专利名称：提高半定量测量流体样品中的被分析物的精度的方法
各种分析方法和装置普遍应用于测定中，以确定临床上有意义的物质的存在和/或浓度，该物质存在于生物流体中，如尿液，血液，全血，血清，汗或唾液上。这样的物质一般指被分析物，并且包括特异性结合配对，如抗体或抗原，药物和激素。一种检验设备为所谓的测杆，包括与被分析物相互作用的酶，并与该被分析物以某种方式反应，其结果为氧化了还原氧化染色剂以改变颜色，这可以与所存在的物质相关，或在一种半定量的方法中这可以与被分析物的浓度相关。最近开发出按免疫层析原理工作大型试条，其中在吸收性材料的试条上加特异于被分析物的被标记的抗体，实验流体和被标记的抗体可通过毛细管穿过试条流动。通过将被分析物(或其类似物)固定在试条的一个特定部分，即捕获区，并测出通过特异性结合所获得的被标记的抗体的量，即可用半定量法测出试样中被分析物的浓度。在这种测定中，标记物为酶，并有一种用于酶的物质放在捕获区上以呈现带色的反应，详述见美国专利US4446232。在美国专利US4703017中，描述了类似的测定，其中标记物是颗粒状材料，一旦在捕获区中该颗粒状材料由于被分析物和被标记了的抗体之间的特异性结合而凝集就会提供可检测的、可视反应。
通过确定第二被分析物的浓度，可以提高用于各种被分析物的分析的临床实用性，在生物流体中的该第二被分析物的浓度在临床上与第一被分析物的浓度相关。第二被分析物最突出的实例为肌酸，即当肌酸成为供肌肉收缩的能量源的肌酸磷酸酯时的最后代谢物。肾小球过滤所产生的肌酸，并排泄进尿液，不再吸收。为了提高尿液测定的灵敏度，并使尿液的高流速问题减至最小，该问题可使尿液稀释，将被分析物/肌酸的比值用于尿蛋白测定中，以使尿液浓度规范化。一般的肌酸测定包括alkaline Jaffe法和Benedict-Behre法，该方法适用于高pH值情况，一般是在pH值为11.5～12.5范围内。最近又提出了一种肌酸测定法，在该测定法中，尿样与柠檬酸盐中的铜离子，过氧化氢和可氧化的染色剂一起接触，该可氧化的染色剂在有氧自由基和假过氧化物的情况下提供带色的反应。也可如WO96/34271专利中所描述的那样免疫地完成肌酸定量。在体液样品中的那些第二被分析物的浓度在临床上与第一被分析物的浓度有关，该第二被分析物不仅仅限于尿液中的肌酸，而本发明的方法可以测定的体液也不限于尿液。例如，进行该实验的体液可以是全血，第一被分析物可以是HbAIC，而第二被分析物是全部血红蛋白，因为可调整HbAIC的表观浓度到血液中全部血红蛋白浓度以析出HbAIC测定中的因子偏差。通过静脉施以菊糖，就像肌酸那样指示肾流。可与做为第二被分析物的肌酸一起被测定的、其它典型的第一被分析物是潜血，白血球，蛋白质和葡萄糖。根据第二被分析物中的清蛋白校正尿液中的IgG浓度。
在WO-96/34271专利中，公开了测定流体试样中的靶(第一)分析物和肌酸的装置，该装置带有检测肌酸的测定条和检测靶分析物的第二测定条。肌酸的浓度可以用比色法测定，或通过被标记的肌酸结合配对的特异性俘获来测定。根据样品的浓度校正靶分析物的浓度，可以人工或用编程的反射率分析器校正靶分析物的浓度。
现有技术中，根据第二被分析物浓度校正测定的第一被分析物浓度的系统直接涉及第一被分析物的颜色反应与第二被分析物的颜色反应的比值，或者先将颜色反应转换成浓度值，并用算术来确定这些值的比值。通过将颜色转换成如吸收率或反射率那样的数值而得到颜色反应的直接比值。这些校正被分析物的半定量测量结果的直接比值法的缺点是，当此方法进行到分析范围的边缘处时，它们并没有考虑估算中所出现的大误差。本发明通过考虑当进行到其分析范围的边缘处时估算中所出现的误差，提高了涉及两种被分析物的比值的、半定量法的精度。
