一种基于阵列式传感器的抗生素多残留检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种基于阵列传感器的抗生素多残留检测方法，该阵列式传感器由一个圆形的电极盘组成，中心位置有对电极和参比电极，外围是工作电极，测试液中测定的是工作电极与对电极之间的阻抗值。该阵列式传感器工作电极使用壳聚糖和纳米金胶修饰电极后，将各类抗生素适配体固定在相应的工作电极表面，与实际的样品接触后，根据各个传感器阻抗值的变化来确定是否有抗生素超标，并确定抗生素的种类。本发明的抗生素残留检测方法可配合抗生素快速检测仪使用，实现抗生素多残留在线快速检测，具有实用性强、携带方便、检测精度高、检测快速准确、易操作等特点，非常适合对抗生素残留进行现场快速检测的场合。
【专利说明】一种基于阵列式传感器的抗生素多残留检测方法【技术领域】
[0001]本发明涉及一种抗生素多残留检测方法。属于农产品安全检测【技术领域】。
[0002]近年来，随着我国畜牧养殖业的迅速发展，奶产量大幅度提高，新鲜牛奶和奶制品已经成为人民(尤其是老人和儿童)生活食品中的重要组成部分。然而，抗生素在现代畜牧业中的广泛应用，不可避免地造成牛奶中抗生素残留。若长期饮用含有抗生素的牛奶，无疑是等于长期服用小剂量的抗生素，对抗生素过敏体质的人服用残留抗生素的牛奶后可引发过敏反应。正常饮用者，会导致体内的某些条件性致病菌易产生耐药性，一旦患病再用同种抗生素治疗很难奏效。抗生素残留不仅危害人类健康，同时也影响牛奶的品质，造成经济损失。由于奶牛乳腺炎发病率较高，用抗生素来治疗乳腺炎等产科疾病仍较普遍，这容易导致在牛奶中抗生素的残留。过量使用抗生素不可避免会使母体代谢产物等相关抗生素残留于动物的肌肉、蛋、奶、脏器组织中，进而通过食物链影响人体健康。可见，加强对牛奶等农产品中抗生素残留的检测，尤其是保障人类健康有着十分深远的意义。
[0003]传统的抗生素残留检测方法主要有:气相色谱(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、色谱/质谱联用技术(GC/LC-MS)、毛细管电泳法(CE)、荧光分析、酶联免疫法(ELISA)。这些方法虽然选择性好、灵敏度高、准确度高、检出限低，可同时检测多种元素或化合物，但其需要昂贵的仪器设备，样品前处理过程繁琐、费时，并且对分析人员的技术水平要求很高，不适于现场快速检测。与传统的分析方法相比，免疫传感器具有如下特点:(1)较高的选择性，因此不需要对被测组分进行分离，即不用对样品进行预处理。(2)结构简单，体积小，使用方便，特别是便携式的免疫传感器，非常有利于农产品安全质量的快速测定。(3)可实现连续在线检测，使食品加工过程的质量控制 变得简便。(4)响应速度快，样品用量少，与其他大型分析仪器相比，免疫传感器制作成本低，且可反复使用。
[0004]发明的目的在于针对现有技术的不足，设计提供一种基于阵列式传感器的抗生素残留检测方法，具有检测快速准确、操作简单、可实现多残留同时检测等特点。
[0005]所述的一种基于阵列式传感器的抗生素残留检测仪其检测原理为:利用适配体与抗生素之间的特异性免疫反应，以适配体作为识别元件，采用固定化技术在工作电极表面固定不同种类的抗生素适配体，通过模拟多路开关使阵列式传感器中的一个工作电极与共用的参比电极和对电极接通。通过传感器在测试底液中导致的阻抗变化来确定样品中含有何种抗生素，并根据不同抗生素产生阻抗变化的标准曲线，确定样品中的抗生素的含量。
[0006]为达到以上目的，阵列式传感器采取以下技术方案实现:由一个圆形的电极盘组成，中心位置有对电极和参比电极，外围是工作电极，以确保对电极、参比电极与各工作电极的距离相等，使各个工作电极与对电极之间的有相等的阻抗值。在工作电极与参比电极之间加300毫伏的工作电压，测试液中测定的是工作电极与对电极之间的阻抗值。使用模拟多路开关确定哪一路工作电极接通。
