低产桔霉素高产色素的Winter4红曲霉菌株的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一株具有低产桔霉素且高产色素能力的 红曲霉Winter 4菌株。 技术背景
[0002] 在红曲霉中首次发现桔霉素并将其提取出来是在1981年，香港中文大学的 Hinchung Wong教授等从红曲霉中产物分离出一种黄色的具有抑菌活性的物质，将其命 名为monascidinA。到了 1995年，法国Blnac教授等运用核磁共振、质谱、紫外及焚光分 析等多项检测手段对这种物质进行定性分析和结构测定，证实monascidinA就是桔霉素 (citrinin)。桔霉素是一种真菌毒素，红曲霉的种类中，紫色红曲霉和红色红曲霉是可以产 生桔霉素的菌种。桔霉素的靶器官是肾脏，经过动物实验的探究，表明桔霉素会引起肾脏肿 大、尿量增加，肾小管扩张以及肾脏上皮细胞变性甚至坏死等症状，一旦过量可引起死亡。 经口摄入，小鼠的半致死剂量为ll〇mg/kg。还有研究发现，桔霉素会损害肝脏的代谢功能。 体内试验表明，桔霉素能和血清蛋白结合，具有诱发突变作用。另有研究证实，桔霉素还对 基因具有毒性效应。另外，桔霉素可累积于细胞线粒体中，干扰电子传递系统，致使DNA合 成受阻，进而使RNA和蛋白质合成被抑制，引起线粒体肿大，导致细胞死亡。
[0003] 基因敲除是一种使机体特定的基因失活或缺失的技术。一般来讲，基因敲除主要 应用的是DNA同源重组（(homologous recombination)原理，用设计的同源片段替换待敲 除的靶基因片段，从而达到敲除靶基因的目的。基本过程是将构建好的重组载体导入受体 细胞，通过同源重组的方法置换靶基因，以此来推测目标基因的功能。
[0004] 因此通过基因敲除的技术定点敲除红曲霉基因组中桔霉素合成相关基因，可以达 到阻断桔霉素合成途径、降低桔霉素产量的目的。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于通过破坏发明人筛选得到的高产色素的Winter4红曲霉菌株 的桔霉素合成基因，阻断桔霉素合成途径从而降低红曲霉菌株的桔霉素产量，获得一株低 产桔霉素高产色素的Winter4红曲霉基因改造菌株。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0007] -株高产色素能力的红曲霉Winter 4菌株，该菌株分类名称为：紫色红曲霉 Monascus purpureus，保藏号为：CGMCC No. 11010保藏日期：2015年7月15日，保藏单位： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号 院3号中国科学院微生物研究所。
[0008] 而且，在液体培养基中进行培养，与母体菌株相比，桔霉素产量降低为母体菌株的 3. 52%，黄色素、橙色素、红色素提高了 89. 9% -172. 1%。
[0009] 而且，所述潮霉素抗性基因上游含有XhoI限制性酶切位点、潮霉素抗性基因下游 含有SmaI限制性酶切位点，两个酶切位点之间的距离为2513bp。
[0010] 尚广色素能力的红曲霉Winter 4囷株在制备红曲米、粗提红曲色素、精提红曲色 素中的应用。
[0011] 本发明的优点和积极效果：
[0012] 1、本发明提供的红曲霉Winter 4突变菌株是通过同源重组的方法用潮霉素基因 将目的基因0RF3替换掉，属于基因的定点突变，这种方法排除了随机突变带来的不确定因 素的影响，通过桔霉素和色素的变化情况可以对桔霉素合成途径有进一步的了解。
[0013] 2、通过将基因改造菌株与原始的野生株对比发现，本发明提供的红曲霉菌株 Winter 4菌株桔霉素产量降低为母体菌株的3.52% ;而突变株的黄色素产量提高了 89. 9%，澄色素提尚172. 1 %，红色素提尚140. 6%。为红曲霉在食品领域的安全应用提供 了菌种资源。
[0014] 3、本申请提供的基因改造菌株生产色素的方法节省时间、技术简便、易于发展下 游生产、遗传信息可操作且稳定。
【附图说明】
[0015] 图1为以野生株红曲霉DNA为模板，PCR扩增0RF3上游片段图。图中：M :DL2000 核酸分子量Marker，I :上游序列。
[0016] 图2为以野生株红曲霉DNA为模板，PCR扩增0RF3下游片段图。图中：M :DL2000 核酸分子量Marker，I :下游序列。
[0017] 图3为0RF3上游重组质粒双酶切和PCR验证图。图中：M1.DNA分子量标记 DL10000;M2. DNA分子量标记DL2000;1.重组质粒；2.双酶切验证重组质粒。
[0018] 图4为0RF3上下游重组质粒双酶切和PCR验证图。图中：M. DNA分子量标记 DL10000;1.重组质粒；2.双酶切验证重组质粒；3. PCR验证重组质粒。
[0019] 图5为利用引物0RF3-1和hph-R进行验证，此对引物扩增序列为0RF3上游片段、 潮霉素上游序列以及一部分潮霉素序列，目的条带大小约为2500bp。图中：CK. FM-46野生 株对照；M. DNA分子量标记DL10000 ; 1.突变株Winter4。
[0020] 图6为利用引物0RF3-4和hph-F进行验证，此对引物扩增序列为0RF3下游片段、 潮霉素下游序列以及一部分潮霉素序列，目的条带大小约为2500bp。CK.FM-46野生株对 照；M. DNA分子量标记DL10000 ; L突变株Winter4。
[0021] 图7为利用引物0RF3-1和0RF3-4进行验证，此对引物扩增序列为0RF3上下游片 段、潮霉素上下游序列以及潮霉素序列，目的条带大小约为4500bp ;对于野生株，扩增序列 包括0RF3上下游片段及0RF3序列，目的条带大小约3200bp。CK. FM-46野生株对照；M. DNA 分子量标记DL10000 ;1.突变株Winter4。