本发明提出用于第一被分析物浓度的体液样品比色分析的改进，在体液中，该第一被分析物浓度是需要测量的，并且流体样品中第二被分析物的浓度是与第一被分析物浓度临床上相关的，其特征是第一被分析物浓度与第二被分析物浓度的比值用来校正流体样品中的第一被分析物浓度。该改进方法包括以下步骤a)测出未校正的第一被分析物浓度；b)如未校正的第一被分析物浓度落在对于这种被分析物的有用的分析范围之内或之外，则测出其浓度；c)如果未校正的第一被分析物浓度落在对于该第一被分析物的有用的分析范围之内，那么，测出第二被分析物的浓度，并且通过用第一被分析物的反应除以第二被分析物的反应来指定第一被分析物与第二被分析物的比值，而且指定比值的输出水平，该输出水平对应于用未校正的第一被分析物的浓度除以第二被分析物的浓度所校正过的第一被分析物的浓度；d)如果未校正的第一被分析物浓度落在对于该第一被分析物有用的分析范围之外，则根据步骤(a)中测定的未校正的第一被分析物浓度和第二被分析物的正常浓度，测出第一被分析物与第二被分析物的比值。
实施本发明的第一步是测定未校正的第一被分析物的浓度。将流体试样放到试条上，可以直接放到含有如酶反应情况中那样的试剂的试条部分上，或者，对于免疫层析条的情况，直接放到与该条的俘获区域流体连通的样品施加垫上，从而该样品可通过毛细作用流到捕获区。在每种情况下，通过将颜色与标准颜色图比较，或更精确地在反射率计的辅助下比较，人工看出由于试验流体中被分析物与试条的试剂相互作用而产生的颜色变化。
一旦测出未校正的第一被分析物的浓度后，下一步就是确定该浓度是否落在对于该被分析物有用的范围内。术语有用的分析范围表示本方法能够精确测量的被分析物浓度。例如，对于尿中清蛋白的情况，可有用的分析范围为30～300mg/L，其估计误差实际上更小，即，至少比估计的被分析物浓度的误差小三倍。如果测量作为第一被分析物的清蛋白在该范围中，则需测出第二被分析物，一般为肌酸，并计算第一被分析物与第二被分析物的比值，即([清蛋白]/[肌酸])，从而提高输出水平，该输出水平的值表示尿液试样中校正过的清蛋白浓度。
如果未校正的第一被分析物的浓度落有用的分析范围之外，例如，清蛋白小于30mg/L或大于300mg/L，则不需测第二被分析物的浓度，而用第二被分析物的正常浓度来确定第一被分析物与第二被分析物的比值。术语正常浓度表示根据典型康复病人而得到的所期望的生理值。对于肌酸，该比值为1000mg/L，由于人体一般每天排出1000mg的清蛋白和1升尿。本方法与现有技术的比值法作比较，在现有技术的比值法中，甚至对于第一被分析物的浓度落在反有用的分析范围之外的情况，仍用第二被分析物的所测定的浓度而不用第二被分析物的正常浓度。本发明的方法可更精确地测定第一被分析物的浓度，因为不允许不准确的测定值有附加的错误加到结果中去。
下面参照实施例进一步阐述本发明的方法。
在尿液分析中，清蛋白是第一被分析物而肌酸是浓度带测的第二被分析物，例如，用于校正肾流，将预定的30mg～300mg/L清蛋白范围定为尿液清蛋白测定的有用的分析范围。如果清蛋白试剂产生与30～300mg/L等效的比色结果，则用所产生的颜色比(清蛋白颜色/肌酸颜色)来确指定清蛋白与肌酸的比值。如果清蛋白试剂产生小于30mg/L或大于300mg/L的结果，则不用肌酸试剂而用正常的肌酸浓度指定清蛋白与肌酸的比值。这样可防止使用落在清蛋白测定的分析范围之外的结果，因为落在此范围之外的结果存在很大误差，并且不准确。已知落在分析范围之外的结果具有小于30mg/L或大于300mg/L时的精确度，这在医学上是重要的信息。
如果清蛋白试剂产生30mg/L～300mg/L之间的结果，则用对应于试样中清蛋白所形成的颜色的结果除以对应于肌酸试剂所形成的颜色的结果，来确定比值。然后，通过一个特殊比例的颜色比值，而将颜色比值换算成清蛋白与肌酸的浓度比值，即一个输出水平，通过适当已编程的反射率光谱仪可得到该输出水平。
