一种检测水稻种子携带真菌的培养基的制作方法

本发明属于种子质量检测技术领域，具体涉及对孟加拉红培养基进行改进用于检测水稻种子携带的真菌。

背景技术：

目前，种子健康度检测在很多国家已成为种子“质量评估”、“植物检疫”过程中的例行措施，已成为种子质量控制体系中不可或缺的组成部分，有些国家建立了专门的种子健康测定实验室。种子健康测定是测定种子是否携带有病原菌(如真菌、细菌及病毒)、有害的动物(如线虫及害虫)等健康状况，即对种子所携带病虫害种类及数量进行检测，其中种子携带真菌的检测是种子健康度检测中的重要内容。如国际水稻所自1983年成立种子健康部(SEED HEALTH UNIT)及1987年建成种子健康试验室以来，开始了对种子健康的系统研究。

传统的检测种子携带真菌的方法有洗涤法、琼脂皿法、滤纸保湿法。

洗涤法：将种子放入已灭菌的250mL三角瓶中，然后加入灭菌水25mL，将三角瓶封口后置于转速为150rpm，25℃的摇床中充分震荡1h，收集悬浮液于已灭菌的10mL离心管中，以3000rpm的转速离心10min，去上清液后加入200μL无菌水悬浮沉淀。将悬浮液用灭菌水进行10倍系列浓度梯度稀释，然后涂PDA平板进行检测。洗涤法仅能对种子表面携带的部分真菌进行分离，对于已侵染进入种子内部的真菌无法分离，而且需要稀释洗涤液，需要多次试验才能较为完整的统计出种子表面携带的真菌种类和数量。

保湿滤纸法：先用5％的次氯酸钠(NaClO)对供试种子进行表面消毒，然后用灭菌水清洗3次，消毒后的种子用滤纸吸干表面水分，置于垫有灭菌滤纸的9cm培养皿中，每个培养皿中叠放两层灭菌滤纸，用灭菌水湿润灭菌滤纸，种子摆放于湿润的灭菌滤纸后，在25℃恒温箱中光照(6h)/黑暗(6h)交替培养条件下培养12h，再置于-20℃冰箱中保持12h，使吸胀的种子死亡从而抑制种子发芽，而后置于25℃恒温箱中光照(12h)/黑暗(12h)培养5d后进行检测。保湿滤纸法可以避免细菌对真菌分离的干扰，但由于真菌生长的营养条件仅为种子供给，多个真菌在同一粒种子上着生时，难以单独分离。

琼脂皿法是我国国家标准GB/T3543.7-1995农作物种子—其它项目检验中规定的对种子携带的真菌进行分离检查方法。目前，我国对种子携带真菌的检测，基本采用国家标准GB/T3543.7-1995中的琼脂皿法。

国家标准GB/T3543.7-1995规定的琼脂皿法：取适量种子在5％的次氯酸钠溶液中浸泡8min进行表面消毒，然后用无菌水冲洗3遍，晾干后均匀摆放在9cm直径PDA平板上，每皿摆放10粒，每个处理4次重复，相同操作下用空白的PDA平板作为环境对照(PDA平板在制作时需要添加适量的链霉素抑制细菌生长)。置于25℃温箱中12h光照/黑暗交替下培养6d后检查，记录种子以及不同解剖部位携带的真菌种类和数量。琼脂皿法虽然能较好的分离种子携带的真菌，但在分离时由于细菌的干扰，常常不能够很顺利的将真菌分离出来，而且有部分真菌生长速度较快，如青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、腐霉属(Pythium)、根霉属(Rhizopus)的真菌在培养6d后，单个菌落直径为4cm～5cm，甚至长满全皿，对其它真菌的分离造成干扰。

