提纯硫醚抗生素的方法

专利名称：提纯硫醚抗生素的方法
背景技术：
细菌对治疗人类疾病常规抗生素的抗药性已经增长到了国际性临界水平。一个重要因素是治疗非致命感染抗生素的广泛使用。近年来，人们更加关注一类被称为硫醚抗生素的具有前景的新型细菌素。当前，硫醚抗生素已经广泛应用于食品工业。硫醚抗生素具有显著的商业价值并且应用广泛，其可实施的制备方法具有显著的经济效益。
细菌素是由细菌产生的、对一定范围相关细菌表现出生长抑制活性的抗微生物蛋白。硫醚抗生素是由某些细菌产生的多肽抗微生物剂，由于其多肽特性与生物活性硫醚抗生素与其它抗生素相区别。例如作为某些食品防腐剂的乳酸链球菌肽具有非常规的氨基酸残基，羊毛硫氨酸和β-甲基羊毛硫氨酸。乳酸链球菌肽，一种富含赖氨酸的硫醚抗生素，对人类与牲畜无毒，耐高温在很低浓度下具有抑菌性。不幸的是，尽管硫醚抗生素用途广泛并且具有独特而优选的特性，由于缺乏经济可行的高纯度离析方法，其应用受到了限制。
对在乳品加工业使用乳酸链球菌肽的可能性进行分析，说明了缺乏经济可行提纯方法的影响。近来，人们已经认识到乳酸链球菌肽对乳品工业的潜在价值，特别是此价值与乳酸链球菌肽具有的帮助抵抗奶牛乳腺炎感染的能力有关。乳酸链球菌肽提供的益处大部分源于其减弱或者消除“抑制周期”规律的潜力。“抑制周期”是建立的一个时间段，即在奶牛乳腺炎感染的治疗过程中，感染奶牛生产的牛奶必须废弃。因此，与传统抗生素治疗相比，使用乳酸链球菌肽治疗乳腺炎感染奶牛的牛奶可以更快地恢复使用。
不幸的是，采用现有制备与提纯方法商业制备的乳酸链球菌肽认定为食品级质量，达不到药物应用的有效纯度。当向奶牛给药时，上述乳酸链球菌肽含有造成免疫响应的肽杂质。由于缺少可以选择性去除上述杂质的有效提纯方法，由乳酸链球菌肽治疗乳腺炎所获得的价值不足以弥补现有方法的实施。因此，人们仍旧需要一种提高硫醚抗生素纯度并且在商业规模应用可行的方法。
为了商业可行，提纯方案必须具备相对高的产率，相对低的成本。关于硫醚抗生素的制备，相对简单廉价的线路是培养可以自然表达或者人工设计表达所需细菌素的有机体。然而，不可避免的是，硫醚抗生素必须从有机体共同表达的、在初始制品中作为污染杂质的无数蛋白质中分离出来。由于硫醚抗生素是多肽，具有与其它蛋白质相同的生化特征，因此，设计能够识别硫醚抗生素与其它蛋白质或者肽杂质的实施方案，仍旧是一个挑战。
基于待提纯的蛋白质通常敏感于此类处理的事实，在蛋白质提纯方案中，少有例外地避免使用蛋白酶或者具有与蛋白酶相似活性的酶。例如，由于胰蛋白酶识别此类残基，可以在残基位置上断裂含有此类残基的蛋白质或者多肽，因此，在含有内部赖氨酸或者精氨酸残基的肽提纯方法中，不能使用胰蛋白酶。此外，采用蛋白酶基提纯方案，蛋白质的纯度与回收率逆向相关。这意味着，在增加重要蛋白质回收率的条件下，杂质趋于得不到充分的消化。
发明概述本发明公开了从含有硫醚抗生素的天然或者部分提纯的溶液提纯硫醚抗生素的方法。尽管硫醚抗生素的共同结构特征说明，本发明公开的提纯方法对于硫醚抗生素类的其它成员具有有效性，但是在优选具体实施方式
中硫醚抗生素是乳酸链球菌肽。本发明方法包括下列步骤生成含有硫醚抗生素和蛋白水解酶溶液的培养混合物；在使酶的选择蛋白水解活性最佳化的条件下培养上述混合物；从而在保证硫醚抗生素完全未经消化同时，消化含有硫醚抗生素溶液中的非硫醚抗生素蛋白质、多肽和肽成份。
