抗菌素tan-749的生产及其应用的制作方法

专利名称:抗菌素tan-749的生产及其应用的制作方法
本发明涉及一种能有效地用于治疗细菌传染病的药物，新型抗菌素TAN-749(下面在某些情况下简称TAN-749)的生产及其应用。
TAN-749A和C与TAN-749B和D，分别用分子式C15H27N5O3和C16H29N5O3表示。具有相似分子式的抗菌素，包括亮氨酰负霉素(分子式为C15H31N5O5)是用链霉菌属(Streptomyces)微生物生产的〔The Journal of Antibiotics，24，732(1971)〕。
由于使用抗菌素治疗法的发展，由细菌引起的疾病大部分已经被控制。但是在传染病药物领域中，仍然存在一些重要的问题。例如，长期或大剂量地使用常规抗菌素药疗，会引起致病菌丛发生变化(菌置换)或出现抗药菌(获得抗药性)，结果引起疾病增加，对于缺乏自身免疫力的人们更需要治疗。需要具有新型结果、新型生物活性的抗菌素或其合成用的中间物质，以解决这些问题。
本发明者们为了寻找新的抗菌素，从土壤中分离出大量的菌种，并分离和研究了那些菌种产生的抗菌素，发现某些微生物产生一种新的抗菌素。这些微生物属于假单胞菌属(Pseudomonas)，通过在介质中培养该种微生物，能够产生一种具有抗革兰氏阳性和革兰氏阴性菌和抗细菌活性的抗菌素，可在培养基中聚积。发明者们然后分离出这种抗菌素，并根据物理、化学和生物特性，证明是一种新抗菌素，命名为抗菌素TAN-749。TAN-749由四种成分组成，分别命名为TAN-749A、B、C和D。
在本说明书中，抗菌素TAN-749A、B、C和D或其中的每一个，一般称为抗菌素TAN-749或在某些情况下简称为TAN-749。
根据这些发现，发明者们进一步研究完成本发明。
本发明涉及(1)抗菌素TAN-749A、B、C和D或它们的盐。(2)抗菌素TAN-749A、B、C和D或它们的盐的生产方法，其特征在于微生物是属于假单胞菌属，能产生一种或多种抗菌素TAN-749A、B、C和D，在培养基中培养产生和在培养液中聚积一种或多种抗菌素TAN-749A、B、C和D，并进行收集。(3)含有一种或多种有效量的抗菌素TAN-749A、B、C、D和载体的治疗细菌传染病的药物组合物。
在本方法中，可用于做为微生物生产抗菌素TAN-749的细菌，包括所有能够产生抗菌素TAN-749的假单胞菌属。例如，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。更具体地说，包含荧光假单胞菌YK-437(后面在某些情况下简称菌株“YK-437”)，从日本长野县白马山上收集的一种植物中分离得到的。
菌株YK-437有如下细菌学特征(a)形态形态特征是在营养琼脂斜面培养基，在24℃，培养5天之后观察的。
细胞形状和大小杆状，0.5～1.0μm×1.5～4μm游动性 有(有鞭毛)孢子形成 无革兰染色 阴性耐酸性 不耐酸(b)在各种培养基上的生长状态生长状态是在各种培养基上，24℃，培养1～14天后观察。
1)营养琼脂平皿培养菌落无色，透明园形菌落表面呈头状凸球形，菌落边缘呈波状，不产生弥慢性的色素。
2)营养琼脂斜面培养菌落呈丝状，有显著光泽，不透明，无色。
3)营养液培养在混浊悬浮液中生长，形成薄菌膜，无沉淀出现。
4)营养明胶穿刺培养主要在上部生长良好，具有高液化活性。
5)石蕊乳未观察到石蕊还原活性，观察到胨化活性，但不凝固。
(c)生理特性1)硝酸盐还原作用-2)脱氮作用-3)MR(甲基红)试验-4)VP(福格斯-普罗斯考尔)试验-5)吲哚生成-6)硫化氢生产(乙酸铅纸)-7)淀粉水解-8)柠檬酸利用(Kesel柠檬酸盐培养基，Chri stensen柠檬酸盐培养基，Simon柠檬酸盐培养基)-9)无机氮源利用Ⅰ)硝酸钾+Ⅱ)硫酸铵+10)色素生成(金氏(King′s)A培养基、B培养基，甘露醇酵母提取琼脂培养基)在金氏B培养中观察到柠檬色内色素和柠檬色水溶性色素生成。
金氏A培养基甘油10克，蛋白胨20克，氯化镁1.4克，硫酸铵10克，琼脂15克，蒸馏水1000毫升，pH7.2。
