测定流体中抗生素存在的方法
【专利说明】测定流体中抗生素存在的方法 发明领域
[0001] 本发明设及新的、经改进的用于测定样品例如奶中是否存在抗生素的微生物生长 抑制试验物（test)。
[0002] 发巧背景
[0003] 目前，抗生素被频繁用在兽医业中，不仅用于治疗细菌感染，还用于预防目的W提 高食品的生产率。近年来，运种不负责任地滥用抗生素作为预防措施已成为有利于细菌抗 性生长的决定性因素。
[0004] 已知抗生素残留在奶和乳制品中最经常检测到的污染物中，并且其在经济水平上 导致该行业部口中重要的问题。 阳〇化]为了避免抗生素残留对人类健康和整个生态系统的负面影响，多个立法者（例如EU)已建立了动物来源食品中抗菌剂的最大残留限量（MRL)。M化是可允许在动物来源物或 食品中的药理学活性物质的最大残留浓度。
[0006] 已开发出微生物生长抑制试验物来测定样品中是否存在抗生素残留。例如EP0 005 891A和EP0 285 792A中已描述了运类试验的实例。其中所描述的试验物是利用试验 生物（testorganism)和指示剂分子（例如，pH-和/或氧化还原-指示剂）的即用型试 验物。试验物的一般原理是：当样品中存在的抗生素的浓度足W抑制试验生物的生长时，指 示剂的颜色将保持不变；然而，当不存在抑制时，试验生物的生长伴随酸或还原代谢物的形 成或者伴随会诱导指示剂信号的其它现象。
[0007] 一般而言，微生物生长抑制试验物必须遵守基本立法规范并可靠地鉴定所检验样 品中浓度等于M化的抗菌剂残留的存在。然而，存在的微生物生长抑制试验物不能检测一 些处于它们各自的M化的抗菌剂残留，即它们对某些抗生素具有有限的灵敏度。特别地，目 前商业化的微生物生长抑制试验物对氨基糖巧类抗生素具有有限的灵敏度。
[0008] EP1 639 122A中已描述了：可通过使用指示剂漠百里酪蓝来提高微生物生长抑 制试验物的灵敏度。然而，运种指示剂的使用显著改变了用于0-内酷胺抗生素的微生物 生长抑制试验物的灵敏度。
[0009] 鉴于此，仍然需要具有对例如氨基糖巧类抗生素的提高的灵敏度的微生物生长抑 制试验物。
【发明内容】
[0010] 本发明的目标是提供简单、廉价、易于使用、适用广泛的用于测定样品例如奶中是 否存在抗生素的微生物生长抑制试验物。出乎意料地，已发现：当向试验物中加入氨基糖 巧类抗生素例如链霉素时，可提高用于氨基糖巧类抗生素的微生物生长抑制试验物的灵敏 度。
[0011] 发巧详沐
[0012] 在第一方面，本发明设及用于检测样品中抗生素存在的方法，所述方法包括W下 步骤：(a)使样品与微生物生长抑制试验物接触，所述试验物至少包含试验生物、指示剂和 氨基糖巧类抗生素，（b)使试验生物生长，和（C)检测试验生物的生长量，其中生长不足反 映出样品中抗生素的存在。
[0013] 任选地，所述方法包含W下步骤：在使试验生物与样品接触之前，准备试验生物。 因此，本发明还设及用于检测样品中是否存在抗生素的方法，所述方法包括W下步骤：(a) 准备试验生物，（b)使样品与微生物生长抑制试验物接触，所述试验物至少包含试验生物、 指示剂和氨基糖巧类抗生素，（C)使试验生物生长，和（d)检测试验生物的生长量，其中生 长不足反映出样品中抗生素的存在。
[0014] 在另一方面，本发明设及氨基糖巧类抗生素用于提高灵敏度的用途，所述灵敏度 为测定样品中抗生素存在的微生物生长抑制试验的灵敏度。在一个实施方式中，样品中的 抗生素是氨基糖巧类抗生素。
[0015] 在另一方面，本发明设及封闭包装（closedpackaging)，其包含至少一个微生物 生长抑制试验物，所述试验物至少包含试验生物、指示剂和氨基糖巧类抗生素。
[0016] 在另一方面，本发明设及试剂盒，其包含氨基糖巧类抗生素和微生物生长抑制试 验物，所述试验物至少包含试验生物和指示剂。