如果清蛋白浓度小于30mg/L，则设定一个小于30mg/g的阈值，该阈值表示每克肌酸中含30mg清蛋白。小于30mg/g的认为是正常人的比值。诸如20mg/g或10mg/g的较低的结果不会改变这一点，因为此阈值代表所有小于30mg/g的值。反之，如果清蛋白浓度大于300mg/g，就有一个大于30mg/g的阈值，该阈值代表所有大于300mg/g的值。小于30mg/g和大于300mg/g的结果此处叫做是超出临界结果之外的结果。
人们一般知道仅能在一定的吸收率范围内测量颜色，一般是在小于1.0到大于0.1的吸收单位范围内或在大于10％而小于99％的反射率范围之内。由此，一般给光谱光度计和反射率计编程以便将落在该范围之外的一种颜色定为测量仪能够测量的最靠近的颜色。例如，把7％的反射率读作10％反射率，并将该值用于测量值。
表1示出了计算实例，表1示出本方法中清蛋白与肌酸试剂的比值比两种用现有技术方法得到的比值具有更好的一致性。
表1比值法校正结果的总数备注分区 70％ 如例1颜色比值法 79％ 如例2删去临界结果以外的值的颜色比值法 95％ 如例3
从表1可看出，与简单的分区或采用不删除临界结果以外的值的颜色比值法比较，用本发明的方法可以得到更高的测定精度。
下面的例子涉及尿液条试剂，该试剂一般试剂比色测定，其颜色用肉眼即可看出，或用反射率或吸收率仪也可看出。所产生的颜色直接与被分析物浓度成正比。对于清蛋白，形成清蛋白试剂的颜色越多，则存在于尿液样品中的清蛋白越多。为了将颜色换算成被分析物浓度，将一特定的颜色比例规定为一个输出水平。将被分析物的那些输出水平指定为代表典型估计误差的浓度范围。该方法通常用于所有尿液试剂条，并且在下面的表2中示出了对于清蛋白和肌酸试剂的情况。例如，用标准方法得到的30mg/L清蛋白值的临床样品可能用清蛋白试条颜色测定为20～39mg/L，但仍可定为清蛋白浓度为30mg/L。估计误差越小，方法的定量性越好。表2
例1-现有技术中关于求两种被分析物比值的方法最普通的求两种被分析物比值的方法要采用查表(下面的表3)表3mg清蛋白/g肌酸比值表设定输出
各试条输出的每种组合定为所期望的比值输出。所期望的比值输出比值基于表4中所示出的每个试条的平均结果分区。
表4mg清蛋白/g肌酸比值表除以每一试条的平均值
该方法引进误差，因为每个平均输出结果表示所期望的范围，并且所期望的范围的极值不总与设定的输出值一致。例如，30mg/L的清蛋白有低的19.9mg/L的极值，而100mg/dL的肌酸有高的150mg/dL的极值。这些极值的所期望的比值输出为13mg/g，该值不在30～299mg/g的设定范围内。即使当试剂与标准方法100％-致时，这错误的设定也是不正确的比值结果。
此方法的误差示出在下列实例表中，在此表中，试条结果与275例临床样品的标准值作比较。对肌酸试条输出指定给定的清蛋白而得到的临床样品的范围比所期望的浓度范围大很多，从而使此方法不精确并且无效果。对于两个输出水平(即小于30mg/g和大于30mg/g)的校正结果的总数为70％(225个中的86和106个)，而同时多于35％的＞30mg/g的样品被不正确地指定，这可通过185个全部结果中的76个结果来测定，这些结果大于用试条测出的30mg/g的结果而小于用标准方法测出的30mg/g的结果。
用例1的方法给出比值的实例表
例2-现有技术中，另一种给出两种被分析物的比值的通常方法是将每种单独试剂的结果换算成要被检测的被分析物的浓度。将已知浓度的标准样品与未知样品比较，根据两样品的不同颜色确定未知样品的浓度，从而完成换算。可以除以被分析物的浓度以产生浓度比值。此方法与比色测定法极为相同，具有较高的精确度。但是，与具有较低精确度的比色测定法，如尿液测杆法，一起使用这种方法，还存在有缺点，因为因为它们比溶液方法具有更小的分析范围，该溶液方法可以产生稀释，并且可以定时添加试剂以限制误差增加干扰。这些定量方法具有超出所期望碰到的浓度的分析范围。
如表5所示，比值法的结果仅比表1中的方法稍好一点。两输出水平的校正结果总数为79％((125+93)/275=0.79)。