金氏B培养基甘油10克，蛋白胨20克，磷酸氢钾1.5克，硫酸镁1.5克，琼脂15克，pH7.2。
11)尿素酶+12)氧化酶+13)过氧化氢酶+14)生长条件Ⅰ)pH生长pH范围4.1～8.5。
最佳pH范围6.3～8.2。
Ⅱ)温度生长范围8～36℃。
最佳温度范围11～24℃。
15)需氧量需氧16)O-F(氧化发酵)试验〔Hugh.Leifsen法〕氧化17)由糖生成酸和气及其利用酸 气 利用(蛋白胨水) (蛋白胨水) (Davis培养基)L-阿戊糖 + - +D-木糖 + - +D-葡萄糖 + - +D-甘露糖 + - +D-果糖 - - +D-半乳糖 + - +麦芽糖 - - +蔗糖 ± - +乳糖 - - +海藻糖 - - +D-山梨(糖)醇 - - +D-甘露糖醇 - - +肌醇 - - +
丙三醇 - - +淀粉 - - ++阳性，±假阳性，-阴性18)DNA的G+Cl(鸟嘌呤-胞嘧啶)含量66.4+1.5摩尔%(Tm方法)19)氯化钠耐受性0～5%20)羧甲基纤维素或胶状壳多糖的分解活性-21)琼脂或精氨酸盐的分解活性-22)吐温(Tween)80的分解活性+菌株YK-437与Bergey的<细菌鉴定手册>(第8版)或〈国际细菌分类杂志〉30卷，225～420页(1980)变异一览表中的菌株对照，认为该菌株属于假单胞菌属。根据下列事实，即它是一种需氧的革兰氏阴性杆菌，具有鞭毛状游动性，过氧化氢酶和氧化酶活性均为阳性，其DNA中含G+C为66.4±1.0摩尔%。
根据上述Bergey的<细菌鉴定手册>假单胞菌属分为四部分，即根据其在40℃生长所需生长因素的特征。细胞内聚-β-羟基丁酸酯的聚积。DL-精氨酸的利用与生长分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ部分。
表1给出进一步试验得到的菌株YK-437的特征。
表1菌株YK-437的特征试验类别 结果＊聚-β-羟基丁酸聚积 -精氨酸二水解酶 +色素生成金氏A培养基 -金氏B培养基 +
脱氮 -脂酶(吐温80)活性 -明胶水解 +聚-β-羟基丁酸水解 -碳源利用＊＊海藻糖 +蔗糖 +L-阿拉伯糖 +丙酸盐＊＊＊ -丁酸盐＊＊＊＊ -山梨醇 +核糖醇 +丙二醇 -乙醇 -＊+阳性，-阴性＊＊用Stanier培养基<普通微生物学杂志>，43卷，159～271页(1966)。
＊＊＊丙酸钠＊＊＊＊丁酸钠根据菌株无营养缺陷和不聚积聚-β-羟基丁酸酯作为细胞内碳储备的事实，认为菌株YK-437属于Ⅰ部份是恰当的。
Ⅰ部分包括10个物种。由于菌株YK-437产生荧光色素和具有精氨酸二水解酶，被认为属于绿脓假单胞菌。Putida假单胞菌、荧光假单胞菌和产金色菌素假单胞菌中的任一种。
菌株YK-437的脱氮作用和海藻糖及牻牛儿醇利用不同于绿脓假单胞菌，其明胶水解和海藻糖利用不同于Putida假单胞菌。菌株YK-437的脱氮作用、脂酶活性和碳源的利用不同于氯针菌素假单胞菌，而山梨醇和核糖醇利用不同于产金色菌素假单胞菌。
菌株YK-437的上述特征和荧光假单胞菌很一致。因此，认为菌株YK-437和荧光假单胞菌相同，并称为荧光假单胞菌YK-437。
荧光假单胞菌YK-437自1985年6月7日以来，已存放于大阪发酵研究所(IFO)，其登记号为IFO14446。
这种微生物于1985年6月7日以来，已存放于发酵研究所(FRI)，日本工业科学和技术机构，国际贸易和工业部(FRI)登记号为FERM P-8312，在FRI存过的存放物，根据布达佩斯协议，被转换登记号为FERM BP-1005，CGMCC0094。
本发明方法中所用的属于假单胞菌的细菌，一般很容易受到诱变，即很容易通过用紫外线、X光、如亚硝基胍和甲基磺酸乙酯等人为的方法使其改变，但是，能用于本发明的菌株包括可以产生TAN-749的所有变异体。
在培育产生TAN-749细菌时，可以专门用于被细菌吸收作为碳源的物质有葡萄糖、麦芽糖、乳糖、赤糖糊糖蜜、油和脂肪(大豆油、橄榄油等)、有机酸(柠檬酸、丁二酸、葡糖酸等)。作为氮源可以用各种有机或无机氮化合物大豆粉、棉籽粉、谷物浸渍液、干酵母、酵母提取液肉浸液、蛋白胨、尿素、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、磷酸铵。无机盐如氯化钠、氯化钾、碳酸钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢钾，这些对一般细菌培养是不可少的，适宜于单独或混合使用。
