一种同时分析4种真菌毒素(don、zea、t-2、ht-2)的免疫亲和柱制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及的是一种真菌毒素(D0N、ZEA、T-2、HT-2)四合一免疫亲和柱的制备方法，属于制备技术。
【背景技术】
[0002]单端孢霉烯类真菌毒素是镰刀菌毒素中一大族化学性质相关的真菌毒素，对人和家畜的健康有很大的危害，广泛存在于各种粮食作物和加工产品中，多见于潮湿环境中储藏的发霉粮食中。经常从受污染的粮食和饲料中被检出的有4种:T-2毒素、ΗΤ-2毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇DON及玉米赤霉烯酮ΖΕΑ。对于粮食制品中单端孢霉烯类真菌毒素的测定分析方法主要为色谱法，包括气相色谱-质谱法(GC-MS)，液相色谱(LC)，液相色谱/质谱(LC-MS)和液相色谱/串联质谱(LC-MS/MS)等。这些色谱方法检测的目标分析物含量为微量水平，大多需结合前处理步骤，如固相萃取(SPE)。然而，目前的SPE是基于理化功能的表面保留，除获得目标分析物外易混有其他基质成分，常规的固相萃取技术的缺点是对目标分析物选择性低。免疫亲和柱则是一种具有高选择性的高效净化技术，利用抗原抗体的特异性识别和结合实现单个化合物或一类化合物的选择性萃取。免疫亲和柱操作简便，可重复使用。但是目前还没有一种高效的单端孢霉烯类真菌毒素多目标(DON、ΖΕΑ、Τ-2、HT-2)免疫亲和柱，同时实现几种真菌毒素的同时净化，大大节约时间和成本。
【发明内容】
[0003]本发明提供一种同时分析4种真菌毒素(D0N、ZEA、T-2、HT-2)的免疫亲和柱制备方法的制备方法，可以克服上述困难。
[0004]本发明是采用以下技术方案来实现的:一种同时分析4种真菌毒素(DON、ZEA、T-2、HT-2)的免疫亲和柱制备方法的制备方法，它包括抗体的制备和纯化、基质制备、配体偶联、装柱四个步骤，其特征在于:称取2g CNBr活化过的Sepharose 4B粉末，于20mLlmmol/L HCl中溶胀，使用lmmol/L HCl洗涤15min，然后用1mL偶联缓冲液洗涤；随后，迅速将CNBr活化的Sepharose 4B转移到抗体溶液中，ImL基质Sepharose 4B与I?5mg DON抗体、0.1?Img T-2、HT-2抗体、0.2?Img ZEA抗体偶联；将上述混合物4°C静置过夜，取Sepharose 4B，用8倍基质体积的偶联缓冲液进行洗涤；转移基质至pH 8.0的0.1mol/L Tris-HCl缓冲液中，室温条件下静置2h封闭所有残留的活性基团；为除去偶联后未偶联上的多余的抗体，依次用低(0.lmol/L pH 4.0醋酸-醋酸钠，内含0.5mol/L NaCl的缓冲液)、高(0.lmol/L Tris-HCl，pH 8.0内含0.5mol/L NaCl的缓冲液)两种pH的缓冲液对基质进行洗涤，至少洗涤3个循环，每种缓冲液的使用量为5倍基质体积，最后用200mL pH7.4的PBS溶液洗涤；采用湿法装柱，每根柱子装入ImL凝胶，柱子装好后，用5倍柱床体积的无菌过滤的0.01 % NaN3-PBS过柱，并使用0.01 % NaN3-PBS保存。
[0005]本发明的优点和积极效果:
[0006]设计新颖，工艺先进，方法独特，用途广。不但解决了单端孢霉烯类真菌毒素在传统富集过程中存在的基质干扰、特异性低、成本高等问题，并且实现多目标同时净化，特异性强，极大地提高了免疫亲和柱的使用效率。本单端孢霉烯类真菌毒素多目标免疫亲和柱的制备方法使单端孢霉烯类真菌毒素的多目标净化变得高效、快速、方便，且极具实用性、推广性。
【附图说明】
[0007]图例为本发明同时分析4种真菌毒素(DON、ZEA、T-2、HT-2)的免疫亲和柱制备方法的示意流程图。
【具体实施方式】
[0008]由图例给出具体实施例。图例给出的是一种同时分析4种真菌毒素(DON、ZEA、T-2,HT-2)的免疫亲和柱制备的工艺流程图，它包括抗体的制备和纯化1、基质制备2、配体偶联3、装柱4。
【主权项】
1.一种同时分析4种真菌毒素(DON、ZEA、T-2、HT-2)的免疫亲和柱制备方法，它包括抗体的制备和纯化、基质制备、配体偶联、装柱四个步骤，其特征在于:lmL基质Sepharose4B与I?5mg DON抗体、(λ I?Img Τ_2、ΗΤ-2抗体、0.2?Img ZEA抗体偶联。2.根据权利要求1所述的同时分析4种真菌毒素(D0N、ZEA、T-2、HT-2)的免疫亲和柱的制备工艺，其特征在于:抗体偶联的情况包括D0N、ZEA、T-2三种抗体偶联；D0N、ZEA、HT-2三种抗体偶联；D0N、ZEA、T-2、HT-24种抗体偶联(某些情况下T-2或HT-2 —种抗体可同时用于净化T-2和HT-2两种真菌毒素)。3.根据权利要求1所述的同时分析4种真菌毒素(D0N、ZEA、T-2、HT-2)的免疫亲和柱的制备工艺，其特征在于:能同时净化D0N、ZEA、T-2、HT-2四种真菌毒素。
【专利摘要】一种同时分析4种真菌毒素(DON、ZEA、T-2、HT-2)的免疫亲和柱制备方法的制备方法，属于制备技术，它包括抗体的制备和纯化、基质制备、配体偶联、装柱。本发明设计新颖，工艺先进，方法独特，用途广。不但解决了单端孢霉烯类真菌毒素在传统富集过程中存在的基质干扰、特异性低、成本高等问题，并且实现多目标同时净化，特异性强，极大地提高了免疫亲和柱的使用效率，同时易操作，生产成本低，且极具实用性、推广性。
【IPC分类】G01N33/543, G01N30/60
【公开号】CN104931695
【申请号】CN201510378241
【发明人】丁轲, 张家宁, 韩涛, 陈湘宁
【申请人】北京农学院
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年7月2日