专利名称:新抗生素sr-1223的制备方法
本发明是关于新抗生素SR-1223及其制备方法。本发明所述的抗生素是由链霉菌属的抗生素SR-1223生产菌的培养液中分离而得，是一种未见文献报道的新抗生素。本抗生素SR-1223与本申请相应的日本专利申请中的RS-1223是同一物质。
近年来，抗生素不仅在医药方面，而且在农药方面也正在被广泛应用。本发明者为了寻找出比以往更为有效的新抗生素，从多种土壤中分离出微生物来培养抗生素，然而对这些抗生素分别进行精制、鉴定和开发应用。
本发明者曾从中国土壤中分离而得的土壤放线菌的培养物中提取了多种新抗生素。这次又成功地提取了与上述抗生素相异的一种新抗生素。
本发明的目的在于提供一种新抗生素，并提供一种从链霉菌属的微生物中分离、制取该抗生素的方法。
使用的微生物用来生产本发明所述的抗生素SR-1223的微生物是一种属于链霉菌属的菌种，其具有生产抗生素SR-1223的能力。
链霉菌SP·SR-1223(Streptcmyces sp·SR-1223)(以下简称为“SR-1223菌株”)就是其中一例。该微生物具有上述特性，适于生产本发明所述的抗生素SR-1223，因而能有效地使用于本发明所述的制备方法之中。
同时，上述“SR-1223菌株”的自然及其人工变异菌株也均属于链霉菌属的菌种，凡具有生产后述抗生素SR-1223能力的微生物均可应用本发明所述的方法。
上述“SR-1223菌株”是从中国浙江省土壤中分离而得的土壤放线菌，已于1986年11月5日寄存在中国微生物菌种保藏管理委员会，其保藏中心登记入册编号为CGMCC № 0117。
“SR-1223菌株”具有下述性质1.形态特征在含有葡萄糖、酵母浸膏的菌体分析用培养基上培养本菌株，然后进行菌体分离干燥，再用6N盐酸于110℃，加热水介20小时。用纸层析法检测细胞壁的氨基酸组分时，可以发现L、L-二氨基庚二酸。
本菌株经平板培养后呈螺旋性，形成由多个孢子相连的孢子锁。其在淀粉、酵母琼脂培养基、淀粉·无机盐琼脂培养基上，气生菌丝生长良好呈灰色状;在酪氨酸琼脂培养基上，可生成黑色素，但可溶性色素的生成并不显著。碳源糖的利用除山梨糖、山梨醇外，均很良好。从上可见，本菌株属链霉菌属，其在各种培养基上的性状如下。
2.在各种培养基上的生长状态于27℃培养三周，颜色按照“颜色名称描述词典”(Descri-ptive color names dictionary)记述。
(1)蔗糖硝酸盐琼脂培养基生长 一般气生菌丝 中等 b灰乳色(oysten white)基内 2cb浅米黄色(ivory tint)可溶性色素 无
(2)葡萄糖·天门冬酰氨琼脂培养基生长 一般气生菌丝 少量 e灰色(gray)基内 3gc亮黄褐色(light tan)可溶性色素 极少 3gc亮黄褐色(light tan)(3)甘油·天门冬酰氨琼脂培养基生长 良好气生菌丝 丰富 4gc玫瑰色(rose beige)基内 3lg亮褐色(light brown)可溶性色素 极少 3lg亮褐色(light brown)(4)淀粉·无机盐琼脂培养基生长 良好气生菌丝 丰富 5fe死灰色(ash)基内 3ec亮米黄色(light beige)可溶性色素 无(5)酪氨酸琼脂培养基生长 一般气生菌丝 无基内 4Ni栗褐色(chestnut brown)可溶性色素 4Pl深褐色(deep brown)(6)营养琼脂培养基生长 一般气生菌丝 无基内 2gc竹色(bamboo)
可溶性色素 无(7)酵母·麦芽琼脂培养基生长 良好气生菌丝 几乎无 e灰色(gray)基内 3ie浅黄棕色(cinnamcn)可溶性色素 少量 3lg亮褐色(light brown)(8)麦片琼脂培养基生长 不良气生菌丝 少量 3dc自然色(natural)基内 2dc自然细条色(natural string)可溶性色素 无(9)胨·酵母·铁琼脂培养基生长 一般气生菌丝 无基内 3ie浅黄棕色(cinnamon)可溶性色素 3ie浅黄棕色(cinnamon)(10)淀粉·酵母琼脂培养基生长 良好气生菌丝 丰富 e灰色(gray)基内 3ie浅黄棕色(cinnamon)可溶性色素 少量 3lg亮褐色(light brown)3.碳源的利用性(普戈琼脂培养基)生长状态L-阿拉伯糖 +++