如果需要，则加入重金属，如硫酸亚铁和硫酸铜;与纤维素如纤维素B和纤维素H。培养基中也可加入防沫剂，如硅油和聚乙二醇醚，与表面活性剂。也可加入其它能促进细菌生长并因此增进抗菌素TAN-749生成的有机物或无机物。
在培养方法方面，可应用通常生产抗菌素的方法，固体和液体两种培养方法均可采用。在液体培养情况下，静置培养，搅动培养，浸没培养，充气培养等皆可。充气浸没培养更为可取。培养温度可选择在10°～30℃范围。推荐的培养温度约17°～24℃之间。培养基的pH可选在约4～8范围，推荐pH范围约6～7。培养约8～168小时，最好约24～144小时。
从培养物中收集目的产物TAN-749时，常采用从培养液中分离收集微生物产生的代谢产物的方法。例如，表现为水溶性碱性物质的TAN-749，主要含在培养滤液中，可施行如下过程来收集。向培养液中加助滤剂后，使之过滤或离心分离以除去细菌细胞，使得到的培养滤液，与适当的载体接触使滤液中的活性组分被吸附，然后用适当的溶剂使活性组分脱吸，分离回收目的的产物。合用的色谱载体包括下列三种化合物能根据吸附力之差进行分离的化合物，如活性炭、纤维素粉、和吸附性树脂;能根据官能团之差进行分离的化合物，如阳离子交换树脂、阳离子交换纤维素、和阳离子交换葡聚糖胶;能根据分子量之差进行分离的化合物，如葡聚糖胶。可用适当混合的洗脱剂从载体中洗脱出需要的化合物。洗脱剂包括水溶性有机溶剂的水合溶液，如水合丙酮和水合乙醇，含有酸，碱，缓冲溶液，和有机盐或无机盐的水溶液。随载体的类型和性质而改变洗脱剂的混合组分。
在有些情况下，用这些色谱法得到的含抗菌素的粗制品，用高压液相色谱分离得到精制产品。
下面更详细的说明回收TAN-749的方法。含在滤液中的抗菌物质，可用阳离子交换树脂，如Amberlite IRC-50和CG-50(Rohm & Haas CO.，USA)吸附，然后用含盐或酸的水溶液或缓冲溶液洗脱，也可用阳离子交换葡聚糖凝胶，如CH-Sephadex(Pharmacia Fine Chemicals，Sweden)吸附，然后用含盐或酸的水溶液或缓冲溶液洗脱。推荐用活性炭(Takeda Chemical Industries Co.，Ltd.，Japan)或吸附树脂，如Diaion HP-20和SP-207(Mitsubishi Chemical Industries Co.，Ltd.，Japan);Amberlite XAD-Ⅱ(Loam & Herth Co.，USA)，做为色谱载体，从得到的洗脱液中除去盐和有色物质。洗脱组分经过浓缩和冷冻干燥使成粉末。当得到的粉状物纯度低时，建议用高效液体色谱进一步提纯。TSK胶(Toyo Soda Manufacturing Co.，Ltd.，Japan)和YMC胶(Yamamura Chemical Laboratories，Japan)可用做此高压液相色谱的载体。流动相可用甲醇、乙腈等的混合溶液和含无机盐的水溶液或缓冲溶液。分离得到的TAN-749是无机酸盐的形式，如盐酸盐、硫酸盐和磷酸盐;或有机酸盐的形式，如甲酸盐、醋酸盐和草酸盐。
在上述过程中分离得到的TAN-749的盐，用常规的方法可转化为TAN-749游离化合物，此游离化合物用常规的方法可转化为上述相同的盐。
实施例1(后面说明)中得到的TAN-749A、B、C和D的二盐酸盐，具有下列的物理和化学性质〔1〕TAN-749A 二盐酸盐(1)外观无色固体(2)旋光率〔α〕25D-11°±5°(C＝1.06，H2O)(3)pK1a值8.0(4)分子量326(M+H)+，348(M+Na)+(SI-MS法，M代表游离化合物的分子量)(5)分子式C15H27N5O3·2HCl(6)元素分析试样在减压下，40℃，用五氧化二磷干燥6小时后进行分析。(计算是按试样含1摩尔水的条件处理的)