[0017] W下实施方式适用于本发明的所有方面。
[0018] 在本发明的一种实施方式中，在试验生物生长之前，即在试验开始之前，将氨基糖 巧类抗生素加入到试验物中。也可W在试验开始后加入氨基糖巧类抗生素，但运是次优选 的。在一个实施方式中，将氨基糖巧类抗生素加入到样品中。运可W在样品与试验物接触 之前、期间或之后进行。在一个优选的实施方式中，将氨基糖巧类抗生素加入到试验物中， 即它是试验介质的一部分。优选地，在试验物与样品接触之前，氨基糖巧类抗生素存在于试 验物中，即试验介质中。换言之，在样品不存在时，微生物生长抑制试验物包含氨基糖巧类 抗生素。再换言之，在将样品加入试验介质中之前，微生物生长抑制试验物的试验介质包含 氨基糖巧类抗生素。
[0019] 该试验物能够测定样品中抗生素的存在。待被测定的抗生素可W是来自选自下组 的抗生素家族的抗生素，所述组由0-内酷胺抗生素家族、四环素抗生素家族、横胺类抗生 素家族、氨基糖巧类抗生素家族、大环内醋类抗生素家族、林可酷胺类抗生素家族和哇诺酬 类抗生素家族组成。然而，该试验物还可被用于检测不同于上述抗生素的抗生素。
[0020] 由于试验物中氨基糖巧类抗生素的存在，所W用于氨基糖巧类抗生素（例如链霉 素和双氨链霉素）的试验物的灵敏度提高。出乎意料地，已发现：试验物中氨基糖巧类抗生 素的存在不影响用于其它抗生素种类（例如，P-内酷胺（例如青霉素G)和四环素（例如 氧四环素））的试验的灵敏度。因此，试验物中氨基糖巧类抗生素的存在特异性地提高了用 于氨基糖巧类抗生素的试验物的灵敏度。
[0021] 在一个实施方式中，氨基糖巧类抗生素选自由链霉素、双氨链霉素、阿米卡星 (andkacin)、安普霉素（apramycin)、阿贝卡星（arbekacin)、阿司米星（astromicin)、卡那 霉素B化ekanamycin)、地贝卡星（dibekacin)、新霉素B(化amycetin)、庆大霉素、潮霉素B、 异帕米星（is巧amicin)、卡那霉素、新霉素、奈替米星（netilmicin)、己龙霉素、罗多链霉 素（rhodostreptomycin)、核糖霉素（ribostamycin)、紫苏霉素（sisomycin)、壮观霉素、妥 布霉素和甲基姿苏霉素（verdamicin)组成的组。
[0022] 在一个实施方式中，氨基糖巧类抗生素的浓度在IOppb-1000 化pb之间、优选地在 lOOppb-1000化Pb之间、更优选地在50化pb-500化Pb之间。仅为了澄清的目的，所述浓度范 围设及在样品不存在时试验物中氨基糖巧类抗生素的浓度。
[0023] 在一个实施方式中，微生物生长抑制试验物包含指示剂。换言之，指示剂存在于试 验介质中。术语"指示剂"指的是用于测量（例如，通过颜色或巧光的变化）与特定组分（例 如，酸、碱、氧化剂或还原剂）存在有关的试验介质状态的物质。特别有用的指示剂是：从一 种状态变为另一种状态之后，提供视觉上可检测的信号，例如颜色或巧光的变化。试验介质 中指示剂的量一般在0.Ol-SOg^试验介质之间，优选地在0.I-IOg^试验介质之间，更优 选地在0. 5-5g^试验介质之间，最优选地在l-3g^试验介质之间。指示剂可W是抑-指示 剂、氧化还原-指示剂或它们的组合。该术语也可W指两种或更多种指示剂。本领域技术 人员将意识到：许多指示剂适用于本发明的目的。合适指示剂的实例可在手册H.J.Conn's BiologicalStains,R.D.Lillieed.,Baltimore, 1969 中找到。
[0024] 试验物的形式可W是液态、固态或凝胶状基质。在本发明的一个实施方式中，微生 物生长抑制试验物还包含胶凝剂。当在本文中使用时，术语"胶凝