利用荧光显微镜观察桔霉素免疫后牛蛙抗体和亲和的方法与流程

本发明依据荧光物质和特异亲和蛋白质之间的吸附原理，利用荧光显微镜观察桔霉素免疫后牛蛙亲和蛋白，属于食品安全检测技术。

背景技术：

桔霉素(citrinin)是一种真菌毒素。桔霉素的分子结构为共轭的平面结构，具有天然的荧光特性。兔子、大鼠、小鼠是常见的制备桔霉素的免疫抗体的动物。为了鉴定抗体蛋白质是否与桔霉素结合，有人利用荧光分光光度计分别对抗体的桔霉素溶液和桔霉素标准溶液进行荧光扫描，通过比较荧光光谱中荧光强度最大发射峰所对应的波长的变化，以此判定抗体是否与桔霉素共价结合。其原理是物质分子上连接的取代基结构对化合物的光学性能会产生较大的影响，使化合物荧光光谱最大发射峰所对应的波长发生变化。这种方法可以判断两者结合能力，但是这种方法无法观察到牛蛙中桔霉素亲和蛋白的形态。目前对于两栖纲动物免疫球蛋白分子的研究主要是以对非洲爪蟾的研究为主。它具有igm、lgx、igy和igd、igf五类。igm是爪蟾生活史中最早产生的、最重要的免疫球蛋白。igx在结构上与igm类似，以聚合体的形式存在，在功能上类似于哺乳动物的iga，主要在肠道中表达，在血清中含量很低。igy在爪蟾生活史中出现较晚。igd和igf是最新发现的两种免疫球蛋白分子，igd仅在脾脏中有微弱表达，结构与其他动物igd相同；igf基因组与其他免疫球蛋白分子不同，其重链基因仅具有两个结构，其功能还未有研究。通过电泳分析，蛙类抗体存在两类，分别为低分子量7s和高分子量18s，已有研究证明，蛙类18s抗体类似于人igm，而关于7s抗体的功能还没有统一的定论。两栖类动物的抗体与哺乳动物的抗体有很大差别，其抗体至今尚未完全清楚。牛蛙抗体更是没有报道。另外医学上存在超敏现象，一般认为是因为某种小分子的半抗原，与体内组织蛋白结合，在体内形成完全抗原，从而诱导抗体的产生。但是一直没有具体哪种组织蛋白的报道，也缺少组织蛋白与半抗原结合的证据。本方法提供了一种直接观察牛蛙抗体蛋白和组织蛋白的方法。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种利用荧光显微镜观察桔霉素免疫的牛蛙亲和蛋白的方法，用于观察亲和蛋白是否与桔霉素结合、结合程度，以及亲和蛋白的形态。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种利用荧光显微镜观察桔霉素免疫的亲和蛋白的方法，其包括以下步骤：

(1)取来自桔霉素抗体免疫组牛蛙和对照组牛蛙的蛋白提取液各1ml，提取液中的蛋白含量为2.4～3.6mg/ml；向提取液中各加入1ml浓度为1.5μg/ml的桔霉素标准品，混匀后在4℃冰箱中静置3h；然后分别装入透析袋，并各加入20ml的0.01m、ph7.4的pbs作为透析液，在4℃冰箱透析13h；

(2)各取10μl透析袋内的保留液，滴在载玻片中央并盖上盖玻片，置于光显微镜中；使用蓝绿光激发滤板490-520nm，显微镜放大倍数为40×10倍，比例尺为100μm；使用image-proplus6.0软件分析荧光斑点的大小；

如免疫组血清蛋白提取液的荧光斑点面积大于桔霉素标准液荧光斑点面积77倍以上，表明免疫组牛蛙的抗体蛋白质能够与桔霉素结合；如果荧光斑点面积比例不符合上述条件，表明免疫组牛蛙的抗体蛋白质不能与桔霉素结合；如免疫组肌肉亲和蛋白提取液的荧光斑点面积大于桔霉素标准液荧光斑点面积6倍以上，表明免疫组牛蛙的肌肉亲和蛋白质能够与桔霉素结合；如果荧光斑点面积比例不符合上述条件，表明免疫组牛蛙的肌肉亲和蛋白质不能与桔霉素结合。