发明详述硫醚抗生素是一组含有非常规的氨基酸、核醣体合成的、翻译后修饰的肽。此类氨基酸包括硫醚氨基酸羊毛硫氨酸(Lan)和/或甲基羊毛硫氨酸(Dhb)，外加许多修饰的残基，例如2，3-二脱氢丙氨酸(Dha)和2，3-二脱氢α-氨基丁酸(Dhb)。这些残基在结构中的出现及其对硫醚抗生素活性的影响已经成为显著的研究课题。
经发现，例如，丝氨酸(对应Dha)和苏氨酸(对应Dhb)特定序列脱氢生成了带有可以与邻近亲核基团反应的亲电子中心的修饰氨基酸。当邻近半胱氨酸残基的硫醇基团(-SH)攻击Dha的双键时，生成了硫醚羊毛硫氨酸。作为这些分子内部键桥出现的结果，硫醚抗生素成为含有许多羊毛硫氨酸环的多环结构。人们认定，这些羊毛硫氨酸环的存在对于硫醚抗生素的许多重要特性至关重要，其中包括，例如肽稳定的持续性与热灭活的耐受性。
本发明是基于申请人令人意想不到的发现在未造成硫醚抗生素可测蛋白水解并产生针对蛋白质与多肽杂质的选择蛋白水解活性的条件下，天然或者部分提纯硫醚抗生素制品可以经受蛋白酶处理。此条件的应用提供了提纯硫醚抗生素的有效方法。
有关硫醚抗生素对蛋白酶消化敏感的现有技术文献汇集于此。此类的一些报道特别涉及充分研究的硫醚抗生素，乳酸链球菌肽。例如，Gross等人(J Am Chem Soc93(18)(1971)4634-4635)报道，乳酸链球菌肽具有胰蛋白酶敏感性。随后，Wilimowska-Pelc发表了批驳性报道(Acta Microbiol Pol A8(1)(1976)71-77)。最近，Chan等人(Int Food Microbiol 390(2001)267-281)报道，乳酸链球菌肽可以经受胰蛋白酶消化，只是消化速率递减。总之，熟悉现有技术相关内容的本领域技术人员不能预测出鉴别处理条件的任何确定性；在此条件下，基本上未降解溶液中硫醚抗生素的同时，通过蛋白水解酶反应，选择性降解出现在天然或者部分提纯硫醚抗生素溶液中非硫醚抗生素蛋白质、多肽和肽杂质。此发现对于改进的、成本可行的高纯硫醚抗生素提纯方法的长期需求特别重要，此提纯方法可以生成适合药用的硫醚抗生素制剂。
本发明有效的蛋白酶消化条件是以选择性为特征。也就是，为含有搀杂硫醚抗生素和蛋白水解酶培养物确定的条件是，在此条件下蛋白水解酶选择性地降解非硫醚抗生素杂质。用于调节这些选择性条件可改变的参数包括改变的PH范围、减少的蛋白酶与硫醚抗生素比率、降低的温度等。用于使蛋白水解酶选择性操作最优化的可改变参数的上述列举并不全面，因此，本领域技术人员可以发现经改变可以影响所需目标的其它参数。
本领域技术人员可以容易地确定对于特殊蛋白水解酶的最佳条件。如果商业生产，生产者通常会在与酶共同运输的包装材料上提供上述信息。此外，凭经验确定此条件只是一件涉及常规实验的事情。
然而，最佳的条件不是需要的选择性条件。对于所给蛋白水解酶的最佳培养条件下，硫醚抗生素以及蛋白质或者肽杂质都会被降解。总的来说，选择性条件是由经验确定的。此确定的起点是生产者提供的最佳条件。如果在此条件下，硫醚抗生素与杂质都被降解，此条件可以“向下调节”，达到选择性条件。例如，如下文所述，据报道，胰蛋白酶的最佳pH大约是8.0。然而，在培养的其它条件都相同的情况下，说明书中记载的最佳选择性条件包括pH范围大约在5.50-6.25。