表5用例2的方法确定比值的实例表
例3本发明的比值法采用除法的结果，该结果为两种试剂产生的颜色与单独试剂产生的颜色结合。
开始，将对第一被分析物敏感的试剂颜色换算成第一被分析物的浓度，即，将一种特定程度的颜色指定为一个输出水平。检查输出水平，如果该水平落于可用的分析范围之外，通过用第二被分析物的正常值确定比值。例如，将产生小于30mg/L或大于300mg/L尿液结果的清蛋白试剂定为输出比值，而不考虑肌酸试剂结果，而是代替采用正常肌酸值1000mg/L。将浓度小于30mg/L的清蛋白指定为＜30mg/g的比值，而将浓度大于300mg/L的清蛋白指定为＞300mg/g的比值。此确定值取为1000mg/L的平均肌酸排泄。如果第一被分析物的输出落在有用的分析范围之内，用对第一被分析物敏感的试剂所形成的颜色除以对第二被分析物敏感的试剂所形成的颜色。然后，将颜色比值换算成比值浓度，如表6所示。表6
*mg清蛋白/g肌酸例如，将产生80mg/L结果的清蛋白试剂定为输出比值，该比值以清蛋白与肌酸试剂的颜色比为基础，在这种情况下，将1.7的颜色比定为30-300mg/g的输出比值。
下面的表7示出了此方法比上述两方法具有较好的协调性。这种较好的协调性是由于它排除了较大的误差，该较大的误差常常在其输出范围的端点处，即，通过最低或最高输出水平，用一种试剂观察到。落于分析范围之外的结果有很大误差并且不准确。可对于任何要被求出比值的试剂排除最低和最高的输出水平中的一个或两个。在表7中，两种输出水平校正结果的总数，即，小于30mg/g或大于30mg/g的为95％。确定该值可以通过正确测量的样品数目(149+112)除以样品的总数目275。
表7用例3的方法确定比值的实例表
权利要求
1.在对于第一被分析物浓度的体液样品比色分析中，该在流体样品中的第一被分析物浓度是需要测量的，并且在该流体样品中第二被分析物的浓度与第一被分析物浓度临床相关，其特征在于第一被分析物浓度与第二被分析物浓度的比值用来校正流体样品中的第一被分析物浓度测定，该改进方法包括a)测出未校正的第一被分析物浓度；b)测定未被校正的第一被分析物的浓度是否落在第一这种被分析物的、有用的分析范围之内或之外；c)如果未被校正的第一被分析物浓度落在该对于这种被分析物、有用的分析范围之内，那么，测定第二被分析物的浓度，并且通过用来自第一被分析物的反应除以来自第二被分析物的反应，从而确定第一被分析物与第二被分析物的比值，而且，确定该比值的输出水平，该输出水平对应于通过用未被校正的第一被分析物浓度除以第二被分析物浓度而校正过的第一被分析物的浓度；d)如果未被校正的第一被分析物浓度落在对于这种被分析物的的、有用的分析范围之外，那么，基于如步骤(a)中所测定的未被校正的第一被分析物的浓度，确定第一被分析物与第二被分析物的比值和第二被分析物的正常浓度。
2.根据权利要求1所述的改进方法，其特征在于所述体液为尿液，并且第二被分析物可以用来校正肾流的改变。
3.根据权利要求2所述的改进方法，其特征在于所述第一被分析物为清蛋白，而第二被分析物为肌酸。
4.根据权利要求1所述的改进方法，其特征在于第一被分析物/第二被分析物的对是潜血液/肌酸；白血球/肌酸；蛋白质/肌酸；葡萄糖/肌酸或IgG/清蛋白。
5.一种体液样品的分析方法，以测定其中所含的第一被分析物清蛋白和第二被分析物的浓度，这种方法包括下述步骤a)提供一种吸收材料的试条，流体样品可通过该试条流动，该试条包含用于比色测定第一被分析物的第一区，和用于比色测定第二被分析物的第二区；b)用流体样品处理该试条而使此试条显影，从而流体样品可以接触第一和第二区；c)通过判读试条的第一区颜色的变化，测定流体样品中未被校正的第一被分析物的浓度；d)确定未被校正的第一被分析物浓度是否落在该对于这种被分析物的、有用的分析范围之内或之外；e)如果未被校