本发明中，所述蛋白提取液是血清蛋白提取液或肌肉蛋白提取液。

发明实现原理：

荧光显微技术能够通过荧光标记物对细胞成分进行高灵敏探测，在生命科学领域得到广泛的应用。物质分子在产生荧光的过程中，其中激发光子和发射光子之间的能量差(即斯托克斯频移)是荧光显微成像的关键。通过荧光显微镜的滤色系统(即激发滤板和压制滤板)完全滤去激发光并且不挡住发射出的荧光，可以观测到仅产生荧光的物质。用荧光显微镜对与蛋白质结合作用后的桔霉素进行观察，分析其成像情况，能够观察亲和蛋白的形态和判断桔霉素是否能与抗体蛋白质结合。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明以荧光显微镜技术观察桔霉素免疫后的牛蛙血清蛋白和肌肉蛋白的形态，并通过测定荧光斑点面积来鉴定桔霉素结合蛋白，属于开创性研究。相对于传统的鉴定方法，本方法具有快速、准确、直接的特点。本发明对牛蛙抗体和肌肉亲和蛋白的形态观察、桔霉素结合蛋白的快速筛选具有重要的实际意义。

附图说明

图1为荧光显微镜观察桔霉素标准品的情况。

图2为荧光显微镜观察33％上清(牛蛙)蛋白质结合桔霉素的情况。

图3为荧光显微镜观察33％沉淀(牛蛙)蛋白质结合桔霉素的情况。

图4为荧光显微镜观察33％沉淀(牛蛙)蛋白质结合桔霉素的情况。

图5为荧光显微镜观察牛蛙肌肉蛋白质结合桔霉素的情况。

具体说明：桔霉素呈现绿色荧光(图中浅色斑点区域)，标准品浅色斑点小(图1)。根据硫酸铵分级沉淀纯化蛋白质的原理，哺乳动物血清中33％硫酸铵沉淀的上清液中主要是igm，iga等β球蛋白。牛蛙血清的33％硫酸铵沉淀的上清液中观察到一种巨大的能结合桔霉素的球状抗体(图2)，该蛋白质是igm。哺乳动物血清中33％硫酸铵沉淀中主要是igy等γ球蛋白。牛蛙血清的33％硫酸铵沉淀中有两种抗体，一种是直径较小的球形抗体，其余桔霉素结合能力较弱(图3)。还有一种y型的与桔霉素有强烈结合的抗体，该蛋白质是igy(图4)。牛蛙肌肉中也有一种可以结合桔霉素的小蛋白，浅色斑点较小(图5)。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的实现过程进行详细描述。

(1)红曲培养液制备：

使用从红曲粉中分离得到的安卡红曲霉(红曲粉来源于福建省古田县辉荣工贸有限公司)，接种到msg液态培养基中培养。每瓶取50mlmsg培养基，接种20μl菌体安卡红曲霉，瓶口纱布球隔离，在30±1℃下培养5d。桔霉素的含量达到40.4μg/ml。

(2)牛蛙免疫：

市售牛蛙养于水桶，每桶3.8-4.2kg牛蛙，水与牛蛙重量比值为1:1，添加1ml桔霉素含量为40.4μg/ml的红曲培养液，常温养殖。在养殖后期牛蛙会陆续自然死亡。在免疫后第8-24d，取濒临死亡牛蛙，集中到一桶，每10min观察，取刚死亡牛蛙，在死亡后15min内采血，采血位置选牛蛙腹中线血管。并在采血后1h内以3000r/min的速度离心处理15ml，收集上清液。

(3)血清蛋白质的提取纯化

采用饱和硫酸铵分步盐析法提取免疫球蛋白。饱和硫酸铵溶液的配制：称取硫酸铵450g，溶于500ml纯水中，加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后用28％氨水调ph至7.0。0.01mpbs(ph7.4)的配制：称取2.9gna2hpo4·12h2o，0.27gk2hpo4，0.2gkcl，8.0gnacl，超纯水溶解，定容至1000ml，加热煮沸，冷却待用。

