端。
[0012] 在其它实施方案中，提供用本公开的胞嘧啶脱氨酶或融合构建体或者包括本公开 多核苷酸或融合构建体的载体转染的宿主细胞。宿主细胞包括真核细胞，例如酵母细胞、昆 虫细胞或动物细胞。宿主细胞还包括原核细胞，例如细菌细胞。
[0013] 本公开还提供治疗细胞增殖性病症（包括癌症）的方法，包括向受试者施用本公 开的多核苷酸或多肽和使受试者接触包含5-氟胞嘧啶（5-FC)的细胞毒性药物。
[0014] 本公开提供重组的可复制型反转录病毒（RCR)，包含：反转录病毒GAG蛋白；反转 录病毒P0L蛋白；反转录病毒包膜；包含位于反转录病毒多核苷酸序列3'端的长末端重复 (LTR)序列、位于反转录病毒多核苷酸5'端的启动子序列、gag核酸结构域、pol核酸结构 域和env核酸结构域的反转录病毒多核苷酸，所述启动子适宜于在哺乳动物细胞中表达； 包含可操作连接至异源多核苷酸的内部核糖体进入位点（IRES)的盒，其中盒位于3'LTR的 5'端并且位于编码反转录病毒包膜的env核酸结构域的3'端；和在靶细胞内进行反转录、 包装和整合必需的顺式作用序列，其中与PACE载体（SEQIDNO:21)相比，RCR在6次传代 后保持了较高的复制能力。在一个实施方案中，反转录病毒多核苷酸序列衍生自鼠白血病 病毒（MLV)、莫洛尼鼠白血病病毒（MoMLV)、猫科白血病病毒或长臂猿白血病病毒（GALV)。 在另一实施方案中，MLV是双嗜性MLV。在又一实施方案中，反转录病毒是致癌反转录病毒。 在又一实施方案中，靶细胞是具有细胞增殖性病症的细胞。细胞增殖性病症可以选自，但 不限于，肺癌、结肠-直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、泌尿道癌、子宫癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、 黑素瘤、胃癌和卵巢癌、类风湿性关节炎和其它自身免疫病。在一个实施方案中，启动子包 括具有SEQIDN0:19、20或22的从核苷酸1至大约核苷酸582所示序列的CMV启动子 并且可包括对一个或更多个核酸碱基的修饰，所述启动子能够指导和起始转录。在仍然进 一步的实施方案中，启动子包含SEQIDNO:19、20或22从核苷酸1至大约核苷酸582所 示序列。在又一实施方案中，启动子包含CMV-R-U5结构域多核苷酸。在一个实施方案中， CMV-R-U5结构域包含连接至MLVR-U5区的人巨细胞病毒立即早期启动子。在又一实施方 案中，CMV-R-U5结构域多核苷酸包含SEQIDNO:19、20或22从大约核苷酸1至大约核苷 酸1202所示序列或者与SEQIDNO:19、20或22所示序列至少95%相同的序列，其中多核 苷酸促进与其可操作连接的核酸分子的转录。在另一实施方案中，所述多核苷酸的gag和 pol衍生自致癌反转录病毒。gag核酸结构域可包含SEQIDNO:19从大约核苷酸1203至 大约核苷酸2819的序列或者与其具有至少95%、98%、99%或99. 8%同一性的序列。pol 结构域可包含SEQIDNO:19从大约核苷酸2820至大约核苷酸6358的序列或与其具有至 少95%、98%、99%或99. 9%同一性的序列。在一个实施方案中，env结构域编码两性env 蛋白质。env结构域可包含SEQIDNO:19从大约核苷酸6359至大约核苷酸8323的序列 或与其具有至少95%、98%、99 %或99. 8 %同一性的序列。载体的IRES结构域可以是任何 IRES，然而，在一个实施方案中，IRES衍生自脑心肌炎病毒。在又一实施方案中，IRES包含 SEQIDN0:19从大约核苷酸8327至大约核苷酸8876的序列或与其具有至少95%、98%或 99%同一性的序列。在仍然进一步的实施方案中，异源多核苷酸包括具有SEQIDNO:3、5、 11、13、15或17所示序列的多核苷酸。在又一实施方案中，异源序列编码包含SEQIDNO:4 所示序列的多肽。异源核酸是人密码子优化的并且编码如SEQIDNO:4中所示多肽。在又 一实施方案中，异源核酸包含SEQIDNO:19从大约核苷酸8877至大约9353所示序列。在 一个实施方案中，3'LTR衍生自致癌反转录病毒。在又一实施方案中，3'LTR包含U3-R-U5 结构域。在仍然进一步的实施方案中，3'LTR包含SEQIDNO: 19从大约核苷酸9405至大 约9998所示序列或与其至少95%、98%或99. 5%相同的序列。
