专利名称：一种食品及饲料中真菌毒素特别是黄曲霉毒素b1的快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种食品及饲料中真菌霉毒素及黄曲霉毒素B1的快速检测方法。
真菌毒素是产毒真菌分泌产生的次生代谢产物，是能引起人畜各种损害的天然有毒化合物。到目前为止，已经发现并被研究过的真菌毒素有300-400种之多，但是研究得较多和较清楚，并认为对人畜健康和安全有较大威胁的真菌毒素主要有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、单端孢霉烯醇化合物(包括T-2毒素、雪腐镰刀菌烯醇等)、皱褶青霉毒素、展青霉毒素、青霉酸等，其中黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，简称AFB1)是为止所发现的毒性最强的真菌毒素。它污染食品及饲料后，直接或间接进入人类食物链，威胁人类健康和生命安全。由于AFB1污染食品及饲料的环节多，因而要保证所有的食品及饲料绝对不含AFB1是不可能的，为此世界上几乎所有的国家和地区都规定了AFB1在食品及饲料中的最大允许含量并作为强制性标准。为了防止AFB1从食品及饲料进入人类食物链，加强对食品及饲料中AFB1的检测是非常必要的。目前我国AFB1的常用检测方法是薄层层析法，该方法存在着检测时间长，操作麻烦，结果仅能半定量等不足。进入80年代中后期以来，美国、加拿大等发达国家开始将酶联免疫吸附检测法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA)用于AFB1的快速检测。与薄层层析法相比较，该方法具有快速，灵敏，简便等优点，目前国外已有商品试剂盒出售。我国也已将该法列入国家标准。虽然ELISA具有很多优点，但是仍存在着检测时间长，一般需3-5小时(包括样品处理时间)，结果重复性差，变异系数大，操作仍然较繁琐，不能在检测现场应用等缺点。这些都已阻碍着ELISA技术在检测食品和饲料中AFB1或其它真菌毒素的应用。
本发明的目的在于克服上述薄层层析法和ELISA中的不足，提供一种快速、准确地检测食品及饲料中的真菌毒素及AFB1的方法。
本发明的目的是通过如下措施及方法实现的。
1、抗体的制备将黄曲霉毒素B1和牛血清蛋白或鸡蛋白蛋白的连接物(AFB10-BSA或AFB10-OV)注射免疫兔子或产蛋鸡，获得抗AFB1的多克隆抗体；或按单克隆抗体的制备技术，制备单克隆抗体。
2、Latex的包被Latex(中文名胶乳)溶液4000转/分钟离心10分钟，包被缓冲溶液(PH9.5，0.1M的碳酸缓冲液)洗涤离心两次，以包被液稀释Latex使其浓度为1％-4％，而后将溶于包被缓冲溶液中的浓度为10-200μg/ml的包被抗原AFB1-OV或AFB1-BSA与等量的Latex溶液混合，37℃或4℃ 150转/分钟，温育包被2-12小时，4000转/分钟离心10分钟，去上清，以0.05MPH7.2的磷酸缓冲溶液生理盐水洗涤离心三次，沉淀，以同样的缓冲液稀释，使Latex的终浓度为1％，这即为包被好的Latex，添加0.05-0.1％的叠氮化钠，4℃保存备用。
3、待检测样品中AFB1的提取以甲醇水(70∶30)溶液或甲醇二甲基甲酰胺水(70∶1∶29)作为提取液，提取样品中的AFB1。按每20克或20毫升样品加入提取液80毫升，于组织捣碎机中高速搅拌5-10分钟，过滤或离心得上清液，获得样品的AFB1提取液。