在下文的实施例部分中，使用了广泛研究的硫醚抗生素乳酸链球菌肽。然而，如上所述，硫醚抗生素类成员具有许多相同的结构特征，经鉴别，其中一些结构特征是相对耐受蛋白水解的原因。例如，在这方面还特别提到了羊毛硫氨酸环。因此，尽管实施例部分主要集中在硫醚抗生素乳酸链球菌肽，但是可以认定，由于存在定义的结构特征，本文建立的原则适用于所有的硫醚抗生素。其它硫醚抗生素包括，例如枯草菌素、表皮素、gallidermin、诱变素、pep5、epicidin、epilancin、溶细胞素、乳链球菌素、葡萄球菌素、salvaricin、乳杆菌素、链球菌素、sublancin、carnocin、variacin、cypemycin、connamycin、耐久酶素、血管紧张肽转化酶抑制肽、mersacidin、actagurdine。
本发明方法非常特别地适合存在于天然或者部分提纯发酵液中硫醚抗生素的蛋白水解提纯。例如，在乳酸链球菌肽发酵中，采用GC/MS/MS肽分析，已经鉴别出与乳酸链球菌肽共同提纯的40多种肽。下文的实施例部分清晰地展示了胰蛋白酶降解共同提纯杂质的有效性。
据报道，对于胰蛋白酶的蛋白水解活性，最佳pH值是在大约8.0。在培养的其它条件都相同的情况下，说明书中记载的最佳选择性条件包括pH值范围在大约5.50-6.25。相似的条件属于其它蛋白酶的选择性范围，其中包括，例如肽链内切酶Arg-C、嗜热菌蛋白酶、V8蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、梭菌蛋白酶、赖氨酰肽链内切酶、肽链内切酶Asp-N、肠肽酶、或者凝血因子Xa。优选的是，由其它蛋白酶选择性消化乳酸链球菌肽杂质的条件包括pH值范围在大约5.50-6.25。在优选的具体实施方式
中，pH值是5.80。对于胃蛋白酶，pH值3.5在选择性界限以内。
如选择性消化非硫醚抗生素杂质所述，可以通过多种方式实现选择性蛋白酶消化条件。这些条件可以包括，例如低蛋白酶与硫醚抗生素的比率、降低的温度、改变的pH值等。可以单独或者组合改变多种相关参数。
在完成蛋白水解消化后，需要去除蛋白酶。消化后促使去除蛋白酶特别常规的方法是，提供附着在固体载体的蛋白酶(例如琼脂糖或者磁性珠)。采用此种形式，消化后固体载体容易从培养混合物中分离。此外，可以采用简单的分筛柱步骤，实现蛋白酶的去除。蛋白水解消化后去除蛋白酶的其它技术在本领域众所周知，其中包括层析法技术，例如亲和性层析法、离子交换层析法、疏水性层析法。
应当注意，尽管消化杂质后需要去除蛋白酶，但是在所有的实际应用中都不需要这样做。例如，如果提纯的硫醚抗生素趋于被食物产品消耗，就不必为了满足相关规定去除蛋白酶。例如，对于某些食品应用，胰蛋白酶已经被授予了公认的安全资格(GRAS)。
实施例在中性到弱碱pH值与胰蛋白酶与乳酸链球菌肽高比率的条件下乳酸链球菌肽敏感于胰蛋白酶的蛋白水解乳酸链球菌肽含有2个蛋白水解酶胰蛋白酶潜在目标的内部赖氨酸残基。为了确定乳酸链球菌肽是否可以被胰蛋白酶消化，从来自发酵罐的乳酸链球菌肽制品、或者部分提纯的乳酸链球菌肽制备消化反应混合物，然后，在使胰蛋白酶活性最佳化的条件下，将反应混合物暴露于胰蛋白酶。上述条件包括反应的pH值为7.0，并且乳酸链球菌肽与胰蛋白酶的比率为10∶1(重量比)。将样品在30℃下培养，从零时间起每隔24小时取出等份试样用于分析。SDS-PAGE的考马斯蓝色染色表明，在使用的条件下乳酸链球菌肽被胰蛋白酶降解。此外，在各个时间点对乳酸链球菌肽的定量HPLC分析显示，暴露于胰蛋白酶后24小时，乳酸链球菌肽的回收率开始降低。经过96小时处理，超过90％的乳酸链球菌肽被降解。