[0015] 本公开提供包含SEQIDN0 :19、20或22所示序列的多核苷酸。
[0016] 本公开提供分离的多核苷酸，从5'至3'包含：人巨细胞病毒立即早期启动子与 MLVR-U5区的CMV-R-U5融合物；PBS，对于反转录酶的引物结合位点；5'剪接位点；Φ包装 信号；MLV组特异性抗原的gag编码序列；MLV聚合酶多蛋白的pol编码序列；3'剪接位点； MLV株4070A包膜蛋白的4070Aenv编码序列；来自脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点 (IRES);修饰的胞嘧啶脱氨酶编码序列；多嘌呤段；和U3-R-U5MLV长末端重复。
[0017] 本公开提供治疗患有细胞增殖性病症的受试者的方法，包括使受试者与具有胞 嘧啶脱氨酶活性的本公开多肽的多核苷酸在多核苷酸表达的条件下接触，和使受试者与 5_氟胞嘧啶接触。
[0018] 本公开还提供治疗受试者中细胞增殖性病症的方法，包括使受试者与本公开的反 转录病毒接触，其中异源核酸序列编码抑制赘生性细胞增殖的治疗蛋白质。在一个实施方 案中，反转录病毒包含编码具有SEQIDN0 :4、12、14、16或18所示序列的多肽的多核苷酸。
[0019] 本公开的一个或更多个实施方案的细节在附图和下面的说明书中描述。根据说明 书和附图以及根据权利要求书，其它特征、目的和优点将是显而易见的。
【附图说明】
[0020] 图1A-D显示（a)本公开重组反转录病毒载体的示意图；(b)本公开多核苷酸的质 粒图谱；（c和d)本公开的多核苷酸的序列（SEQIDN0 :19)。
[0021] 图2A-D显示包含具有⑶、0PRT和UPRT活性的多肽的本公开各个实施方案产生的 方案。
[0022] 图3显示观察到与感染的U-87细胞内野生型y⑶蛋白相比y⑶2蛋白水平更高。
[0023] 图4显示包含本公开CD多肽的载体的稳定性和与本公开的其它载体的比较。
[0024] 图5A-B显示，当感染的细胞暴露于增加水平的5-FC时，与野生型y⑶活性 (T5. 0007)相比，本公开的胞嘧啶脱氨酶活性和载体提供相当的或更好的表达，并且因此杀 死感染的大鼠RG2 (5A)或U87细胞（5B)。
[0025] 图6显示感染的U87细胞内T5. 0002 (yCD2)的比活性高于T5. 0001 (部分优化的 yCD)，T5. 0001 高于T5. 0007 (野生型yCD)。
[0026] 不同图中相同参考符号表不着相同的元素。
【具体实施方式】
[0027] 如本文和后附权利要求书中所使用，单数形式"一（a) "、"一（an) "和"该（the) " 包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。因此，例如，当提到"一细胞（acell)"时包括 多数的此类细胞并且当提到"该试剂（theagent)"时包括提到本领域技术人员已知的一种 或多种试剂，等等。
[0028] 同样，"或"的使用意思是指"和/或"，除非另外说明。类似地，"包含/包括（com prise,comprises,comprising) "、"包括（includes,including) "可互换并且不旨在是限制 性的。
[0029] 还应当进一步理解，当使用术语"包含/包括"描述各种实施方案时，本领域技术 人员将理解在一些特别情况下实施方案可选地使用语言"基本上由……组成"或"由……组 成"描述。
[0030] 除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域普通技 术人员通常理解相同的含义。虽然与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料 可以用于实施所公开的方法和组合物，但是本文描述示例性的方法、装置和材料。
[0031] 上面以及本文通篇所讨论的出版物被提供，原因仅仅在于它们的公开先于本申请 的提交日。但无论如何不能解释为承认发明人因在先公开而无权占先于此类公开。
[0032] 胞嘧啶脱氨酶（EC3. 5. 4. 1)是催化下列化学反应的酶：
[0033] 胞嘧啶+H20 -尿嘧啶+NH3