[0022] 图 8 为利用 summer-up、summer-down 以及 winter-up、winter_down 两对验证引物 进行验证，此对引物扩增序列为0RF3上下游片段、潮霉素上下游序列以及上下游同源臂上 一段序列，目的条带大小分别约为2500bp和1500bp。1、3.突变株Winter4上游；2、4.突 变株Winter4下游；5.野生株上游对照；6.野生株下游对照。
[0023] 图9为突变株与野生株桔霉素产量对比。
[0024] 图10野生菌株色素产量与其它菌株的比较。图中FM-46为Winter 4菌株的母体 菌株，FM-23、M2、FJ-1、ZS为其它红曲霉菌株。
[0025] 图11为突变株与野生株3种色素产量对比。
[0026] 具体的实施方式
[0027] 为了理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明：下述实施例是说明性 的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0028] 本申请使用的Winter4红曲霉菌株是申请人自己筛选的菌株，现保藏于天津科技 大学食品营养与安全教育部重点实验室，保藏号为：FM-46。
[0029] 本申请通过构建重组质粒利用同源重组技术对野生型红曲霉菌株进行定点敲除， 是利用潮霉素抗性基因替代桔霉素合成基因簇中的功能基因0RF3 (加氧酶基因）实现的， 潮霉素抗性基因上游含有XhoI限制性酶切位点、潮霉素抗性基因下游含有SmaI限制性酶 切位点，两个酶切位点之间的距离为2513bp，具体步骤如下：
[0030] ⑴针对需要敲除的目的基因 0RF3在其上游和下游分别设计引物进行扩增。
[0031] ⑵然后利用相同的限制性内切酶对ORFs的上、下游片段和带有潮霉素抗性基因 标记的PUCH2-8质粒进行酶切，然后将其连接，通过这一过程将目的基因的上、下游克隆到 载体质粒上，构建出重组质粒。
[0032] ⑶然后将重组质粒用于对野生红曲霉原生质体的转化，红曲霉的0RF3基因序列 和重组质粒发生同源重组，重组质粒的2个同源臂分别与基因组上的同源序列发生2次同 源重组，从而使hph片段置换掉0RF3片段，最终使基因失活。
[0033] ⑷通过筛选及PCR扩增对突变株进行验证。然后检测突变株的色素生成和桔霉素 的合成的情况，最终得到0RF3基因成功敲除的红曲霉Winter4突变菌株。
[0034] 本发明还提供了扩增0RF3上下游所需的引物及其酶切位点。
[0035] 本发明还提供了含有上述基因的载体和载体的宿主细胞。本发明还提供了 0RF3 基因上下游序列、0RF3的基因、含有该基因的载体、含有该载体的宿主细胞在敲除0RF3中 的作用。
[0036] 以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0037] 以下实施例中使用的试剂材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得 到。
[0038] 实施例1
[0039] 含基因 0RF3重组质粒的构建
[0040] (l)pUCH2_8 质粒的提取
[0041] 将冻存的含有PUCH2-8质粒的大肠杆菌接种于含有100 μ g/mLAmp的5mL LB液体 培养基中，37°C振荡过夜培养。第二天取出菌液，用质粒小提试剂盒提取pUCH2-8质粒，步 骤如下：
[0042] a.取l-5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，12000rpm离心3min，尽量吸尽上清；
[0043] b.向收集沉淀的离心管中加入250 μ L Buffer P1，使用移液枪或涡旋振荡器将细 菌沉淀悬浮均匀；
[0044] c.向离心管中加入250 μ L Buffer P2,温和地颠倒混匀5-6次，使菌体充分裂解。 此步菌液应清亮粘稠。所用时间不得超过5min，以免损伤质粒；
[0045] d.向离心管中加入350 μ L Buffer N3,立即温和地上下颠倒混匀4-6次，此时出 现白色絮状沉淀；
[0046] e. 13000rpm 离心 lOmin，吸取上清，加入到已装入 Collection Tube 的 Spin Column CM中，注意不要吸出沉淀；
[0047] f. 13000rpm 离心 30_60s，倒掉 Collection Tube 中的废液，将 Spin Column CM 放 回 Collection Tube 中；
[0048] g.向 Spin Column CM 中加入 700 μ L Buffer PW，12000rpm 离心 30_60s，倒掉 Collection Tube 中的废液，将 Spin Column CM 重新放回 Collection Tube 中；
[0049] h.向 Spin Column CM 中加入 700 μ L Buffer PW，12000rpm 离心 lmin，倒掉 Collection Tube 中的废液，将 Spin Column CM 重新放回 Collection Tube 中；
[0050] L 13000rpm离心lmin，倒掉废液。将Spin Column CM开盖置于室温数分钟，以彻 底晾干吸附膜上残余的Buffer PW ;
[0051] j.将Spin Column CM置于一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 50-100 μ L无菌水，室温放置2min，HOOOrpm离心2min，将质粒溶液收集到离心管中，-20°C 保存质粒。
[0052] (2)目的基因上下游片段的扩增
[0053] 根据0RF3上、下游基因序列设计扩增引物，引物序列如下：
[0055] 以提取得到的红曲霉野生株基因组DNA为模板，以引物0RF3-1和0RF3-2扩增 0RF3的上游基因片段，以引物0RF3-3和0RF3-4扩增0RF3的下游基因片段，PCR体系如下：
[0058] 其中，扩增上游片段时：F、R分别为0RF3-1、0RF3-2。扩增下游片段时，F、