将采得血样置于10ml离心管中，室温静置1h，3000r/min离心15min后取上清液，此为待检血清。采用硫酸铵沉淀法对待检血清进行纯化：待检血清20ml，加入20mlpbs(0.01mph7.4)，于冰上用玻璃棒轻轻搅拌混匀，边搅拌边滴加饱和硫酸铵溶液40ml，使硫酸铵终浓度为50％，4℃冰箱静置3h以上，8000r/min，4℃，离心30min，弃上清液；沉淀用20mlpbs(0.01mph7.4)溶解，边搅拌边滴加饱和硫酸铵溶液13.33ml，使硫酸铵终浓度为40％，4℃冰箱静置1h以上，8000r/min，4℃，离心30min，弃上清液；沉淀用20mlpbs(0.01mph7.4)溶解，边搅拌边滴加饱和硫酸铵溶液9.85ml使硫酸铵终浓度为33％，4℃冰箱静置1h以上，8000r/min，4℃，离心30min，保留上清液和沉淀。用15mlpbs(0.01mph7.4)溶解沉淀，沉淀和上清液分别装透析袋，置4℃冰箱透析脱盐3h。取透析袋内蛋白质。

(4)肌肉组织蛋白质提取

参照之前的方法，取免疫养殖8-24d期间刚刚自然死亡的牛蛙，在死亡后15min内取大腿肌肉组织10g，剪碎，放入三角瓶中，加入100mlpbs(0.01mph7.4，1mmedta，1mm焦磷酸钠，1％tween-20)，超声破碎30min，10000r/min离心20min后，取上清液，即为肌肉组织总蛋白提取液，4℃冰箱密封保存备用。

(5)桔霉素结合蛋白质的荧光显微镜观察

分别取对照牛蛙和桔霉素免疫组牛蛙的33％硫酸铵沉淀的上清液蛋白质，33％硫酸铵沉淀的肌肉组织蛋白质1ml放于10ml玻璃管中(提取液中的蛋白含量为2.4～3.6mg/ml)，分别向其中加入1ml浓度为1.5μg/ml的桔霉素标准品，漩涡振荡器混匀后，放于4℃冰箱作用3h，将混合液装入透析袋，放于50ml离心管中，再向离心管加入20ml0.01mpbs(ph7.4)作为透析液，放于4℃冰箱透析，透析时间13h。取干净的载玻片和盖玻片，用移液器吸取透析后，袋内保留液10μl，置于载玻片中央，放于荧光显微镜观察。使用比例尺100μm。观察使用蓝绿光激发滤板490-520nm，显微镜放大倍数为40×10倍。

经image-proplus6.0软件分析荧光斑点的大小，桔霉素标准液荧光斑点的最大直径为17μm，33％硫酸铵沉淀的上清液中球形蛋白质igm结合桔霉素荧光斑点直径为277μm，33％硫酸铵沉淀中球形蛋白质结合桔霉素的荧光斑点直径为168μm，y形蛋白igy结合桔霉素的荧光斑点长和宽为265μm和66μm。肌肉蛋白质结合桔霉素的荧光斑点直径为43μm。这些蛋白质和桔霉素的结合体，呈现出更强更集中的荧光信号。而对照和牛血清白蛋白对桔霉素没有产生吸附作用，不会产生大斑点的绿色荧光。抗体直径一般为3-15nm，显微镜下无法观察。但是抗体或亲和蛋白吸附具有荧光的桔霉素，产生巨大的光线放大作用，可以在荧光显微镜下，观察蛋白质形态和结合状况。33％硫酸铵沉淀的上清液蛋白结合桔霉素荧光斑点面积是桔霉素标准液斑点面积265倍，33％硫酸铵沉淀中蛋白结合桔霉素荧光斑点面积是桔霉素标准液斑点面积97倍和77倍。肌肉蛋白结合桔霉素荧光斑点面积是桔霉素标准液斑点面积6.4倍。

因此，本发明所述方法最终可以根据下述原则进行判断：

如免疫组血清蛋白提取液的荧光斑点面积大于桔霉素标准液荧光斑点面积77倍以上，表明免疫组牛蛙的抗体蛋白质能够与桔霉素结合；如果荧光斑点面积比例不符合上述条件，表明免疫组牛蛙的抗体蛋白质不能与桔霉素结合。如免疫组肌肉亲和蛋白提取液的荧光斑点面积大于桔霉素标准液荧光斑点面积6倍以上，表明免疫组牛蛙的肌肉亲和蛋白质能够与桔霉素结合；如果荧光斑点面积比例不符合上述条件，表明免疫组牛蛙的肌肉亲和蛋白质不能与桔霉素结合。