[0007]为了实现上述目的，本发明提供的一种基于阵列式传感器的抗生素多残留检测方法，工作电极使用纳米材料进行修饰以保证适配体更好的固定到工作电极表面。阵列式电极的修饰采取以下技术方案实现:取2 y L制备好的壳聚糖滴涂在预处理好的阵列式工作电极表面，常温干燥，用PH=7.5的PBS缓冲液冲洗电极表面。电极表面晾干后，取2 ii L纳米金胶滴涂在电极表面，常温下静置至干燥，然后用超纯水冲洗表面物理吸附的纳米金，氮气吹干。
[0008]为了实现上述目的，本发明提供的一种基于阵列式传感器的抗生素多残留检测方法，阵列式工作电极上适配体的固定方法采取以下技术方案实现:然后将2 y L 5mM的抗生素适配体滴在上述经纳米材料修饰好的电极上，4h后用超纯水冲洗表面，晾干待用。将固定抗生素适配体的电极浸于用IM的巯基乙醇封闭lh，以封闭非特异性结合位点，阵列式适配体传感器制作完成，保存在4° C条件下备用。
[0009]本发明的一种基于阵列式传感器的抗生素多残留检测方法，具体检测过程如下:在使用前将阵列式传感器工作电极表面使用多壁碳纳米管等纳米材料进行化学修饰，提高传感器检测的灵敏度，之后在阵列式免疫传感器工作电极表面分别固定不同种类的适配体。然后将阵列式适配体传感器放入冰箱中，4° C下保存备用。使用时打开抗生素多残留检测仪的电源开关，将阵列式传感器放入测试底液中测量初始阻抗值Al，并保存。将免疫传感器放入事先处理好的样品液中孵化10分钟，再将传感器连接至检测仪进行阻抗测量，获取第二次测量的阻抗值A2，微控制器将其送至显示屏显示。计算出变化率，变化率计算公式如下:
变化率=|A1-A2|/A1
如果样品液中含有抗生素，则含相应抗生素的工作电极发生特异性免疫反应，导致反应后的相应传感器阻抗值明显增大。Al与A2的差值越大，表明检测溶液中的含有某种抗生素残留的浓度越高。对比标准曲线得到样品中抗生素残留的浓度，可以获得实际样品中含有何种抗生素残留，及是否超标等信息。
[0010]本发明提供的一种基于阵列式传感器的抗生素多残留检测方法应用到农产品中的抗生素残留快速检测领域，可实现抗生素残留的定性定量检测，可以为检测人员带来极大的便利，能够充分满足抗生素残留现场快速检测的要求。
【具体实施方式】
[0011]所述的阵列式传感器由一个圆形的电极盘组成，中心位置有对电极和参比电极，外围是工作电极，以确保对电极、参比电极与各工作电极的距离相等，使各个工作电极与对电极之间的有相等的阻抗值。在工作电极与参比电极之间加300毫伏的工作电压，测试液中测定的是工作电极与对电极之间的阻抗值。使用模拟多路开关确定哪一路工作电极接通。
[0012]阵列式传感器工作电极的修饰与适配体的固定方法如下:(I)壳聚糖的制备:首先配置1% (I ml/100 ml water)的醋酸溶液并用配好的醋酸溶液作为溶剂制备50 ml1% (I g/100 ml)的壳聚糖溶液。(2)纳米金胶的制备采用柠檬酸三钠热还原氯金酸(HAuCl4)的方法。所有的玻璃器皿均用王水浸泡，洗涤干净备用。配置100 mL 0.01%的氯金酸溶液，在剧烈搅拌下加热至沸腾，然后迅速加入2.5 mL 1%柠檬酸三钠溶液，继续搅拌20min(此间溶液由淡黄色转为无色，然后变灰黑色，最后成酒红色)，除去热源后继续搅拌至室温下慢慢冷却。将冷却后的金胶溶液置于干净的棕色玻璃瓶中于4° C冰箱中避光保存备用，数月有效。⑶阵列式电极的清洗:电极修饰前，首先浸入热的“Piranha”溶液(H2SO4:30% H2O2 = 3:1)中浸泡15min，用水清洗干净，接下来用0.3iim、30nm的Al2O3浆在麂皮上抛光至镜面，抛光后用去离子水洗去除表面污物，再移入超声水浴中清洗，每次5min，重复二次，然后依次用6mol/L的HNO3、无水乙醇和去离子水超声清洗，氮气环境下干燥。(4)电极的活化:彻底清洗后，电极在0.5mol/L H2SO4溶液中用循环伏安法活化，扫描范围1.0V?-1.0V，反复扫描直至达到稳定的循环伏安图为止。(5)预处理好的电极测试:在含有1X10—3 mol/L K3 [Fe (CN)6]的0.20 mo I/L KNO3溶液中跑循环伏安曲线，以测试所述玻碳电极的性能，扫描速度50mV/S，扫描范围为-0.1V?0.6V ;当所述循环伏安曲线中的峰电位差在SOmV以下，并尽可能接近64mV，所述玻碳电极可使用，否则要重新返回步骤(3)中，处理所述电极，直到符合要求。(6)取2 UL制备好的壳聚糖滴涂在预处理好的阵列式电极表面，常温干燥，用PH=7.5的PBS缓冲液冲洗电极表面。(7)电极表面晾干后，取2 u L纳米金胶滴涂在电极表面，常温下静置至干燥，然后用超纯水冲洗表面物理吸附的纳米金，氮气吹干。(8)然后将2 L 5mM的适配体滴在上述经纳米材料修饰好的电极上，4h后用超纯水冲洗表面，晾干待用。(9)最后上述制备好的电极浸于用IM的巯基乙醇封闭lh，以封闭非特异性结合位点，适配体传感器制作完成，保存在4° C条件下备用。
[0013]本发明的一种基于阵列式传感器的抗生素多残留检测方法，具体检测过程如下:在使用前将阵列式传感器工作电极表面使用多壁碳纳米管等纳米材料进行化学修饰，提高传感器检测的灵敏度，之后在阵列式免疫传感器工作电极表面分别固定不同种类的适配体。然后将阵列式适配体传感器放入冰箱中，4° C下保存备用。使用时打开抗生素多残留检测仪的电源开关，将阵列式传感器放入测试底液中测量初始阻抗值Al，并保存。将免疫传感器放入事先处理好的样品液中孵化10分钟，再将传感器连接至检测仪进行阻抗测量，获取第二次测量的阻抗值A2，微控制器将其送至显示屏显示。计算出变化率，变化率计算公式如下:
变化率=|A1-A2|/A1
如果样品液中含有抗生素，则含相应抗生素的工作电极发生特异性免疫反应，导致反应后的相应传感器阻抗值明显增大。Al与A2的差值越大，表明检测溶液中的含有某种抗生素残留的浓度越高。对比标准曲线得到样品中抗生素残留的浓度，可以获得实际样品中含有何种抗生素残留，及是否超标等信息。
[0014]本发明的一种基于阵列式传感器的抗生素多残留检测方法适合于抗生素多残留检测仪中操作使用，本发明操作工艺简单，检测时间较短，可实现抗生素残留的定性定量测量，具有灵敏度高，稳定性好、重现性好等优点，符合我国抗生素残留快速检测技术发展和国际化要求。
【权利要求】
1.一种基于阵列式传感器的抗生素多残留检测方法，其特征在于所述的阵列式传感器，由一个圆形的电极盘组成，中心位置有对电极和参比电极，外围是工作电极，以确保对电极、参比电极与各工作电极的距离相等，使各个工作电极与对电极之间的有相等的阻抗值，在工作电极与参比电极之间加300毫伏的工作电压，在用纳米复合材料修饰的工作电极表面固定不同种类的抗生素适配体，通过传感器在测试底液中导致的阻抗变化来确定样品中含有何种抗生素，并根据不同抗生素产生阻抗变化的标准曲线，确定样品中的抗生素的含量。
2.根据权利要求1所述的一种基于阵列式传感器的抗生素多残留检测方法，阵列式传感器工作电极表面电极的修饰方法如下:取L制备好的壳聚糖滴涂在预处理好的阵列式工作电极表面，常温干燥，用PH=7.5的PBS缓冲液冲洗电极表面，电极表面晾干后，取2UL纳米金胶滴涂在电极表面，常温下静置至干燥，然后用超纯水冲洗表面物理吸附的纳米金，氮气吹干。
3.根据权利要求1所述的一种基于阵列式传感器的抗生素多残留检测方法，其特征在于所述的阵列式传感器的适配体固定方法如下:将2 L 5 mM的抗生素适配体滴在修饰好的阵列式工作电极表面，4 h后用超纯水冲洗表面，晾干待用；最后将固定抗生素适配体的电极浸于用IM的巯基乙醇封闭I h，以封闭非特异性结合位点，阵列式适配体传感器制作完成，保存在4° C条件下备用。
【文档编号】G01N27/02GK103558256SQ201310577165
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月19日 优先权日:2013年11月19日
【发明者】郭业民, 王相友, 孙霞, 刘君峰, 贾彗樱 申请人:山东理工大学