实验值 计算值C43.6±2.0 C43.27H7.4±1.0 H7.50N17.0±1.5 N16.82O O15.37Cl16.4±1.5 Cl17.03(%)(7)紫外(UV)线吸收光谱(在水中)参看图1 1%λmax 266±3nm(E1cm＝658±100)(8)红外(IR)线吸收光谱(KBr法)参看图2，主要的吸收波数如下3400，3100，1700，1670，1550，1440，1380，1340，1280，1220，1150，1100，1000，960，870，680(cm-1)(9)13C核磁共振(NMR)谱下列信号是在重水中，100MHz下测定的。参看图3174.7(s)，172.3(s)，171.7(s)，139.3(d)，129.6(d)，125.3(d)，69.2(d)，49.2(d)，47.8(t)，39.8(t)，39.1(t)，38.1(t)，35.2(t)，16.0(q)(上面的符号表示所代表的信号类型，即s单峰，d双峰，t三重峰，q四重峰)(10)高效液体色谱(HPLC)保留时间Rt＝4.4(分)柱YMC-PAK A312(Yamamura化学实验室)流动相12%甲醇/0.01摩尔磷酸溶液(pH3)流速2毫升/分(11)显色反应
阳性Ehrlich反应，二甲基苯甲醛，高锰酸钾阴性茚三酮，Greig-Leaback反应，Sakaguchi反应，Dragendorff反应(12)溶解性溶解水，二甲基亚砜，甲醇微溶丙酮，乙酸乙酯，乙醚(13)酸碱性中性(游离化合物是碱性的)〔2〕TAN-749B二盐酸盐(1)外观无色固体(2)旋光率〔α〕25D+56°±20°(C＝1.0，H2O)(3)pK1a值8.05(4)分子量340(M+H)+，362(M+Na)+(SI-MS法)(5)分子式C16H29N5O3·2HCl(6)元素分析分析条件与TAN-749A二盐酸盐相同。(计算是按试样含1.5摩尔水的条件处理的)实验值 计算值C43.62 C43.94H7.53 H7.37N16.06 N16.01O O16.46Cl16.31 Cl16.21(%)(7)紫外线(UV)光谱(在水中)参看图4 1% max 264±3nm(E1cm＝660±100)(8)红外(IR)光谱(KBr法)参看图53330，3100，1700，1660，1610，1550，1450，1420，1380，1350，1280，1220，1150，1070，1000，960，930，870，690(cm-1)(9)13C核磁共振(NMR)谱下列信号是在重水中，100MHz下测定的。参看图6174.7(s)，171.6(s)，139.3(d)，139.2(d)，129.6(d)，125.5(d)，72.6(d)，52.3(d)，49.3(d)，39.9(t)，39.1(t)，37.5(t)，35.2(t)，18.8(q)，16.0(q)(ppm)(10)高效液体色谱(HPLC)保留时间Rt＝7.2(分)(与TAN-749条件相同)(11)显色反应与TAN-749A二盐酸盐相同(12)溶解性与TAN-749二盐酸盐相同(13)酸碱性中性(游离化合物是碱性)〔3〕TAN-749C 二盐酸盐(1)外观无色固体(2)旋光率〔α〕23D-11°±5°(C＝0.68，H2O)(3)分子量326(M+H)+，348(M+Na)+(SI-MS法)(4)分子式C15H27N5O3·2HCl(5)元素分析
(计算按试样含0.5摩尔水处理)实验值 计算值C44.35 C44.23H7.83 H7.42N17.28 N17.19O O13.75Cl17.59 Cl17.41(%)(6)紫外线(UV)光谱(在水中)参看图7 1%
max 262±3nm(E1cm＝680±100)(7)红外(IR)光谱(KBr法)参看图83250，3070，1660，1630，1540，1430，1340，1260，1200，1150，1085，995，860，650(cm-1)(8)13C核磁共振(NMR)谱在100MHz，重水中测定的。
174.7(s)，172.3(s)，171.6(s)，145.1(d)，143.0(d)，132.0(d)，123.1(d)，69.2(d)，49.2(d)，47.7(t)，39.7(t)，39.1(t)，38.0(t)，35.2(t)，20.6(q)(9)显色反应与TAN-749A 二盐酸盐相同(10)高效液体色谱(HPLC)保留时间Rt＝5.7(分)〔A∶Rt＝5.3(分)〕柱YMC-PAK A312流动相30%乙腈/0.01M辛烷基磺酸盐/0.02M磷酸缓冲溶液(pH3.0)
流速2毫升/分(11)酸碱性中性(游离化合物是碱性的)〔4〕TAN-749D二盐酸盐(1)外观无色固体(2)旋光率〔α〕24D+30°±10°(C＝0.5，H2O)(3)分子量340(M+H)+，362(M+Na)+(SI-MS法)(4)分子式C16H29N5O3·2HCl(5)元素分析(计算按试样含0.5摩尔水处理)实验值 计算值C45.15 C45.61H7.98 H7.65N16.44 N16.62O O13.29Cl16.59 Cl16.83(%)(6)紫外(UV)光谱(在水中)参看图9 1% max 262±3nm(E1cm＝655±100)(7)红外(IR)光谱(KBr法)参看图103250，3050，1660，1635，1530，1435，1260，1200，1150，995，860，650(cm-1)(8)13C核磁共振(NMR)谱100MHz，重水中测定
174.7(s)，171.7(s)，171.6(s)，145.3(d)，143.0(d)，132.0(d)，123.2(d)，72.5(d)，52.2(d)，49.3(t)，39.9(t)，39.2(t)，37.5(t)，35.3(t)，20.7(q)，18.8(q)(9)显色反应与TAN-749A 二盐酸盐相同(10)高效液体色谱(HPLC)保留时间Rt＝6.2(分)〔B∶Rt＝5.8(分)〕(与TAN-749C 二盐酸盐相同)(11)溶解性与TAN-749A 二盐酸盐相同(12)酸碱性中性(游离化合物是碱性的)从上述物理和化学性质显而易见，TAN-749A和C与TAN-749B和D，彼此分别互为立体异构物。
下面说明TAN-749的生物特性。
表2和表3给出TAN-749A，B，C和D(二盐酸盐)对各种微生物的抗菌谱。
表2试验生物 最小抑制浓度(注1)(μg/ml)A B C D金黄色葡萄球菌 FDA 209P 50 12.5 ＞100 50大肠埃希杆菌 NIHJ JC2 ＞100 ＞100 ＞100 ＞100弗罗因德柠檬酸菌 IFO 12681 ≥100 ≥100 ＞100 ＞100肺炎杆菌 IFO 3317 ＞100 100 ＞100 ＞100普通变形杆菌 IFO 3988 100 25 100 100
摩根变形杆菌 IFO 3168 ＞100 100 ＞100 ＞100绿脓杆菌 IFO 3080 25 50 50 100粪产碱杆菌 IFO 13111 3.13 6.25 12.5 6.25不动细菌属Calcoaceticus IFO13006 25 50 ＞100 ＞100(注1)培养基成分Bacto抗菌素培养基317.5克(Difco实验室，USA)Bacto酵母菌提取物5.0克(Difco实验室，USA)Bacto琼脂20克(Difco实验室，USA)蒸馏水(pH不调)1000毫升接种物体积铂环量近似106CFU/毫升表3试验生物 培养基 最小抑制浓度μg/ml(注1)(注2) A B C D金黄色葡萄球菌 TSA 12.5 3.13 ＞100 25308A-1大肠埃希杆菌T7 TSA 50 12.5 ＞100 50金黄色葡萄球菌 B-TSA 12.5 3.13 ＞100 25FDA 209P酿脓链球菌E-14 B-TSA 3.13 6.25 100 25绿脓假单胞菌P9 B-TSA 100 50 100 100(注1)用琼脂稀释法测定。
接种物体积是铂环量108CFU/毫升。
(注2)TSA(Tripticase Soy琼脂，Baltimore生物实验室，USA);B-TSA，10%马血清/TSA。
表4给出TAN-749A二盐酸盐对临床分离的金黄色葡萄球菌菌株的抗菌活性。
表4菌株 抗菌类型 最小抑制浓度(注1)(μg/ml)1840 S 无 12.51840-2 青霉素G 12.5TN2613 新青霉素I 6.25TN2648 新青霉素I 3.13TN2687 大环内酯 6.25TN2684 大环内酯 6.25TN2688 大环内酯 6.25(注1)用琼脂稀释法测定。
介质Muller Hiton介质(Difco，USA)接种物体积铂环量106CFU/毫升表5给出TAN-749A，B，C和D(二盐酸盐)对小鼠传染病的疗效。
表5传染杆菌途径 ED50(mg/kg)A B C D大肠埃希杆菌0-111 皮下 67.2 27.3 50大肠埃希杆菌T7 皮下 50.8绿脓杆菌P9 皮下 31.0 61.4金黄色葡萄球菌 皮下 1.31 0.351 12.5 ＜6.25308A-1金黄色葡萄球菌 口服 17.7 16.2
308A-1表6给出TAN-749A和B(二盐酸盐)对小鼠的初试急性毒性。
表6途径 LD50(mg/kg)A B皮下 ～500 400～800口服 2000～4000从以上这些数据清楚看到，TAN-749及其盐对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌均有抗菌活性，而其对哺乳动物的急性毒性是低的。而且，它们对各种类型的抗药菌也是有效的，而不表现交叉抗药作用。因此，TAN-749及其盐可用于治疗哺乳动物(小鼠，鼠，兔，狗，人等)的细菌传染病。
TAN-749或它的盐，以下列方式用作治疗药物。TAN-749或它的盐，与病理学允许的载体混合。例如，制备口服制剂，可用适量的粘合剂(如羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，大粒凝胶等);崩解剂(如淀粉，羟甲基纤维素钙等);赋形剂(如乳糖，淀粉等);润滑剂(如硬脂酸镁，滑石粉等)等等。
在制备非肠道的或非口服的制剂时，例如注射液，可用等渗性试剂(如葡萄糖，D-山梨醇，D-甘露醇，氯化钠等);防腐剂(如苄醇，氯丁醇，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯等);缓冲剂(如磷酸盐缓冲剂，乙酸钠缓冲剂等)等等。制得对上述哺乳动物的非口服药剂，通过皮下或肌内注射大约1～50毫克/公斤/天的剂量。最好是大约5～20毫克/公斤/天。如果TAN-749或它的盐是口服时，可口服胶囊TAN-749剂量约1～100毫克/公斤/天，推荐的服用量是约在5～50毫克/公斤/天之间。
TAN-749或它的盐，可用作杀菌剂。例如，手、腿、眼、耳等，可用TAN-749或它的盐的水剂或软膏，敷于患处杀菌消毒。水剂的制备是把TAN-749或它的盐溶于蒸馏水中，浓度约为0.01～0.1重量/体积%。软膏是每1克软膏约含TAN-749 0.2～20毫克，最好约含1～10毫克。
本发明的产品TAN-749A，B，C和D，是由微生物生产的新抗菌素，能有效地抗革兰氏阳性和革兰氏阴性菌，包括一些抗药菌。因此，它们可有效的用作临床药物，例如，治疗细菌传染病的药物。
下面选择一些实施例，更详细地说明本发明的内容。除其它情况外，培养基组分含量用重量/体积%表示。
实施例1生长在浓缩琼脂斜面培养基上的荧光假单胞YK-437(IFO 14446，BP-1005，CGMCC0094)移植到含有500毫升培养基的2升Sakaguchi烧瓶中。培养基是把0.5%沉淀碳酸钙加入含有2%葡萄糖、3%可溶性淀粉、1%大豆粉、0.3谷物浸渍液、0.5%聚蛋白胨(Daigo Nutritive Chemicals，Japan)和0.3%氯化钠的水溶液(pH7.0)中，然后在24℃，反复振摇，培养48小时制备而成的。将得到的全部培养液再移植到含有30升培养基的50升的发酵桶中。桶中培养基是把0.05% Actocol(Takeda Chemical Industries，Japan)防沫剂加入上述培养基中，在24℃，30升/分的充气速度，200转/分搅动48小时培养的。将得到的培养液6升再移到含有120升培养基的200升发酵桶中。桶中培养基是含3%甘油，0.1%葡萄糖，0.5%聚蛋白胨，0.5%肉提取物(Wako Pure Chemical Industries，Japan)，0.5%氯化钠，0.05%硫代硫酸钠，2ppm氯化钴和0.05%Actocol的混合液，在24℃，120升/分充气，170转/分搅拌条件下，培养66小时制备的。
得到的培养液(105升)，用2N盐酸调节pH至6.5后，加到Hyflo Super Cel(Johns Manville Product，USA)并过滤和水洗，得滤液(102升)。所得滤液调节pH至6.5，通过IRC-50(Na+型，2升)填充柱，柱用水洗后，用2M盐水溶液(500升)洗脱，洗脱液再通过活性炭(2升)填充柱，用水洗，然后用8%异丁醇水溶液(10升)做为洗脱剂进行洗脱。得到的洗脱液调节pH至6.2，浓缩至2升，然后通过CM-Sephadex C-25(Na+型，0.5升)的填充柱。活性组分用0.1M盐水溶液(20升)洗脱。
TAN-749B级分出现在色谱的前部分，TAN-749A级分出现在色谱的最后部分。
得到的每一级分用活性炭(1.0升或4.0升)填充色谱柱进行脱盐，然后浓缩，冷冻干燥，得到TAN-749B粗制品(4.0克)或TAN-749A粗制品(8.9克)。
粗制品B(4.0克)用逆向高效液体色谱进行纯化〔载体YMC-PAK S-30(Yamamura Chemical Laboratories，Japan);流动相8%甲醇/0.02M磷酸溶液(pH3)〕，得到活性级分。活性级分通过CM-Sephadex C-25(Na+型，0.25升)色谱柱和活性炭(0.3升)色谱柱，得到纯化级分，经过浓缩和冷冻干燥，得到白色粉状TAN-749B二盐酸盐(0.66克)。粗制品A(8.9克)用同样的过程处理，得到白色粉状TAN-749A二盐酸盐(4.7克)。
实施例2生长在浓缩琼脂斜面培养基上的萤光假单胞菌YK-437(IFO14446，BP-1005，CGMCC0094)移植到含500毫升培养基的2升Sakaguchi烧瓶中。培养基是把0.5%沉淀碳酸钙加到含2%葡萄糖、3%可溶性淀粉、1%大豆粉、0.3%谷物浸渍液，0.5%聚蛋白胨和0.3%氯化钠水溶液(pH7.0)中，然后在24℃，反复振摇，培养48小时制备而成的。将得到的全部培养液再移植到含有120培养基的200升发酵桶中。桶中培养基是把0.05%Actocol加到上述培养基中，在24℃，120升/分的充气速度，180转/分搅动48小时培养的。将得到的培养液50再移植到含有1200升培养基的2000升发酵桶中。桶中培养基含3%甘油，0.1%葡萄糖，0.5%聚蛋白胨(Daigo Nutritive Chemicals)，0.5%肉提取物(Wako Pure Chemicals Japan)，0.5%氯化钠，0.05%硫代硫酸钠，2ppm氯化钴和0.05%Actocol的混合液，在24℃，1200升/分的充气速度，和150转/分的搅拌条件下，培养66小时制备的。
得到的培养基(1150升)，调节pH至6.5后，加到Hyflo Super Cel(Johns Manville Product，USA)并过滤和水洗，得滤液(1220升)。滤液调节pH至6.2，通过IRC-50(Na+型，20升)填充柱，柱水洗后，用0.5N盐酸(200升)作为洗脱剂进行洗脱，洗脱液调节pH至6.5，通过Diaion SP-207(20升)填充柱并用水(120升)洗脱。得到的洗脱液浓缩至2升，浓缩液再通过CG-50(NH+4型，3升)填充柱，活性级分用0.4～0.6M盐水溶液(40升)作为洗脱剂进行洗脱。
TAN-749A，B，C和D级分出现在色谱的前部分，TAN-749A级分出在色谱的最后部分。
得到的每一级分用活性炭(1.2升2.0升)色谱柱，8%异丁醇水溶液(4升或10升)进行洗脱。含TAN-749A的级分单独进行浓缩并冷冻干燥，得到TAN-749A(47.5克)。含TAN-749A，B，C和D级分，经过同样的过程得到3批(相当的原始培养液3450升)产物。进行浓缩。浓缩液(2升)通过CG-50(NH+4型，3升)色谱柱用0.2M盐水溶液洗后，用0.5～0.8M盐水溶液(40升)作为洗脱剂进行洗脱。含TAN-749B和D的级分出现在色谱的前部分，含TAN-749A和C的级分出现在色谱柱的最后部分。含TAN-749A和C级分通过活性炭色谱柱进行脱盐，得到的洗脱液浓缩并冷冻干燥，得到TAN-749A粉末(20克)，含少量TAN-749C。
含TAN-749B和D的级分，通过活性炭色谱柱进行脱盐，得到的洗脱液通过CM-Sephadex C-25(Na+型，1升)色谱柱用0.2M盐水溶液洗脱。洗脱液浓缩后，用逆向高效液体色谱进行分离〔载体ODS，YMC-PAK S-30;流动相5%甲醇/0.02M磷酸溶液(pH3.0)〕，得到两种级分，即单独含TAN-749B的级分和含TAN-749B和D的级分。单独含TAN-749B的级分，用CM-Sephadex色谱柱，然后用活性炭色谱柱纯化，得到TAN-749B(3.05克)。含TAN-749B和D的级分，经浓缩后再通过高效液体色谱分离，得到单独含TAN-749D的级分，然后浓缩，再通过IRA-402(Cl型，10毫升)色谱柱，并用水洗柱。流出物再通过活性炭色谱柱脱盐，得到TAN-749D(15.5毫克)。
上面得到的含少量TAN-749C的TAN-749A粉末(3克)，通过CM-Sephadex CG-50然后通过活性炭色谱柱，增加TAN-749C含量，得到高含量的TAN-749C粉末，再用高效液体色谱按上述条件经两次提纯，得TAN-749C产物(20.2毫克)。
实施例3胶囊(1)TAN-749A 300毫克(2)乳糖 28毫克(3)玉米淀粉 58毫克(4)羟丙基纤维素 12毫克(5)硬脂酸镁 2毫克400毫克/胶囊以上成分(1)，(2)，(3)和(4)混合，并用常规法制成颗粒，颗粒中加入成分(5)，混合物填入明胶囊No1(按照日本药典，第10版)。
实施例420克TAN-749B溶于1升蒸馏水中，加入并溶解50克甘露醇后每2毫升溶液过滤消毒后，装入安瓿中。冷冻干燥并密封好备用。使用时打开上述针药管，溶于2毫升生理盐水中，制备皮下或肌内注射剂。
文件名称 页 行 补正前 补正后说明书 21 4 Actocol Actcol21 14 最后 后21 22 最后 后22 26 备用 安瓿瓶文件名称 页 行 补正前 补正后说明书 3 21 柠檬色内色素 柠檬色细胞内色素5 11 变异一览表 证实一览表8 12 附力 附性9 2 Loam Rohm9 3 Herth Haas10 18 16.0(g) 16.0(q)ppm13 19 20.6(g) 20.6(q)ppm13 25 磷酸缓冲溶液 磷酸溶液15 3 18.8(g) 18.8(q)ppm17 14 Muller Mueller17 19 传染杆菌 腹腔侵染菌17 19 途径 施用途径18 18 非肠道的或非口 肠胃外药剂时服的制剂时，18 26 眼 脸19 17 Actocol Actcol19 22 Actocol Actcol20 2 异丁醇水溶液 异丁醇剥离水溶液20 6 前部分 先流出部分20 7 最后 后20 8 用 过20 8 填充色谱柱进脱 填充的色谱柱，脱盐后，20 9 盐后，然后浓缩， 浓缩，20 25 Actocol Actcol
权利要求
1.生产抗菌素TAN-749A，B，C和D或它们的盐的方法，包括能在培养基中培养能产生一种或多种抗菌素TAN-749A，B，C和D的属于假单胞菌属的微生物，和在培养液中产生和聚积一种或多种抗菌素TAN-749A，B，C和D及这些产物的收集。
2.根据权利要求
1所述的方法，其中的微生物是萤光假单胞菌。
3.根据权利要求
1所述的方法，其中的微生物是萤光假单胞菌YK-437(FERM BP-1005，CGMCC 0094)。
专利摘要
由假单胞菌属微生物产生的抗菌素TAN-749或它的盐，具有抗革兰氏阴性和革兰氏阳性菌包括抗药菌的抗菌活性。因此，能用做哺乳动物细菌传染病的化学治疗药物。
文档编号C07G11/00GK86104019SQ86104019
公开日1987年5月20日 申请日期1986年6月18日
发明者原田节夫, 小野英男 申请人:武田药品工业株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan