专利名称：：一种牛奶中诺氟沙星抗生素残留量的检测方法
技术领域：
：本发明涉及一种检测牛奶中抗生素含量的方法，特别涉及一种牛奶中诺氟沙星抗生素残留量的检测方法。属于分析
技术领域：
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背景技术：
：诺氟沙星是一种广谱高效抗菌药物，在临床上的应用相当广泛。诺氟沙星抗生素对大多数革兰氏阳性菌、大肠杆菌、绿脓杆菌有非常好的抑制活性；对葡萄球菌、衣原体、分支杆菌、支原体和尿属支原体有中等强度的抑制活性；对链球菌(尤其是D族链球菌)、肠球菌及厌氧菌有很小或无抑制活性。随着该类药物的广泛应用及深入研究，有关诺氟沙星药物的不良反应和耐药性报道越来越多，其潜在的严重不良反应逐渐受到人们的重视，作为兽药和饲料添加剂而大量的用于动物，因而其残留在动物可食性产品中的可能性相对很大。这些残留物可直接对人造成危害外，更严重的是低浓度的残留药物可能对诺氟沙星药物敏感的致病菌产生耐药性，从而间接危害人类健康。为保护人类健康，控制诺氟沙星抗生素的残留，美国FDA规定氟诺喹酮类在牛奶中的残留量小于100pg/kg，我国规定的氟诺喹酮在牛奶中的残留量应小于100pg/kg。因此，需要寻求简便、快速、准确检测乳与乳制品中诺氟沙星抗生素残留量的检测方法，才能满足日趋严格的残留限量要求，从而保证人们饮用牛奶的卫生和安全。检测诺氟沙星残留量的方法有微生物法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱法、免疫分析法、高效毛细管区带电泳法和化学发光分析法等。目前，牛奶中诺氟沙星抗生素常用的检测方法主要是高效液相色谱法。但采用此法，检测时间较长，而且高效液相色谱法检测诺氟沙星抗生素的检出限较高(一般高于20pg/kg)。超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪在定量分析中可以根据特征离子和由此特征离子断裂产生的特征碎片作为某一目标化合物的指纹，将它从复杂基质的混合物样品中选择出来进行定量，因此灵敏度高和选择性强，是目标化合物定量分析的金标准。它是食品安全，药代动力学等各种国际法规所规定的标准仪器。超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪能够针对目标化合物电离产生的母离子和子离子进行定量，与传统的高效液相色谱法相比，大大提高了对目标化合物的选择性和灵敏度，且极大的縮短了分析时间，检测一个样品仅需5min左右。超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪的应用前景非常广泛，已被国际上普遍承认。
发明内容本发明的目的是得到一种牛奶中诺氟沙星抗生素残留量的检测方法，其检测时间短，灵敏度高，精密度好。本发明的牛奶中诺氟沙星抗生素残留量的检测方法，包括如下步骤1)制备多个(优选5-10个溶液点，更优选5个溶液点)不同浓度的诺氟沙星抗生素溶液，并对其分别检测，根据所测得的数据，绘制诺氟沙星抗生素的含量与检测结果之间的标准曲线2)对样品用同样的方法进行检测，并得到检测结果；3)将步骤2)中的检测结果与所述的标准曲线图比对，即得到样品中诺氟沙星抗生素含量；4)检测设备为超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪。上述步骤l)中制备溶液的溶剂优选为甲醇。上述多个不同浓度的诺氟沙星抗生素溶液含量优选为100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL和Ong/mL的标准溶液。上述所述的步骤2)中所述样品的处理方法如下a)牛奶样品与pH4.0的Na2EDTA-Mellvaine缓冲溶液按照质量与体积比(g/ml)为l:(4-10)的比例加入，在室温条件下充分涡流l-5min，静置10-20min，充分提取，加入l-5mL50。/。的三氯乙酸混匀后，在转速为10,000rpm、温度为4"的条件下离心5-15min，后得上清液待净化；加入l-5ml50%的三氯乙酸，可以更好地沉淀蛋白，得到较对比文件澄清的上层提取液，在不影响检测结果的同时，为以后的SPE净化作比较好的准备工作。b)用5.0mL甲醇以1.0-2.0mL/min的流速通过固相提取小柱，再用5.0mL超纯水以1.0-2.0mL/min的流速过柱，将上述所得上清液在流速为1.0-2.0mL/min的条件下经固相提取小柱净化和富集，然后用3.0mL的5%的甲醇水溶液以1.0-2.0mL/min的流速过此柱，用真空泵将固相提取小柱抽干；c)向富集目标物质的固相提取小柱中加入6.0mL甲醇洗脱，洗脱流速1.0-2.0mL/min，收集洗脱液，用氮气在40'C水浴下吹干，用l.OmL的50%甲醇溶解，涡旋，经0.22(im微孔滤膜过滤。所述固相分离小柱优选为艾尔杰(Agela)公司的CleanertPEP固相提取小柱。