[0034] 因此，该酶的两个底物是胞嘧啶和H20,而其两个产物是尿嘧啶和NH3。该酶属于水 解酶家族，这些酶作用于肽键之外的碳-氮键，特别是环脒中的碳-氮键。该酶类的系统名 称是胞嘧啶氨基水解酶。该酶也叫作异胞嘧啶脱氨酶。该酶参与嘧啶代谢。
[0035] 更加具体而言，胞嘧啶脱氨酶是参与嘧啶代谢途径的酶，通过该酶外源胞嘧啶 经水解脱氨基作用转化成尿嘧啶。了胞嘧啶脱氨酶（CD酶或CD)活性已经展示于原 核生物和低等真核生物中，但是它们在哺乳动物中缺乏（Koechlin等，1966，Biochem. Pharmacol. 15,435_446;Polak等，1976，Chemotherapy22，137_153)。分别编码酿酒酵 母和大肠杆菌两种生物⑶酶的酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae，S.cerevisiae) FCY1基因和大肠杆菌（E.coli)coda基因是已知的并且它们的序列已经公布（EP402 108 ; Erbs等，1997,Curr.Genet. 31，1-6 ;W0 93/01281)。CD酶也将胞嘧啶类似物 5-氟胞嘧 啶（5-FC)脱氨成为5-氟尿嘧啶（5-FU)，其是高度细胞毒性的化合物，特别是当其被转 变成5-氟-UMP(5-FUMP)时。因为编码该酶的基因的钝化突变或者因为该酶天然缺乏 (例如哺乳动物细胞）而缺乏CD酶活性的细胞对5-FC有抗性（Jund和Lacroute，1970， J.Bacteriol. 102,607-615;Kilstrup等，1989,J.Bacteriol.，171，2124-2127)。另一方 面，已经证明可以将5-FC敏感性传递给已经转移入编码CD酶活性的序列的哺乳动物细胞 (Huber等，1993，CancerRes. 53,4619_4626;Mullen等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,33-37 ;W0 93/01281)。因此，⑶的使用在基因治疗、特别是抗癌基因治疗情况下是有利 的。
[0036] 然而，5-FC敏感性取决于细胞系而极大不同。在例如以表达大肠杆菌coda基因的 反转录病毒转导的PANC-1 (胰腺的癌）和SK-BR-3 (乳腺癌）人肿瘤细胞系中观察到低敏感 性（Harris等，1994，GeneTherapy1，170-175)。该现象被解释为由⑶酶的酶作用所形成 的5-FU向细胞毒性5-FUMP的内源转变缺乏或差。在哺乳动物细胞中正常由乳清酸磷酸核 糖基转移酶（0PRT酶）实现的这一步骤可能在某些肿瘤中缺乏并且因此使得基于CD酶的 基因治疗无效。在原核生物和低等真核生物中，通过尿嘧啶磷酸核糖基转移酶的作用（UPRT 酶活性）尿嘧啶被转变成UMP。该酶也将5-FU转变成5-FUMP。重要的是，细菌尿嘧啶磷酸 核糖基转移酶（UPRT)与哺乳动物细胞的乳清酸磷酸核糖基转移酶（0PRT)或尿苷-5'-一 磷酸合酶功能等效。这些酶介导5-氟尿嘧啶（5-FU)(尿嘧啶的氟化类似物）向5-氟尿 苷5' 一磷酸（5-FUMP)的转变。5-氟尿苷5' 一磷酸之后通过哺乳动物嘧啶从头合成途径 被转变成5-FdUDP和FdUTP。每一 5-FdUTP是胸苷酸合酶（Thy-A)的不可逆抑制剂并且导 致dTTP饥饿。广泛公认的是，这种转变是实现5-氟尿嘧啶的细胞毒性作用必需途径之一 并且细菌来源的细菌尿嘧啶磷酸核糖基转移酶能够向哺乳动物乳清酸磷酸核糖转移酶一 样将5-氟尿嘧啶转变成相同的活性代谢物。在UPRT酶活性或0PRT酶活性缺乏情况下，源 于5-FC被⑶酶的脱氨作用产生的5-FU不被转变成细胞毒性的5-FUMP(Jund和Lacroute， 1970,J.Bacteriol. 102,607-615) 〇
[0037] 如本文所述，本公开提供编码多肽的多核苷酸和包含具有胞嘧啶脱氨酶活性的第 一多肽与包含UPRT或0PRT活性的第二多肽融合的多肽。此种融合构建体可用于将尿嘧啶 或其衍生物转变成一磷酸类似物，并且具体而言将5-FU转变成5-FUMP。