在低pH值与胰蛋白酶与乳酸链球菌肽低比率的条件下乳酸链球菌肽耐受于胰蛋白酶的消化肽分析已经鉴别出与乳酸链球菌肽共同提纯的40多种肽。经鉴别，这些肽都可作为乳球菌发酵的产物。由于已经认定，在中性到弱碱pH值与胰蛋白酶与乳酸链球菌肽高比率的条件下乳酸链球菌肽经受了胰蛋白酶的蛋白水解，所以改变条件试图鉴别出胰蛋白酶不降解乳酸链球菌肽而降解乳酸链球菌肽样品中肽杂质的条件。在室温下将含有浓度为11mg/ml乳酸链球菌肽制品与浓度为27.5ug/ml USP级胰蛋白酶的反应混合物过夜培养(重量比为400∶1)。混合物的PH值范围在5.25-6.5。尽管乳酸链球菌肽与杂质的最低水解率出现在小于PH值5.50，但是定量的HPLC分析显示，乳酸链球菌肽的最佳回收率出现在小于或者等于PH值6.25。这些实验结果说明，涉及稀释的胰蛋白酶与范围在5.50-6.25PH值的条件是，对于胰蛋白酶消化乳酸链球菌肽损失最小化、并且从乳酸链球菌肽制品去除肽杂质的最佳条件。
为了进一步优化从胰蛋白酶消化的乳酸链球菌肽制品去除肽杂质的条件，制备2升浓度为4.55mg/ml部分提纯的乳酸链球菌肽，然后，加入含有25mg USP级胰蛋白酶的10mM柠檬酸，在30℃下保持PH值5.80培养16个小时。HPLC分析显示，乳酸链球菌肽的总回收率大约为95％。此外，采用分子量隔断膜连续去除胰蛋白酶，产生了87.5％乳酸链球菌肽回收率和0.38％胰蛋白酶回收率。
为了确定在消化杂质过程中不溶解的胰蛋白酶处理乳酸链球菌肽制品是否有效，而不仅是乳酸链球菌肽本身，使用1.6ml与珠状琼脂糖结合的TPCK处理的不溶性胰蛋白酶，处理制备成浓度为9.55mg/ml的1.6升部分提纯的乳酸链球菌肽。在30℃下培养6小时后，采用离心方式去除不溶解的胰蛋白酶，乳酸链球菌肽的总回收率是大约90％。
胰蛋白酶处理的乳酸链球菌肽保留了抗微生物活性采用逆向HPLC柱测定其可动性，采用SDS-PAGE测定其迁移性，可以判断得出，在上述条件下，使用胰蛋白酶处理乳酸链球菌肽制品，没有影响乳酸链球菌肽的物理结构。为了证实乳酸链球菌肽的生物活性也未经改变，采用生命体外灭菌活性分析法。采用96孔平板分析法，测定胰蛋白酶处理的乳酸链球菌肽针对乳腺炎离析物无乳链球菌(菌株#20)的抗微生物活性，并且细菌生长作为ELISA读出器上的吸光率读数进行读取。这些实验证实，胰蛋白酶处理的乳酸链球菌肽的抗微生物活性与未经胰蛋白酶处理对照的活性没有显著区别。
胰蛋白酶处理减少了存在于搀杂乳酸链球菌肽的炎性因子向牛乳房内注入搀杂的乳酸链球菌肽，作为部分炎性反应在牛奶中刺激产生了高含量的体细胞。如表1所示，注入30mg部分提纯乳酸链球菌肽的非乳腺炎奶牛具有大幅增长的体细胞数量。相反，采用注入胰蛋白酶提纯的乳酸链球菌肽处理乳区的奶牛，由此奶牛获得牛奶的体细胞数量要少很多，与只用缓冲液处理乳区的奶牛的体细胞数量相比在统计学上没有区别。
其它蛋白酶表现出针对乳酸链球菌肽以外杂质的选择活性在上述最佳条件下，乳酸链球菌肽比较耐受于胰蛋白酶的蛋白水解。为了测定在相似条件下乳酸链球菌肽是否也耐受其它蛋白水解酶，在保持PH值5.8下部分提纯的乳酸链球菌肽分别暴露于胃蛋白酶、凝血酶、V8蛋白酶(Endo Gluc)、枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、或者梭菌蛋白酶。也在PH值3.5的条件下实施暴露于胃蛋白酶。实验结果显示，乳酸链球菌肽耐受于上述酶的蛋白水解消化。PH值5.8下的胃蛋白酶和凝血酶对于杂质也都表现出效率低下。PH值3.50条件下胃蛋白酶有效地消化了乳酸链球菌肽的杂质，而未能消化乳酸链球菌肽。这些实验结果证明，在低PH值与如胰蛋白酶处理所述的乳酸链球菌肽与蛋白酶比率的条件下，其它蛋白酶也表现出针对乳酸链球菌肽以外杂质的选择活性。
方法胰蛋白酶消化在由25mM乙酸钠、6mM三羟甲基氨基甲烷乙酸、5mM CaCl2构成的PH值7.0的50ml缓冲液中，实施对乳酸链球菌肽(50mg)的胰蛋白酶消化。加入1ml USP级胰蛋白酶(5mg/ml)，然后，在30℃下培养。随后，在24、48、72和96小时，加入500ul等分试样的胰蛋白酶。在实验过程的每个时间点上，取出2ml等分试样用于进一步分析，其中100ul试样立即加入血液琼脂平板以测定污染。剩余的1.8ml试样在-20℃下储存，直到实验结束进行SDS-PAGE和HPLC分析。
蛋白酶消化为了用可溶的胰蛋白酶处理乳酸链球菌肽，将由发酵产品获得的2升部分提纯的乳酸链球菌肽制备成浓度为4.55mg/ml溶液，并加入10mM柠檬酸缓冲液和5mMCaCl2。在加入25mg的USP级胰蛋白酶后，在30℃下过夜培养反应混合物。乳酸链球菌肽与胰蛋白酶的重量比是大约400∶1(重量比)。使用NaOH调节消化反应的PH值，使其范围在5.25-6.50。采用SDS-PAGE和HPLC测定乳酸链球菌肽的回收率与纯度。通过使用3N HCl使PH值降低至3.0，终止消化反应。基于上述实验结果，在涉及其它蛋白酶的所有后续反应中选择并使用PH值5.80。
在如胰蛋白酶所述与PH5.8的条件下基本进行消化实验，使用胃蛋白酶(EC3.4.2 3.1)、凝血酶(EC3.4.21.5)、V8蛋白酶(EC3.4.21.19)、枯草杆菌蛋白酶(EC3.4.21.62)、木瓜蛋白酶(EC3.4.22.2)、嗜热菌蛋白酶(EC3.4.24.27)、或者梭菌蛋白酶(EC3.4.22.8)。也可以在PH值3.5下进行胃蛋白酶消化。为了采用与固体基质连接的胰蛋白酶进行胰蛋白酶消化，加入10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸，制备成浓度为9.5mg/ml的PH值5.50的1.6升部分提纯的乳酸链球菌肽溶液。然后，加入1.6ml与珠状琼脂糖(SigmaChemical Company)结合的TPCK处理的胰蛋白酶，在30℃频繁搅拌的条件下将反应混合物培养6小时。采用大约4000个重力离心7分钟，去除不溶性胰蛋白酶。获得含有乳酸链球菌肽的上清液，用于HPLC分析。