正的第一被分析物浓度落在对于这种被分析物的、有用的分析范围之内，那么，通过判读试条的第二区测出第二被分析物的浓度，并且通过用来自第一被分析物的颜色反应除以第二被分析物的颜色反应而确定第一被分析物与第二被分析物的比值，而且，对某一特定程度的颜色比值指定一个输出水平，该输出比值对应于通过用未被校正的第一被分析物浓度除以第二被分析物浓度而校正过的第一被分析物的浓度；f)如果未被校正的第一被分析物浓度落在对于这种被分析物的、有用的范围之外，那么，基于如步骤(c)中所测定的未被校正的第一被分析物的浓度，确定第一被分析物与第二被分析物的比值和第二被分析物的正常浓度。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述体液为尿液，并且第二被分析物可以用来校正肾流的变化。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述第一被分析物为清蛋白，而第二被分析物为肌酸。
8.一种体液样品的分析方法，以测定在试样中第一被分析物的浓度占在体液中第二被分析物浓度的比例，该第二被分析物的浓度流体样品中第一被分析物的浓度临床上相关，该方法包括a)提供一种材料的试条，这种材料使得试样以及被分析物和对于该被分析物的被标记的结合配对能够通过毛细管作用流过该材料，该试条包括下面这些区域，这些区域可以彼此流体连通ⅰ)用于施加流体样品的吸收区域；ⅱ)含有对于第一被分析物的特异性结合配对的区域，该特异性结合配对载有颗粒状可目测的标记物；ⅲ)含有被固定形式的第一被分析物的一个第一试剂区域；以及ⅳ)一个第二试剂区域，这个第二试剂区域能够提供有色的、可检测的反应，该反应的强度正比于流体样品中的第二被分析物的浓度；b)在试条的吸收区域施加流体试样，并且使其通过毛细管作用沿试条流动；c)测定被未校正的第一被分析物的浓度，使其作为来自颗粒状标记物的可目视检测的信号强度的函数，测定这个未被校正的浓度是否落在对于这种被分析物的、有用的分析范围之内或之外；d)如果未被校正的第一被分析物的浓度落在有用的分析范围之内，那么，测出第二被分析物的浓度，并且通过用来自第一被分析物的颜色反应除以来自第二被分析物的颜色而确定第一被分析物与第二被分析物的比值，并且，对某一特定程度的颜色比值指定一个输出水平，该输出比值对应于第一被分析物的被校正过的浓度；e)如果未被校正的第一被分析物浓度落在对于这种被分析物的、有用的分析范围之外，那么，基于用如步骤(c)中所测定的未被校正的第一被分析物的浓度除以第二被分析物的正常浓度，确定第一被分析物与第二被分析物的比值。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述体液为尿液，第一被分析物为清蛋白，而第二被分析物为肌酸。
10.一种尿样中清蛋白的比色分析方法，这种方法包括下述这些步骤a)用比色法测定尿样中未被校正的清蛋白浓度；b)如果未被校正的清蛋白浓度小于30mg/L或大于300mg/L，则用未被校正的浓度除以1000mg/L以得到代表校正过的清蛋白浓度的比值。
全文摘要
本发明公开了一种测定流体试样中第一被分析物的浓度的改进方法,该第一被分析物的浓度为第二被分析物浓度的函数,该第二被分析物也存在于流体样品中且浓度与第一被分析物的浓度临床上相关。该方法包括:测定第一被分析物的浓度,而且确定这个浓度是否落在其有用的分析范围之外,并用这个浓度除以第二被分析物的正常浓度。求出第一和第二被分析物的浓度的比值的这种方法是有优点的,因为,据报道,可以以较小的、虚假的肯定和虚假的否定的结果提高精度。
文档编号G01N33/50GK1218909SQ98120600
公开日1999年6月9日 申请日期1998年10月13日 优先权日1997年10月14日
发明者K·K·梅森格, M·J·普吉尔, J·F·华莱士 申请人:美国拜尔公司