[0038] 如将在下面更加详细地描述，本公开至少部分地基于催化5-FC转变成5-FU的 新的多肽的产生和表达。在一个实施方案中，提供了已经被工程改造而具有将5-FC转变 成5-FU的改良催化特性的新多肽。此种多肽包括已经被改变成在指定残基处包括氨基酸 取代的变体。虽然这些变体将在下面更加详细地描述，但是应当理解，本公开的多肽可包 含一个或更多个修饰的氨基酸。修饰的氨基酸的存在将在例如（a)增加多肽体内半寿期， (b)降低或增加多肽抗原性，和（c)增加多肽保存稳定性中是有利的。一个或多个氨基酸 通过例如重组产生过程中的共翻译或者翻译后修饰（例如在哺乳动物细胞中在表达过程 中N-X-S/T基序处的N-连接糖基化）或者通过合成手段修饰。因此，"突变体"、"变体" 或者"修饰的"蛋白质、酶、多核苷酸、基因或者细胞意思是指已经被改变或衍生，或者以一 定方式与亲本蛋白质、酶、多核苷酸、基因或者细胞不同或者改变的蛋白质、酶、多核苷酸、 基因或细胞。突变体或修饰的蛋白质或酶通常，虽然不是必须，从突变体多核苷酸或基因表 达。
[0039] "突变"意思是指产生突变体蛋白质、酶、多核苷酸、基因或细胞的任何过程或者机 制。这包括其中蛋白质、酶、多核苷酸或基因序列被改变的任何突变，和源于此突变的在细 胞中的任何可检测的改变。有代表性地，突变以单个或多个核苷酸残基的点突变、缺失或插 入出现在多核苷酸或者基因序列中。突变包括基因的蛋白质编码区内出现的多核苷酸改变 以及蛋白质编码区序列外的区域（例如但不限于调节序列或启动子序列）的改变。基因中 的突变可以是"沉默的"，即不反映在表达时的氨基酸改变，产生基因的"序列保守"变体。这 通常在一个氨基酸对应于一个以上密码子时发生。
[0040] 修饰的氨基酸的非限定性实例包括糖基化氨基酸、硫酸化氨基酸、异戊二烯化 (例如法呢基化、栊牛儿基栊牛儿基化）氨基酸、乙酰化氨基酸、酰化氨基酸、聚乙二醇化 氨基酸、生物素化氨基酸、羧化氨基酸、磷酸化氨基酸，等等。足以指导技术人员修饰氨基 酸的参考文献在文献中到处都是。实例方案存在于Walker(1998)ProteinProtocolson CD-ROM(HumanaPress，Towata，N.J.)中。
[0041] 本文描述了用于产生、分离和使用本公开的修饰的⑶多肽和多核苷酸的重组方 法。除了重组生产外，多肽可以通过使用固相技术的直接肽合成（例如，Stewart等（1969) Solid-PhasePeptideSynthesis(WHFreemanCo,SanFrancisco)jPMerrifield(1963) J.Am.Chem.Soc.85 :2149-2154)产生。肽合成可以使用手工技术开展或者自动开展。自 动合成可以使用例如AppliedBiosystems431 肽合成仪（PerkinElmer，FosterCity， Calif.)按照制造商提供的说明书实现。
[0042]通过例证方式，编码大肠杆菌（Anderson等，1992，Eur.J.Biochem204, 51-56)、 乳酸链球菌（Lactococcuslactis)(Martinussen和Hammer，1994，J.Bacteriol. 176， 6457-6463)、牛分枝杆菌（Mycobacteriumbovis)(Kim等，1997，BiochemMol.Biol. Int41，1117-1124)和枯草芽抱杆菌（Bacillussubtilis)(Martinussen等，1995， J.Bacteriol. 177,271-274)UPRT酶的核酸序列可以在本公开背景中使用。然而，使用酵母 UPRT酶，并且特别是由酿酒酵母FUR1基因编码的UPRT酶，其序列公开于Kern等（1990， Gene88,149-157)中，通过引用整合入本文。通过明示方式，基因的序列和相应UPRT酶的 那些序列可以在文献中和专门的数据库（SWISSPR0T，EMBL，GenbankMedline，等）中找到。 [0043] 在本文中互换使用的术语"蛋白质"或"多肽"包含称作氨基酸的化学结构块通过 称作肽键的化学键连接在一起的一个链或更多个链。"酶"意思是指尤其是或多或少催化或 促进一种或更多种化学或生物化学反应的任何物质，优选全部或大部分由蛋白质组成。术 语"酶"还可指催化多核苷酸（例如RNA或DNA)。"天然"或"野生型"蛋白质、酶、多核苷 酸、基因或细胞意思是指天然存在的蛋白质、酶、多核苷酸、基因或细胞。
[0044] 因此，在几个实施方案中，提供分离的或重组的多肽，其包含具有选自A23L、 V108I、I140L及其任何组合的突变的SE