乳腺注入在第4、5、6次挤奶后，采用在乳区注入载体、未经处理的乳酸链球菌肽、胰蛋白酶处理的乳酸链球菌肽(30mg/10ml)的方式，处理非乳腺炎的奶牛。在挤奶以前、过程中、或过程后记录牛奶的体细胞数量。高体细胞数量表明了炎性反应。采用带有不相等平方差的两侧T-实验对照，进行统计分析。
乳酸链球菌肽的生物活性采用抗微生物分析法，使用96孔平板分析，测定针对乳腺炎离析物无乳链球菌(菌株20)、乳酸链球菌肽的活性。测试样品平行稀释到M17 10％乳糖介质中，然后，与等体积的104cfu/ml混合。室温下培养66小时后，在ELISA读取器450nm处读取平板数据。含有细胞生长的孔会给出高吸光率的读数。使用四参数曲线拟合软件分析上述数据。
表1胰蛋白酶处理的乳酸链球菌肽的炎症减弱
权利要求
1.一种提纯硫醚抗生素的方法，其中包括(a)提供含有待提纯硫醚抗生素的溶液；(b)提供蛋白水解酶；(c)生成含有硫醚抗生素和蛋白水解酶溶液的培养混合物，然后，在保证硫醚抗生素基本未经消化并使非硫醚抗生素蛋白或者多肽杂质选择性降解最佳化的条件下培养上述混合物。
2.权利要求1的方法，还包括在消化后去除或者灭活水解蛋白酶的步骤。
3.权利要求1的方法，其中(a)步骤提供的溶液是发酵产物。
4.权利要求1的方法，其中硫醚抗生素选自乳酸链球菌肽、枯草菌素、表皮素、gallidermin、诱变素、pep5、epicidin、epilancin、溶细胞素、乳链球菌素、葡萄球菌素、salvaricin、乳杆菌素、链球菌素、sublancin、carnocin、variacin、cypemycin、connamycin、耐久酶素、血管紧张肽转化酶抑制肽、mersacidin、actagurdine。
5.权利要求1的方法，其中硫醚抗生素是乳酸链球菌肽。
6.权利要求5的方法，其中蛋白水解酶是胰蛋白酶。
7.权利要求6的方法，其中使选择性降解最优化的条件包括pH值在5.5-6.25之间。
8.权利要求1的方法，其中蛋白水解酶选自胰蛋白酶、肽链内切酶Arg-C、嗜热菌蛋白酶、V8蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K、梭菌蛋白酶、赖氨酰肽链内切酶、木瓜蛋白酶、肽链内切酶Asp-N、肠肽酶、凝血因子Xa、胰凝乳蛋白酶。
9.权利要求8的方法，其中使选择活性最优化的条件包括pH值在5.5-6.25之间。
10.权利要求1的方法，其中蛋白水解酶是胃蛋白酶。
11.权利要求10的方法，其中使选择活性最优化的条件包括pH值大于4.5。
12.权利要求1的方法，其中蛋白水解酶连接在固体支撑物上。
13.权利要求1的方法，其中蛋白水解酶的有效用量是硫醚抗生素/蛋白水解酶的重量比为约400∶1的。
全文摘要
本发明公开了从含有硫醚抗生素的天然或者部分提纯的溶液提纯硫醚抗生素的方法。尽管硫醚抗生素的共同结构特征说明，本发明公开的提纯方法对于硫醚抗生素类的其它成员具有有效性，但是在优选具体实施方式
中硫醚抗生素是乳酸链球菌肽。本发明方法包括下列步骤生成含有硫醚抗生素和蛋白水解酶溶液的培养混合物；在使选择性蛋白水解活性最佳化的条件下培养上述混合物。
文档编号C12N9/70GK1703518SQ200380101155
公开日2005年11月30日 申请日期2003年10月7日 优先权日2002年10月9日
发明者理查德·T.·考格林, 约瑟夫·H.·克雷布 申请人:伊莫西尔有限公司