4、食品及饲料中污染AFB1的Latex检测以分析纯的甲醇将AFB1纯品溶解配制成不同浓度的标准溶液，将样品的AFB1提取液和不同浓度的AFB1标准溶液各20μl分别滴加于酶标板的微孔内，并于各孔内加入一定浓度的抗AFB1抗血清溶液20μl，混匀，之后加入40μl包被有抗原的Latex溶液，混匀，室温混匀反应5-10分钟。观察比较沉淀的产生情况，即观察加有样品AFB1提取液微孔的沉淀与哪个AFB1标准液孔的沉淀相同，相同则样品提取液中的AFB1浓度就等于该孔所对应的AFB1的浓度，灵敏度可达3-10PPb，符合国家的AFB1标准，有很好的应用价值。
本发明采用Latex作为载体材料，由于Latex的颗粒小(通常颗粒有直径为0.1-1.5μm)，吸咐面积大，因而大大地加快了抗原抗体的结合速度，一般5-10分钟就能完成抗原抗体的结合；加之本发明采用的样品中真菌毒素和AFB1的提取方法也只需5-10分钟就能完成，因而整个操作过程30分钟就能完成，和薄层层析法及ELISA相比，大大减少了检测时间，简化了操作步骤，能在现场实施检测。
本发明可将以试剂滴液的形式开发成产品。其它真菌毒素快速检测方法的实施例简述如下1、制取抗真菌毒素，(如赭曲霉毒素或单端孢烯醇化合物等)抗体；2、对食品及饲料中上述真菌毒素进行Latex包被；3、以常规方法提取待测食品及饲料中的上述真菌毒素；4、按照如同AFB1 Latex检测方法及步骤对食品及饲料中污染真菌毒素进行Latex检测。
权利要求
1.一种食品及饲料中真菌毒素特别是黄曲霉毒素B1的速检方法，按照常规制备方法获得抗AFB1或其它真菌毒素的单克隆或多克隆抗体，从待测食品及饲料样品中提取AFB1或其它真菌毒素，其特征是所述检测方法还需对Latex进行包被，并对待测样品中AFB1或其它真菌毒素进行Latex检测。
2.如权利要求1所述的速检方法，其特征是所述Latex包被是按下述方法进行的Latex(中文名胶乳)溶液4000转/分钟离心10分钟，包被缓冲溶液(pH9.5，0.1M的碳酸缓冲液)洗涤离心两次，以包被液稀释Latex使其浓度为1％-4％，而后将溶于包被缓冲溶液中的浓度为10-200μg/ml的包被抗原AFB1-OV或AFB1-BSA与等量的Latex溶液混合，37℃或4℃ 150转/分钟，温育包被2-12小时，4000转/分钟离心10分钟，去上清，以0.05MpH7.2的磷酸缓冲溶液生理盐水洗涤离心三次，沉淀,以同样的缓冲液稀释，使Latex的终浓度为1％，之后添加0.05-0.1％的叠氮化钠，4℃保存备用。
3.如权利要求1所述的速检方法，其特征是对食品及饲料中真菌毒素特别是黄曲霉毒素B1的Latex检测按下述方法进行以分析纯的甲醇将AFB1纯品溶解配制成不同浓度的标准溶液，将样品的AFB1提取液和不同浓度的AFB1标准溶液各20μl分别滴加于酶标板的微孔内，并于各孔内加入一定浓度的抗AFB1抗血清溶液20μl，混匀，之后加入40μl包被有抗原的Latex溶液，混匀，室温混匀反应5-10分钟；观察比较沉淀的产生情况，即观察加有样品AFB1提取液微孔的沉淀与哪个AFB1标准液孔的沉淀相同，若相同则样品提取液中的AFB1浓度就等于该孔所对应的AFB1的浓度。
全文摘要
一种食品及饲料中真菌毒素特别是黄曲霉毒素B1(aflatoxinB1的简称AFB1)的快速检测方法,经过抗AFB1或其它真菌毒素抗体的制备,Latex的包被以及提取待检测样品中AFB1预备程序后,对食品及饲料中污染AFB1或其它真菌毒素进行Latex检测。本发明采用Latex作为载体材料,由于Latex的颗粒小,吸附面积大,因而大大加快了抗原抗体的结合速度,一般仅5～10分钟就能完成其结合;加之对样品AFB,或其它真菌毒素的提取也只需5～10分钟,因此整个检测过程30分钟就能完成,且有较高可靠性和准确性,具有操作简便,检测迅速的优点。
文档编号G01N33/50GK1254843SQ9812167
公开日2000年5月31日 申请日期1998年11月25日 优先权日1998年11月25日
发明者陈福生, 李根久 申请人:陈福生