真菌由于可以产生分生孢子，分生孢子随气流、水流等传播速度快，种子携带的真菌对农业生产的危害巨大，一旦发病后难以防治，如水稻稻瘟病菌可由种子携带，发病后会对生产造成毁灭性的灾害，因此研发一种能更多分离检测出种子携带的真菌方法，对于检测种子带真菌情况，预防毁灭性病害的发生具有重要意义。

孟加拉红培养基的配方是蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，琼脂15g，孟加拉红0.033g，氯霉素0.1g。孟加拉红培养基主要用于霉菌(Molds)和酵母菌(Yeast)的计数、分离和培养。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服种子健康检测的现有技术中存在分离真菌易受细菌干扰，以致分离的真菌数量少，不能完全反应种子所携带的真菌，以及分离时，部分真菌生长速度较快，菌落直径较长，对其它真菌的分离造成干扰、难以单独分离真菌的缺陷。

为解决上述技术问题，本发明提供一种检测水稻种子携带真菌的培养基，该培养基是在孟加拉红培养基的基础上进行的改进。

本发明提供一种检测水稻种子携带真菌的培养基的配方是：每升灭菌水中加入蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾1g，MgSO₄·7H₂O 0.25g，琼脂15g，孟加拉红0.033g，氯霉素0.1g，硫酸铜0.05g，硝酸锌0.029g，尸胺0.0001g。

本发明所述的一种检测水稻种子携带真菌的培养基的制备方法是：按上述一种检测水稻种子携带真菌的培养基的配方取各成分置于三角瓶中，再加入水1L，按湿热灭菌法，在121℃，0.1MPa～0.15MPa，湿热灭菌20min后，将三角瓶置于药品柜中保存，或分装入9cm直径培养皿内备用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明培养基在原孟加拉红培养基的基础上增加了硫酸铜(CuSO₄)0.05g，硝酸锌(Zn(NO₃)₂)0.029g，尸胺(1,5-Pentanediamine)0.0001g，减少了硫酸镁(MgSO₄)的用量，分离的真菌种类增加，在种子批相同的条件下，传统平皿法使用孟加拉红培养基在大多数情况下只能分离到青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、根霉属(Rhizopus)、腐霉属(Pythium)、镰孢属(Fusarium)的真菌，本发明改进培养基配方后，除上述真菌外可多分离到平脐蠕孢属(Bipolaris)、弯孢属(Curvularia)、多节孢属(Nodulisporium)的真菌。

2、不易被细菌污染。现有技术国家标准GB/T3543.7-1995农作物种子检验规程—其它项目检验中琼脂皿法规定的PDA培养基在添加抗生素(常用的是硫酸链霉素)后，不能完全避免细菌的干扰，细菌一旦滋生后，会迅速将整个培养基表面占满，影响真菌的生长，而且即使勉强将真菌分离出来后，也因夹杂着细菌，需要进行多次纯化，增加了工作量和污染的几率，难以获得目标真菌的纯培养，在所有措施均按照上述国家标准操作的情况，一般的细菌污染率在5％～10％。而使用本发明培养基细菌污染率在4％以下。

3、便于真菌的分离。现有技术国家标准GB/T3543.7-1995农作物种子检验规程—其它项目检验规定使用的PDA培养基由于营养过剩，部分真菌如青霉菌、曲霉菌、镰孢属、腐霉等生长速度较快，菌落直径过大，培养6d以后，菌落直径为4cm～5cm，有的甚至长满全皿，难以有效挑取单个菌落进行鉴定分析。且抑制了其它真菌的生长，导致检测结果不准确，而使用本发明培养基后，由于培养基营养成分仅满足真菌生长的基本需要，培养6d后，真菌菌落的直径在2cm～3cm，小于现有技术使用PDA培养基培养的真菌菌落直径(4cm～5cm)，从而可以做到有效准确的分离。

