一种水稻种子背侧糊粉层特异表达的启动子p-myblike02及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种水稻种子背侧糊粉层特异表达的启动子 P-MYBLIKE02及其应用。
【背景技术】
[0002] 启动子是一种能够精确调控基因表达的顺式作用元件，它通常是位于结构基因5' 端的DNA序列。高等植物启动子一般由两部分组成：即核心启动子区域和决定基因转录特 异性和活性的区域。核心启动子区域是能够实现转录起始的最短启动子片段，包括转录起 始点及邻近的TATA框；决定基因转录特异性和活性的区域则是由多个保守序列组成，用于 结合特异的反式作用因子以实现基因在特定的组织、发育阶段以及环境条件下表达。由于 启动子是调控基因表达的"开关"，所以针对启动子的研究主要集中在如何利用这个"开关" 来调节目的基因的表达而实现它在生产和生活中的应用价值。在植物基因工程发展的30 年以来，组成型启动子得到了普遍的应用。但是持续、泛在及高效的表达某个目的基因会造 成受体植物生长不良或者产生能量的浪费，更甚者产生共抑制的现象。所以组织、器官特异 型或诱导型启动子的挖掘对于解决组成型启动子带来的负面问题起着十分重要的作用。
[0003] 果实和种子是储存营养物质的重要器官，是人们的生产和生活中重要能源的来 源。探索果实和种子特异表达的启动子不仅可以改善和提高果实和种子的品质还可以利 用这个"生物反应器"来表达所人们所需要的稀有氨基酸、维生素和必需氨基酸。水稻作为 重要的粮食作物之一，其种子尤其是胚乳是人们食物的重要来源，挖掘在水稻胚乳中特异 表达的启动子有着十分重要的生产意义。水稻胚乳包括淀粉胚乳和糊粉层，淀粉胚乳中累 积了大量的淀粉，目前在水稻中已经克隆了很多淀粉胚乳中特异表达的启动子，包括水稻 16kDa醇溶蛋白基因启动子；水稻26kDa的球蛋白启动子；过敏蛋白RA5基因0s07gll510的 启动子等。糊粉层是胚乳细胞分化过程中形成的累积蛋白质、脂肪酸、铁、锌、维生素B1等 营养成分位于淀粉胚乳外侧的活细胞，通过糊粉层特异性启动子将外源基因导入糊粉层从 而改善稻米品质具有重要的实际意义。因此，寻找具有糊粉层表达特性的启动子或其相关 调控序列具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一个目的是提供一种DNA片段。
[0005] 本发明提供的DNA片段为如下1) -3)中任一所述的DNA分子：
[0006] 1)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0007] 2)在严格条件下与1)所述DNA分子杂交且具有启动子功能的DNA分子；
[0008] 3)与1)中所述DNA分子具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。
[0009] 本发明的第二个目的是提供与上述DNA分子相关的生物材料。
[0010] 本发明提供的与上述DNA分子相关的生物材料为下述A1)至A19)中的任一种：
[0011] A1)含有上述DNA分子的表达盒；
[0012] A2)含有上述DNA分子的重组载体；
[0013] A3)含有A1)所述表达盒的重组载体；
[0014] A4)含有上述DNA分子的重组微生物；
[0015] A5)含有A1)所述表达盒的重组微生物；
[0016] A6)含有A2)所述重组载体的重组微生物；
[0017] A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
[0018] A8)含有上述DNA分子的转基因植物细胞系；
[0019] A9)含有A1)所述表达盒的转基因植物细胞系；
[0020] A10)含有A2)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0021] All)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0022] A12)含有上述DNA分子的转基因植物组织；
[0023] A13)含有A1)所述表达盒的转基因植物组织；
[0024] A14)含有A2)所述重组载体的转基因植物组织；
[0025] A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；
[0026] A16)含有上述DNA分子的转基因植物器官；
[0027] A17)含有A1)所述表达盒的转基因植物器官；
[0028] A18)含有A2)所述重组载体的转基因植物器官；
[0029] A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官。
[0030] 本发明的第三个目的是提供扩增上述DNA片段的引物对。
[0031] 本发明提供的引物对由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所 示的单链DNA分子组成。
[0032] 本发明的第四个目的是提供上述DNA片段的新用途。
[0033] 本发明提供了上述DNA片段在启动目的基因在植物中表达中的应用。
[0034] 上述应用中，所述植物为植物的种子。
[0035] 上述应用中，所述种子为种子的糊粉层。
[0036] 上述应用中，所述糊粉层为背侧糊粉层。
[0037] 上述应用中，所述基因为⑶S基因。
[0038] 上述应用中，所述植物为单子叶植物；所述单子叶植物为水稻。
[0039] 本发明还提供了上述DNA片段在植物的遗传育种中的应用。
[0040] 上述应用中，所述植物为单子叶植物；所述单子叶植物为水稻。
[0041] 上述背侧糊粉层的范围是珠心凸下方多余一层的糊粉层细胞。
[0042] 水稻的糊粉层细胞在靠近背侧维管束部分是3-4层细胞，在侧面和腹侧则是单层 细胞，这是不同于大麦和玉米的单层糊粉层细胞，这预示着水稻背侧糊粉层细胞和其他部 位的糊粉层细胞在细胞分化和功能上有着不同之处。本发明分离和鉴定了一种新的在水稻 背侧糊粉层中特异表达的启动子P-MYBLIKE02,利用水稻背侧糊粉层中特异表达的启动子 可以驱动目的基因的表达，该启动子不仅对于研究糊粉层的发育调控和生产应用具有重要 的意义，而且将为提高水稻种子蛋白质、脂肪酸、铁、锌、维生素B1等营养成分的含量提供 理论指导。
【附图说明】
[0043] 图1为实时定量PCR检测MYBLIKE02基因在水稻不同组织中的表达情况。
[0044] 图2为pPLV15载体结构图。
[0045] 图3为?\代转P-MYBLIKE02水稻中的⑶S基因在水稻不同组织中的表达模式。其 中，a:叶舌；b:叶片；c,d,e:花序轴，节和节间的横切；f:小花；g:花药和子房；h-m:分别 为受精后4天，7天，11天，14天，21天和28天种子的纵切；n-s:分别为受精后4天，7天， 11天，14天，21天和28天种子的横切。
[0046] 图4为?\代转P-MYBLIKE02水稻中的⑶S基因在水稻种子背侧糊粉层中表达。其 中，t:种子背侧，放大20倍；u:种子背侧，放大40倍；NP:nucellarprojection珠心凸； AL:aleuronelayer糊粉层。
【具体实施方式】
[0047] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0048] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0049] 下述实施例中水稻转化主要培养基的配制如下：
[0050] ( -）、诱导培养基和继代培养基的配方如表1所示。
[0051] 表1、诱导培养基和继代培养基
[0054](二）、NB2C共培养基的配制
[0055]NB2C共培养基的配方如下：NB2培养基+10g/L葡萄糖+100ymol/L乙酰丁香酮 (八8)+78/1琼脂，调？!1:5.2。
[0056](三）、AAM-As转化培养基的配方如表2所示。
[0057]表2、AAM-As转化培养基
[0058]
[0059](四）、NBS1筛选培养基的配制
[0060]NBS1筛选培养基的配制方法：500mlNB1培养基（调pH5. 8)中加入3. 5g琼脂，灭 菌后当冷却至50°C时加入250μ1 50mg/ml的潮霉素HygB(终浓度为：25mg/L)和1125μ1 的TMT100mg/ml(225mg/L)。
[0061](五）、NBS2筛选培养基的配制
[0062]NBS2筛选培养基的配制方法：50