D-木糖 +++D-葡萄糖 +++D-果糖 +++蔗糖 +++肌醇 +++L-鼠李糖 +++棉子糖 +++D-甘露醇糖 +++乳糖 ++蜜二糖 ++D-半乳糖 +++L-山梨糖 ±D-麦芽糖 +++D-山梨醇 ±柳醇 +对照 -+++ 生长非常好++ 生长较好+ 生长± 极少量生长- 不生长4.其它生理性质(1)合适温度 25～30℃(2)明胶的液化 阴性
(3)乳的凝固·胨化 阳性(4)淀粉水解 阳性(5)纤维素分介 阴性～拟阳性(6)黑色素的生成 阳性(7)硝酸盐还原 阳性(8)黄嘌呤溶介 阳性如上所述，本菌种属灰色链霉菌属。按柏氏细菌学鉴定手册第八版(Bergey′s Manual of Determinative Bacteri-ology 8th edition)分类法，可推断本菌种属链霉菌属的Streptomyces griseosporeus、Streptomyces lute-ogriseus或其极近缘菌。
培养及精制方法用链霉菌属的上述抗生素生产菌，通过常规的抗生素生产方法，可以培养“SR-1223菌株”，并制得本发明所述的抗生素SR-1223。培养方式既可为液体培养，也可为固体培养。在工业性生产时，为了有利于培养，宜将上述生产菌的孢子悬浮液或培养液接种到培养基上，并进行通气搅拌。
对培养基中的营养源并无特殊的规定，可使培养基中含有常用于微生物培养的碳源、氮源及其它营养源。其中碳源可为淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、蔗糖、肌醇、甘露醇等。氮源可为胨、大豆粉、肉膏、米糠、麦皮、尿素、玉米浆、铵盐、硝酸盐，以及其它有机或无机含氮化合物。至于其它营养源则可适当添加一些无机盐类。例如食盐、磷酸盐类及钾、钙、锌、锰、铁之类的金属盐。必要时也可添加些动、植、矿物油等作为消泡剂。
对温度、时间等培养条件并无严格的限制，以适于使用菌的生长为准，并以选择SR-1223产量最高的条件为好。例如，培养基的PH范围可为4～9，尤以接近中性为好，培养温度宜在25～35℃，当然这些培养的组份、培养基的氢离子浓度、培养温度、搅拌条件等均应根据所使用菌株的种类及外部条件等进行适当的调节，以获得最好的效果。
由上述所得的培养物出发，通过一些适当的方法就能制得SR-1223。这是些常用于提取代谢产物的常规方法。例如，可单独、组合或反复利用SR-1223与不纯物在溶介度、离子结合力、吸附亲和力及分子量等方面的差别进行分离。具体地讲SR-1223大部分存在于培养滤液中。将培养液调整到偏酸性，譬例调整到PH4.0，再用醋酸乙酯之类的有机溶剂进行提取，所得的浓缩油状物经硅胶层析(例如溶剂为氯仿-甲醇)后，收集并浓缩SR-1223活性区分。然后再经过高速液相色谱(例如充填剂为Nucle-osil5C18、展开剂为甲醇-水相中加入1%二乙胺·甲醇)，收集SR-1223的活性峰并调节到PH呈酸性(如PH＝4.0)，浓缩后用醋酸乙酯提取、洗净、再浓缩，即可得到SR-1223的粗粉末。最后再经高速液相色谱(如High carbon ODS、溶剂为甲醇-水-1%二乙胺·甲酸)，收集SR-1223活性峰，同上浓缩、提取、洗净、再浓缩，经冷冻干燥后，即可得淡黄色粉末状的SR-1223纯品。
如上所得的SR-1223其理化性质及生物性质如下形状淡黄色粉末融点130℃(分解)元素分析碳63.85%、氢8.56%
分子量660(据SIMS质谱)比旋度〔α〕25D+10°(C＝1.0·甲醇)紫外吸收光谱
270(579)(参照图1)红外吸收光谱νKBrmaxcm-13400、2900、1755、1700、1570、1450、1370、1270、1170、1030显色反应茴香醛-硫酸反应呈阳性溶介性易溶于甲醇、醋酸乙酯、丙酮、氯仿，难溶于水、正戊烷、正己烷、苯。
薄层分析(美国Merck公司制造的0.25mm硅薄层板)溶剂 Rf值氯仿∶甲醇＝2∶1 0.64氯仿∶甲醇＝10∶1 0.17醋酸乙酯∶苯＝4∶1 0.10抗菌谱采用通常的琼脂平板稀释法，求出最低抑制浓度(MIC)。
(真菌使用马铃薯·蔗糖琼脂培养基、细菌使用肉汤琼脂培养基)其结果，SR-1223对植物病原性系状菌显示出很强的生长抑制作用，而对常规细菌几乎无生长抑制作用。