4、便于种子真菌携带率的统计。种子真菌携带率的统计是根据平皿培养的结果，对每粒种子上生长的菌落进行计数，并分别挑取进行鉴定，统计所有重复试验中带菌种子的数量、不同种类真菌的数量和菌落总数量。然后计算该批次种子的带菌率和不同种类真菌的出现频率，如检测到病原菌且出现频率较高，就需对种子进行处理，避免种植后引发病害。本发明培养基由于真菌生长的菌落直径较小，多个真菌在一粒种子上着生时，可以有效避免相互之间的干扰，便于种子真菌携带率的统计。而传统的平皿法使用的培养基由于营养过剩，导致部分生长较快的真菌菌落直径过大，争夺了其它真菌的生存空间导致其难以生长，从而发生漏检，增加了田间种植的风险。

附图说明

图1：实施例1本发明培养基与PDA培养基检测水稻种子带菌情况效果比较图。图1A是用本发明培养基培养水稻种子带菌检测图，图1B是用国家标准GB/T3543.7-1995农作物种子检验规程—其它项目检验中琼脂皿法规定的PDA培养基培养水稻种子带菌检测图。图1A中标记：1是平脐蠕孢属(Bipolaris)真菌、2是镰孢属(Fusarium)真菌、3是弯孢属(Curvularia)真菌、4是多节孢属(Nodulisporium)真菌；图1B中标记：5是镰孢属(Fusarium)真菌、6是平脐蠕孢属(Bipolaris)真菌。

图2：实施例2本发明培养基与PDA培养基检测水稻种子带菌情况效果比较图。图2A是本发明红培养基培养水稻种子带菌检测效果图，图2B是用国家标准GB/T3543.7-1995农作物种子检验规程—其它项目检验中琼脂皿法规定的PDA培养基培养水稻种子带菌检测效果图。图2A中标记：1是青霉属(Penicillium)真菌、2是腐霉属(Pythium)真菌、图2B中标记：3是腐霉属(Pythium)真菌、4是青霉属(Penicillium)真菌。

图3：图1的水稻种子带菌分离的真菌孢子显微观察图，图3中标记：1是平脐蠕孢属(Bipolaris)、2是镰孢属(Fusarium)、3是弯孢属(Curvularia)、4是多节孢属(Nodulisporium)均为本发明培养基分离真菌孢子显微图片。图3中5是镰孢属(Fusarium)、6是平脐蠕孢属(Bipolaris)均为用国家标准GB/T3543.7-1995农作物种子检验规程—其它项目检验中琼脂皿法规定的PDA培养基分离真菌孢子显微图片。

图4：图2的水稻种子带菌分离的真菌孢子显微观察图，图4中标记：1是青霉属(Penicillium)、2是腐霉属(Pythium)均为本发明培养基分离真菌孢子显微图片。图4中3是腐霉属(Pythium)、4是青霉属(Penicillium)均为用国家标准GB/T3543.7-1995农作物种子检验规程—其它项目检验中琼脂皿法规定的PDA培养基分离真菌孢子显微图片。

具体实施方式

以下实施例涉及的试剂均为市售。各实施例无特殊说明为常规方法。

实施例1

用本发明培养基检测水稻种子的具体步骤如下：

(1)本发明培养基的配制，按本发明培养基配方称取各成分置于三角瓶中，再加入水1L，煮15min后，按湿热灭菌法，在121℃，0.15MPa，湿热灭菌20min，分装入9cm直径培养皿内备用(如暂时不用可留在三角瓶中，下次灭菌后再分装)；本发明培养基的配方为：每升灭菌水中加入蛋白胨(Peptone)5g，葡萄糖(Glucose)10g，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)1g，MgSO₄·7H₂O 0.25g，琼脂(Agarpowder)15g，孟加拉红(Tetrachlorofluorescein)0.033g，氯霉素(Chloramphenicol)0.1g，硫酸铜(CuSO₄)0.5g，硝酸锌(Zn(NO₃)₂0.029g，尸胺(1,5-Pentanediamine)0.0001g。

(2)待培养皿内的培养基凝固后，将种子用质量分数为5％的次氯酸钠溶液进行表面消毒8min，然后将种子均匀放置在培养皿内的培养基上，然后将培养皿放入光照培养箱中，25℃，光照强度为9000Lx，光照(12h)/黑暗(12h)条件下培养1d，待种子吸涨后，再置于-20℃冰箱中保持12h，然后取出培养皿在28℃恒温，光照强度为9000Lx，光周期为12h光期/12h暗期，培养6d，再挑取已生长的真菌，在显微镜下观察形态特征，检查种子携带的真菌种类。

本实施例对同一品种元阳红米(月亮谷)水稻种子，共做了4个重复的试验，每个培养皿放10粒种子。元阳红米(月亮谷)水稻种子为元阳当地栽培品种，从当地农户家中收集，也可从市场购买。

对照1(CK1)：

对照1用实施例1元阳红米水稻种子，采用国家标准GB/T3543.7-1995农作物种子检验规程—其它项目检验中琼脂皿法规定检测种子病菌的PDA培养基(PDA培养基即马铃薯葡萄糖培养基，配方法为：马铃薯200g葡萄糖20g，琼脂粉15g，自来水1L，调节pH为7，煮15min后装入1L的三角瓶中，按湿热灭菌法，在121℃，0.1MPa～0.15MPa，湿热灭菌20min，分装入9cm直径培养皿内，多余培养基留在三角瓶中，以后使用时重新灭菌分装即可。共设置4个重复的的试验，每个重复做一个培养皿，每皿摆放10粒种子。

实验效果详见图1和图3：

图1中，本发明培养基检出4种真菌(图1A所示，图1A中1为平脐蠕孢属(Bipolaris)真菌，2为镰孢属(Fusarium)真菌，3为弯孢属(Curvularia)真菌、4为多节孢属(Nodulisporium)真菌)，分离真菌的孢子图片如图3所示，真菌菌落的直径在2～3cm，便于挑取观察。PDA培养基检出2种真菌(图1B所示，5为镰孢属(Fusarium)真菌，6为平脐蠕孢属(Bipolaris)真菌，分离真菌的孢子图片见图3)，真菌菌落的直径在4cm～5cm，菌落长满全皿，菌落相互重叠生长，已难以分离，难以挑取观察和计数。

实施例2

实施例2除为另取的元阳红米(月亮谷)水稻种子外，其余实验方法与实施例1相同，实验效果详见图2和图4。

图2中，本发明培养基检出2种真菌，(图2A所示，图2A中1为青霉属(Penicillium)真菌，2为腐霉属(Pythium)真菌，分离真菌的孢子图片见图4)，真菌菌落的直径在2cm～3cm，便于挑取观察。PDA培养基检出2种真菌(图2B所示，图2B中3为腐霉属(Pythium)真菌，4为青霉属(Penicillium)真菌，分离真菌的孢子图片见图4)，真菌菌落几乎长满培养皿，两种真菌生长重叠，难以分离，难以对单个种子带菌数量进行统计，且种子发芽，影响了种子携带真菌的分离效果。由于种子携带真菌的检测与种子自身携带的真菌的种类和数量有关，在图2的检测中，尽管本发明培养基与传统PDA培养基都只检出2种真菌，但本发明培养基分离的真菌菌落较小易于挑取和计数，传统PDA培养基分离的真菌菌落生长过快，难以区别每颗种子携带的真菌，且菌落重叠难以挑取观察及计数。

因此，在采用本发明培养基后，相比国家标准GB/T3543.7-1995的传统PDA培养基，可以多分离到弯孢属(Curvularia)，多节孢属(Nodulisporium)的真菌，且对于检出同样真菌的实验，如实施例2：青霉属(Penicillium)，腐霉属(Pythium)的菌落直径在本发明培养基上小于传统PDA培养基，易于挑取分离，便于种子真菌携带率的统计。采用本发明培养基，操作简便不易被细菌污染，细菌污染率在4％以下。