Agela公司的固相提取小柱的特点是加入甲醇或者水之后的流速较快，并且价格较为便宜，考虑到活化完全的小柱的吸附效果较好，所以加入的活化溶剂的体积均为5ml。上述超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪的色谱分离方法如下色谱柱:沃特斯(Waters)公司的ACQUITYUPLCBEHC18色谱柱(2.1mmx50mm，I.D.1.7nm)柱，柱温40°C，流速0.3mL/min;进样体积5pL;流动相梯度如下时间/min流速/(ml/min)乙腈/%0.1%甲酸水/%变化曲线00.3012.088.0Initial1.000.3030.070.063.000.3070.030.063.500.3012.088.01其中，l为即时变化，6为线性变化。上述超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪的质谱条件如下电离方式ES(+)，电离电压3.00KV，源温度110°C，去溶剂气温度:350°C，去溶剂气流量500L/hr，碰撞室压力0.35Pa，电子倍增电压650V，采集方式多反应监测(MRM):化合物母离子子离子锥孔电压/v碰撞能量/eV停留时间(S)诺氟沙星320.2-276.3*30190.05(Norfloxacin)302.330210.05其中，*表示定量离子。本发明的诺氟沙星抗生素检测方法具有如下优点:1)检测时间短。一个样品仅需5min左右。2)灵敏度高。检出限仅为1.0-2都g/Kg，能够满足国际及国内对诺氟沙星抗生素含量特别是痕量诺氟沙星抗生素的检测要求。3)对目标化合物的选择性强，精确定量。超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪根据目标化合物的母离子及经碰撞产生的特征子离子进行定量分析，只有同时满足这两个特征质量选择的目标化合物才能被检测，而且选定的特征裂片离子一定是从选定的母离子产生的，从而排除了样品中可能存在的其它分子的干扰现象。本发明的方法采用三重四极杆的ESI(+)离子源，确定了诺氟沙星的母离子和两个子离子，大大降低了利用高效液相色谱法测定诺氟沙星抗生素可能会出现假阳(阴)性检测结果的机率，从而达对目标化合物精确定量的目的。4)在本发明所色谱及质谱条件下进行测定，在实验浓度范围内，相关系数r能够达到0.999以上，回收率在80-105%之间，日内和日间精密度实验的相对标准偏差(RSD)分别为2.5Q/。和4.0。/。。此法能够排除干扰组分而从复杂基质中提取出目标物质，无论对于具有简单基质还是复杂基质的样品都同样适用，具有适用范围广的优点。图l是本发明的一个实施例的诺氟沙星的总离子流谱图，其横坐标表示时间(min)，纵坐标表示离子流响应信号强度的大小，折合为诺氟沙星目标化合物的离子流强度占总离子流的百分比。图2是本发明的一个实施例的诺氟沙星子离子257.9与302.0的色谱图。其横坐标表示时间(min)，纵坐标表示离子流响应信号强度的大小，折合为诺氟沙星的离子流强度占总离子流的百分比。图3是本发明的一个实施例的诺氟沙星标准曲线图。本图中横坐标表示诺氟沙星的浓度，单位为纳克/毫升(ng/mL);纵坐标表示离子响应信号强度，单位为mv。具体实施例方式下面将结合具体实施方案对本发明的方法做更详细的说明。本领域技术人员应当理解，下述实施例均用于对本发明所要求保护的范围进行实例性的描述，以此概括本发明的各参数的相对范围，因而不能将之理解为对本发明的一种具体限制。实施例l利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪(WatersTQD)测定牛乳中诺氟沙星抗生素诺氟沙星的含量。1)标准溶液的配制精密称取诺氟沙星标准品10mg，用甲醇定容于100mL棕色容量瓶中，混匀，得到诺氟沙星浓度均为10(Vg/mL的标准储备溶液，放置于-18"C冷柜避光保存，至少可以保存4个星期。使用时，稀释成100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL的标准溶液。2)试剂的配制(a)提取液的配制0.2mol/L磷酸氢二钠溶液准确称取28.41g磷酸氢二钠，用水溶解，定容至1000mL。0.1mol/L柠檬酸溶液准确称取21.01g柠檬酸，用水溶解，定容至1000mL。Mellvaine缓冲溶液将1000mL0.1mol/L柠檬酸溶液与0.2mol/L磷酸氢二钠溶液625mL混合，用NaOH调节pH:4.0。0.1mol/LNa2EDTA-Mellvaine缓冲溶液称取60.5g乙二胺四乙酸二钠放入1625mLMellvaine缓冲液中，使其完全溶解。(b)流动相的配制流动相A:乙腈流动相B:0.1%甲酸水溶液3)样品的制备称取5.0000g牛奶样品，置于50mL聚丙烯离心管中，加入25mLNa2EDTA-Mellvaine缓冲溶液提取，在室温条件下充分振摇2min，静置15min，充分提取，再加入2mL50。/。三氯乙酸混匀，10,000rpm温度为4。C的条件下离心10min，得到上清液待净化。用5.0mL甲醇以1.0-2.0mL/min的流速通过艾尔杰(Agela)公司的CleanertPEP(亲水亲油平衡)固相提取小柱，再用10.0mL超纯水以1.02.0mL/min的流速过柱，目的是活化固体小柱。将上述所得滤液在流速为1.02.0mL/min的条件下经固相提取小柱净化和富集，等快干时用用3.0mL5%的甲醇水溶液以1.0-2.0mL/min的流速过此柱除杂。用真空泵将固相提取小柱抽干。加入6mL甲醇洗脱，然后用氮气4(TC吹干，用lmL的50%甲醇溶解，涡旋，经0.22nm微孔滤膜过滤后用于高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪分析。4)色谱条件色谱柱沃特斯(Waters)公司的ACQUITYUPLCBEHC18色谱柱(2.1mmx50mm,I.D,1.7(xm)柱，柱温40。C，流速0.3mL/min;进样体积5|iL;流动相梯度如下时间/min流速/(ml/min)乙腈/%0.1%甲酸水/%变化曲线00.3012.088.0Initial1.0003030.070.063.000.3070.030.063.500.3012.088.01其中，l为即时变化，6为线性变化。5)质谱条件电离方式ES(+)，电离电压3.00KV，源温度ll(TC，去溶剂气温度:350°C，去溶剂气流量500L/hr，碰撞室压力0.35Pa，电子倍增电压650V，采集方式多反应监测(MRM):化合物母离子子离子锥孔电压/V碰撞能量/eV停留时间(S)诺氟沙星320.2-276.3*30190.05(Norfloxacin)302.330210.05其中，*表示定量离子。6)检测步骤a)标准曲线的绘制利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪测定不同浓度的诺氟沙星标准溶液。提取总离子流如图l所示，其横坐标为时间(min)，纵坐标表示离子流响应信号强度的大小，折合为诺氟沙星目标化合物的离子流强度占总离子流的百分比。由图l可以看出诺氟沙星的保留时间为1.98min。从图l的总离子流图中分别提取诺氟沙星定量离子与定性离子的离子对色谱图，结果见图2，其横坐标为时间(min)，纵坐标表示离子响应信号强度的大小，单位nw。其中，图2诺氟沙星定量离子257.9与定性离子302.0的色谱图。利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪测定不同浓度的诺氟沙星标准溶液(100ng/mL，50ng/mL，20ng/mL，lng/mL，Ong/mL)进行检观[)，根据所得数据，绘制标准曲线图，结果见图3。其中，图3为诺氟沙星标准曲线图，横坐标表示浓度，单位为纳克/亳升(ng/mL)，纵坐标表示响应信号强度的大小，单位为mv。根据诺氟沙星的标准曲线图，确定线性方程及线性相关系数，以信噪比等于3时对应的浓度为检出限，具体结果见表l。表l诺氟沙星的线性方程及检出限<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>采用多反应监测(MRM)采集方式，在实验浓度范围内，相关系数r=0.9992，回收率在80-105%之间，日内和日间精密度实验的相对标准偏差(RSD)分别为2.5。/。和4.00/0。b)样品测定利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱检测制备好的待测样品，得到诺氟沙星的图谱，分别将诺氟沙星的相应信号值的结果套入标准曲线方程，即可分别得到样品中诺氟沙星的浓度(ng/mL)，以一未知样品按照本发明的样品制备方法进行处理后，在本发明的检测条件下进行测定，得到样品中诺氟沙星的响应值y为983，代入诺氟沙星的标准曲线方程y=47.1626x一184.586，则此样品中诺氟沙星的浓度为2.3纳克/毫升(ng/mL)。实施例2利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪(WatersTQD)测定牛乳中诺氟沙星的含量。1)标准溶液的配制同实施例l中标准溶液的配制。2)试剂的配制(a)提取液的配制同实施例l。(b)流动相的配制同实施例l。3)样品的制备称取5.0000g牛奶样品，置于50mL聚丙烯离心管中，加入20mLNa2EDTA-Mellvaine缓冲溶液，在室温条件下充分振摇2min，静置15min，充分提取，再加入lmL50。/。三氯乙酸混匀，10,000rpm、4。C下离心10min，得到上清液待净化。用5.0mL甲醇以1.0-2.0mL/min的流速通过固相提取小柱，再用10.0mL超纯水以1.0-2.0mL/min的流速过柱，目的是活化固体小柱。将上述所得上清液在流速为1.0-2.0mL/min的条件下经固相提取小柱净化和富集，等快干时用3.0mL5%的甲醇水溶液以1.0-2.0mL/min的流速过此柱除杂。用真空泵将固相提取小柱抽干。加入6mL甲醇洗脱，然后用氮气40。C吹干，用lmL50。/。甲醇溶解，涡旋，经0,22^im微孔滤膜过滤后用于高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪分析。4)色谱条件同实施例l。5)质谱条件同实施例l。6)检测步骤a)标准曲线的绘制利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪测定不同浓度的诺氟沙星标准溶液。提取总离子流如图l所示。由图l可以看出诺氟沙星的保留时间为1.98min。从图l的总离子流图中分别提取诺氟沙星定性离子与定量离子的离子色谱图，结果见图2。其中，图2诺氟沙星子离子302.0与275.9的色谱图。禾,超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪测定不同浓度的诺氟沙星标准溶液(100ng/mL，50ng/mL，20ng/mL，10ng/mL，5ng/mL)进行检测，根据所得数据，绘制标准曲线图。根据诺氟沙星的标准曲线图，确定线性方程及线性相关系数，以信噪比等于3时对应的浓度为检出限，具体结果见表2。表2诺氟沙星线性方程及检出限化合物线性方程线性相关系数检出限(S/N^3)(y=ax+b)(r)(Kg)诺氟沙星Y=47.1626X—184.5860.99922.0用多反应监测(MRM)采集方式，在实验浓度范围内，相关系数r能够达到0.9992以上，回收率为80%-105。/。之间，日内和日间精密度实验的相对标准偏差(RSD)分别为2.9。/。和5.1。/。。b)样品测定利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱检测制备好的待测样品，得到诺氟沙星的图谱，将结果套入标准曲线方程，得到样品中诺氟沙星的含量为0吗/Kg。实施例3利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪(WatersTQD)测定牛乳中诺氟沙星的含量。1)标准溶液的配制同实施例l。2)试剂的配制(a)提取液的配制同实施例l(b)流动相的配制同实施例l3)样品的制备称取3.0000g牛奶样品，置于50mL聚丙烯离心管中，加入30mLNa2EDTA-Mellvaine缓冲溶液，在室温条件下充分振摇2min，静置15min，充分提取，再加入5mL50。/。三氯乙酸混匀，10,000rpm、4。C下离心10min，得到上清液待净化。用5.0mL甲醇以1.0-2.0mL/min的流速通过固相提取小柱，再用10.0mL超纯水以1.0-2.0mL/min的流速过柱，目的是活化固体小柱。将上述所得上清液在流速为1.0-2.0mL/min的条件下经固相提取小柱净化和富集，等快干时用3.0mL5。/。的甲醇水溶液以1.0-2.0mL/min的流速过此柱除杂。用真空泵将固相提取小柱抽干。加入6mL甲醇洗脱，然后用氮气4(TC吹干，用lmL50n/。甲醇溶解，涡旋，经0.22pm微孔滤膜过滤后用于高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪分析。4)色谱条件同实施例l。5)质谱条件同实施例l。6)检测步骤a)标准曲线的绘制利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪测定不同浓度的诺氟沙星标准溶液。提取总离子流如图l所示。由图l可以看出诺氟沙星的保留时间为1.98min。从图l的总离子流图中分别提取诺氟沙星定性离子与定量离子的离子色谱图，结果见图2。其中，图2诺氟沙星子离子302.0与275.9的色谱图。利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪测定不同浓度的诺氟沙星标准溶液(100ng/mL，50ng/mL，20ng/mL，10ng/mL，5ng/mL)进行检测，根据所得数据，绘制标准曲线图。根据诺氟沙星的标准曲线图，确定线性方程及线性相关系数，以信噪比等于3时对应的浓度为检出限，具体结果见表3。表3诺氟沙星线性方程及检出限<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>采用多反应监测(MRM)采集方式，在实验浓度范围内，相关系数r能够达到0.9992以上，回收率为80%-105%之间，日内和日间精密度实验的相对标准偏差(RSD)分别为2.9。/。和5.1。/。。b)样品测定利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱检测制备好的待测样品，得到诺氟沙星的图谱，将结果套入标准曲线方程，得到样品中诺氟沙星的含量为0吗/Kg。权利要求1.一种牛奶中诺氟沙星抗生素残留量的检测方法，其特征在于，包括如下步骤1)制备多个不同浓度的诺氟沙星抗生素溶液，并对其分别检测，根据所测得的数据，绘制诺氟沙星抗生素的含量与检测结果之间的标准曲线图；2)对样品用同样的方法进行检测，并得到检测结果；3)将步骤2)中的检测结果与所述的标准曲线图比对，即得到样品中诺氟沙星抗生素含量；4)所述检测的设备为超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪。2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤l)中制备溶液的溶剂为甲醇。3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤l)中制备的不同浓度的诺氟沙星抗生素溶液具有5—10个溶液点。4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述多个不同浓度的诺氟沙星抗生素溶液含量为100ng/mL，50ng/mL，20ng/mL，10ng/mL，5ng/mL和Ong/mL的标准溶液。5.如权利要求1-4中任意一项所述的检测方法，其特征在于所述的步骤2)中所述样品的处理方法如下a)牛奶样品与pH4.0的Na2EDTA-Mellvaine缓冲溶液按照质量体积比(g/ml)为l:(4-10)的比例加入，在室温条件下充分振摇l-5min，静置10-20min，充分提取，加入l-5mL50%的三氯乙酸混匀，在转速为10,000rpm、温度为4°C的条件下离心5-15min，后得上清液待净化；b)用5.0mL甲醇以1.0-2.0mL/min的流速通过PEP固相提取小柱，再用10.0mL超纯水以1.0-2.0mL/min的流速过柱，将上述所得上清液在流速为1.0-2.0mL/min的条件下经固相提取小柱净化和富集，然后用3.0mL的5%的甲醇水溶液以1.0-2.0mL/min的流速过此柱，用真空泵将固相提取小柱抽干；c)向富集目标物质的固相提取小柱中加入6.0mL甲醇洗脱，洗脱流速1.0-2.0mL/min，收集洗脱液，用氮气在4(TC水浴下吹干，用l.OmL的50%甲醇溶解，涡旋，经0.22iam微孔滤膜过滤。6.7.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述固相分离小柱为艾尔杰(Agela)公司的CleanertPEP固相提取小柱。如权利要求5所述的检测方法，其特征在于所述超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪的色谱分离方法如下色谱柱沃特斯(Waters)公司的ACQUITYUPLCBEHC18色谱柱(2.1mmx50mm,I.D.1.7fim)柱，柱温40°C，流速0.3mL/min;进样体积5pL;流动相梯度如下<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>变化曲线Initial661其中，l为即时变化，6为线性变化。8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于所述超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪的质谱条件如下电离方式ES(+)，电离电压3.00KV，源温度ll(TC，去溶剂气温度350°C，去溶剂气流量500L/hr，碰撞室压力0.35Pa，电子倍增电压,650V,采集方式多反应监测(MRM):<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>其中，*表示定量离子,全文摘要本发明涉及一种牛奶中诺氟沙星抗生素残留量的检测方法。本发明利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪测定诺氟沙星抗生素残留量。样品经Na<sub>2</sub>EDTA-Mellvaine缓冲液(pH4.0)提取，三氯乙酸除蛋白，经PEP固相提取小柱净化和富集，采用色谱柱分离，柱温30℃，以含有0.1％甲酸的水溶液(v/v)和乙腈为流动相进行梯度洗脱，采用多反应监测方式进行定量。仪器检出限为1.0-2.0μg/Kg，在1-100μg/Kg的线性范围内，相关系数r可达0.999以上，回收率为80％-105％(添加水平为10，50，100μg/Kg)。此法具有快速、准确、灵敏度高、适用范围广的优点。文档编号G01N30/72GK101609073SQ20091016259公开日2009年12月23日申请日期2009年8月4日优先权日2009年8月4日发明者刘卫星,涛崔,常建军,张雪峰申请人:内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司