测试菌 MIC(mcg/ml)灰葡萄孢菌 32(Botrytis cinerea)刺盘孢菌 62.5(Colletotrichum lagenarium)稻瘟病菌 62.5(Piricularcia oryzae)
蛇孢腔菌 62.5(Ophiobolus niyabeanus)黑曲霉菌 62.5(Aspergillus niger)链格孢菌 125(Alternaria mali)米曲霉菌 125(Aspergillus oryzae)尖镰孢菌 250(Fusarium oxysporum)与其他物质比较紫外光谱中，在270nm处有吸收峰的已知的抗生素有冷霉素(Cry-omycin)、匀霉素(Homomycin)、萘啶霉素(Naphthyridomy-cin)、萨布里霉素(Subliomycin)、结核放线菌素(Juberac-tinomycin)等。但这些抗生素均对细菌类显示出抗菌性，在这一点上与本抗生素有着明显的不同。而且在其他理化性质上也有着明显的差异，故而可以推论SR-1223是一种新抗生素。
SR-1223由于对上述植物病原性系状菌显示出很强的生长抑制作用，故而可望成为一种农用抗生素药剂。
实验例以葡萄糖2%、可溶性淀粉1%、肉汁浸膏0.1%、干酵母0.4%、大豆粉2.5%、食盐0.2%、磷酸二氢钾0.005%的配比制成培养基。将“SR-1223菌株”接种于该培养基中，置于28℃振荡培养96小时，取其培养液15升，于PH＝4的条件下用醋酸乙酯进行抽提，提取液经减压浓缩后，即得8.5g油状物。然后以氯仿-甲醇(4∶1)为溶剂，调制一根直径为60mm，长度为400mm的硅胶柱。将上述油状物溶于甲醇后在柱中展开。以每10ml为一计量，在第25～47计量区域里收集活性组份。
将上述活性组份的收集物减压浓缩得到2.2g浓缩物。此后用高速液相色谱分离制取SR-1223的粗品。色谱柱选用直径为20mm、长度为300mm的Nucleosil5C18。溶剂采用甲醇-水(7.5∶2.5)，并添加1%的二乙胺·甲酸(PH＝7.3)。流速8.0ml/分、压力170kg/cm2。在保留时间为16分钟时出现SR-1223的峰。收集该组分，用0.1N盐酸调整PH至4，减压浓缩直至除尽甲醇为止。沉淀经醋酸乙酯提取、水洗、再浓缩后，即得26mg SR-1223的粉末状粗品。
再后再用高压液相气谱进行精制。色谱柱为High-Carbon ODS直径10mm、柱长250mm，溶剂为甲醇-水-1%二乙胺∶甲酸(PH7.3)(7.5∶1.5∶1)，流速1.4毫升/分，压力150kg/cm2，在保留时间为20分钟时出现SR-1223活性峰。收集活性峰区域，用0.1N盐酸调整到PH4，减压浓缩直至除尽甲醇。用醋酸乙酯提取，以0.1N盐酸洗涤，再水洗、浓缩。然后再将浓缩物溶于甲醇，加水，减压浓缩至除尽甲醇，经冷冻干燥后即得26mg淡黄色粉末状的SR-1223纯品。
4.附图的简单说明图1为本发明所述的抗生素SR-1223的紫外吸收光谱图，图2为抗生素SR-1223的红外吸收光谱图。
权利要求
1.一种新抗生素SR-1223的制备方法，其特征在于培养属于链霉菌(streptomyces)属的抗生素SR-1223的生产菌，再从这些培养物中分离提取新抗生素SR-1223。
2.按权利要求
1所述的制备方法，其特征在于所述的抗生素SR-1223的生产菌为链霉菌SP·SR-1223(Streptomyces SP·SR-1223)。
专利摘要
本发明提供了一种新抗生素SR-1223及其制备的方法。该抗生素对某些植物病原性系状菌显示出很强的生长抑制作用，可望成为一种农用抗生素药剂，本抗生素通过培养链霉菌sp·SR-1223(Streptomyc es sp·SR-1223)而制得。
文档编号C07G11/00GK86104124SQ86104124
公开日1988年8月17日 申请日期1986年12月1日
发明者成杏春, 方仁萍, 梁凤群, 戴仙文, 沈寅初, 朱道荃, 矶野清, 山口勇, 黄耿堂, 木原刚, 日下部宽男, 见里朝正 申请人:上海市农药研究所, 日本国理化研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan