核酸的分离的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及改进的用于处理和分析样品的组合物和方法。尤其是，本发明设及用 于从生物样品中释放核酸使得直接下游处理核酸的组合物、方法和试剂盒。运些组合物、方 法和试剂盒可用于诊断、分期（staging)、或另外表征各种疾病。
【背景技术】
[0002] 微流体系统（microfluidicsystems)和结合的微流体-微流体系统对于诊断引 人注目并提供了资源有限的设置，因为它们使用包括将样品预处理、样品/试剂操作、分 离、反应、和检测整合成单一平台的整体分析方案。目前用于裂解细胞的方法基于机械裂 解、热裂解、化学裂解或电裂解。一旦将细胞或样品裂解，或核酸从样品中释放，微流体传感 系统要求将核酸在传递给传感器之前纯化或浓缩。较宽范围的核酸提取方法是可用的，每 种方法采用不同的化学类型并对特殊样品类型进行优化。因为它们复杂的特性，所W大部 分现有的提取方法对于结合在微流体平台中不是适合的或者在提取步骤过程中导致核酸 的显著损失。
[0003] 从个体取得各种生物样品W评价疾病诊断或预后的指示。新鲜组织样本、固定 和包埋样品和细针抽吸活组织检查（FNA)是用于获得分子W及临床信息的有价值的材料 资源，因为它们经常来自收集的人类样本用于组织学活组织检查的检测来检测疾病。用固 定剂处理组织，所述固定剂制备样品用于许多（免疫）组织化学程序，经受许多核酸和氨 基酸之间的交联修饰（ChawY.F.Eetal.Biochemistry1980, 19:5525-5531;MetzB.et al.J.Biol.化em2004. 279:6235-6243)。然后将固定的组织装入包埋材料（如琼脂、明胶 或蜡）块中，其变硬并将其切成小至1-2个细胞层厚的切片用于组织学研究。与来自其他 样品资源的核酸提取相比，来自固定和包埋样品切片的核酸提取需要去除包埋材料的额外 步骤。
[0004] 使用福尔马林固定剂和石蜡包埋（paraffinembedding)(FFP巧来固定和保存 组织样品是最常用的。许多溶解石蜡并从FFPE样品中释放核酸的常规方案是可用的 佑1化6的祀1'.口.6131.，口1^〇8 0116 2007,2化）：6537)。传统去石蜡方法^使用有机溶剂， 通常是二甲苯的液化步骤开始，接着是核酸提取步骤（Goezletal.,Biochemicaland Bio地ysicalResearchCommunication1985,Vol. 130No.I,pll8_126)。二甲苯具有易燃、 挥发、有毒和与塑料不相容的主要缺点，使得其较少适合用于自动化系统。 阳0化]来自组织切片样品的核酸制备通常需要蛋白酶步骤，最常见是与热稳定的蛋白酶 一起在表面活性剂存在下解育，W释放核酸并降解能干扰下游核酸分析的抑制剂。所释放 的核酸的量时常是微小的，因为在切片中存在非常少的真实组织，并且，在FFPE组织切片 的情况中，核酸经常降解掉。结果，在常规方法中，在自动化系统中最经常需要将核酸在递 送至下游传感器之前进行浓缩。
[0006] 已经开发用于去石蜡的非毒性溶液并且在实验室规模水平（例如，来自Trimgen 的WAXFREE?试剂盒、来自AmplificationTechnologies的ExpressArtFFPEClear RNAready试剂盒、来自MoBioL油oratories的BiOstic?FFPE组织分离试剂盒W及来自Epicentre的如ic陆xtract?FFPEDNA提取试剂盒）可用于改进在FFPE样品上适用的核 酸回收方法。
[0007] 在W02012/075133中描述了一种运样的改进，并且运样的改进提供了用于从包埋 在疏水基质如石蜡或石蜡共混物中的样品中原位核酸分离的方法。乳化的裂解物在热稳 定蛋白酶，和选自亚烷基二醇、聚亚烷基丙S醇、或具有76至2900化的平均分子量的嵌段 共聚物、或盐的添加剂存在的情况下就此产生。不同添加剂用于乳化样品，包括PEG200、 阳G400、阳G1000、Brij30、化ij35P、化ij56和化ij76。在溫和离液剂（如脈或甲酯胺） 存在下并加热而获得乳化的裂解液。该方法评估了在去石蜡步骤中物理分离石蜡和使用有 机溶剂如二甲苯的需要。然而，后续从乳化裂解物残余中提取核酸要求进一步的下游应用 如例如通过聚合酶链反应定量核酸，而运样的方法可能与微流体系统不相容。
[0008] 将核酸提取方案整合到微流体平台中需要很大的努力W优化产率并将核酸损失 最小化。此外，在样品制备操作中提取也是消耗时间的步骤。另外，提取在洗脱核酸中引入 一定大小的偏差I(损失较小的片段），运在从含有降解的核酸的FFPE样品中分离核酸时尤 其是成问题的。因此，统一适用于在允许自动化微流体系统处理和直接下游分析（direct downstreamanalysis)的条件下从宽范围的生物样品包括FFPE样品获得核酸的方法与现 有方法相比将提供巨大优势。尤其是，在允许自动化微流体系统处理和直接下游分析、没有 损失一些核酸片段和引入长度和纯度偏差的风险的条件下的FF阳样品，与现有方法相比 将提供巨大优势。
[0009] 因此需要改进样品制备方法，允许自动化高通量处理和检测各种生物样品中的核 酸。
【发明内容】
[0010] 本发明提供了在与下游应用如扩增过程相交接（交界，interface)的环境中从生 物样品中释放的核酸。本文所描述的组合物和方法消除了在下游核酸分析之前分离核酸提 取步骤的需要。样品制备方法和组合物能够自动地处理并且特别适用于在微流体核酸诊断 系统中实施。本发明克服了常规技术中的缺点，并可实现通过常规方法不能预期的其他优 点。
[0011] 尤其是，本发明提供了在微流体系统中在与下游应用如扩增过程相交接的环境中 从生物样品中释放的核酸。本文所描述的组合物和方法消除了分离核酸提取步骤的需要， 并消除核酸提取步骤的需要，减少潜在偏差，并消除在下游核酸分析之前稀释释放的核酸 的需要。
[0012] 总的来说，本发明的一个方面提供了一种用于从生物样品中释放核酸使得能够在 微流体系统中进行直接核酸分析的方法，包括W下步骤：
[0013] -将样品与组合物在条件下接触W提供与下游核酸分析系统相容的裂解物。
[0014] 尤其是，本发明的一个方面提供了一种用于从生物样品中释放核酸使得能够在微 流体系统中进行直接核酸分析的方法，包括W下步骤：
[0015] -将样品与组合物在条件下接触W提供与下游核酸分析系统相容的裂解物，W及
[0016] -在裂解物中直接分析核酸。
[0017] 更具体地，本发明的一个方面提供了一种用于从生物样品中释放核酸使得能够在 微流体系统中直接核酸分析的方法，包括W下步骤：
[0018] -将样品与组合物在条件下接触W提供与下游核酸分析系统相容的裂解物，
[0019] -在微流体系统中处理裂解物用于核酸分析，W及
[0020] -在裂解物中直接分析核酸。
[0021] 更具体地，本发明的一个方面提供了一种用于从生物样品中释放核酸使得能够在 微流体系统中直接核酸分析的方法，包括W下步骤：
[0022] -将样品与组合物在条件下接触W提供与下游核酸分析系统相容的裂解物，W及
[0023] -在微流体系统内在未稀释或最低程度稀释的裂解物中直接分析核酸。
[0024] 更具体地，本发明的一个方面提供了一种用于从生物样品中释放核酸使得能够在 微流体系统中直接核酸分析的方法，包括W下步骤：
[0025] -将样品与组合物在条件下接触W提供与下游核酸分析系统相容的裂解物，
[00%]-在微流体系统中处理裂解物用于核酸分析，W及
[0027] -在微流体系统内在未稀释或最低程度稀释的裂解物中直接分析核酸。
[0028] 尤其是，本发明的一个方面提供了用于释放包含在生物样品中的核酸的方法，所 述方法包括W下步骤：
[0029] -将生物样品与组合物接触用于将样品的至少部分转化成包含所述核酸的裂解 物，所述裂解物能通过微流体系统直接运送；
[0030] -在微流体系统内分析包含在裂解物中的核酸。
[0031] 更具体地，本发明的一个方面提供了用于释放包含在生物样品中的核酸的方法， 所述方法包括W下步骤：
[0032] -将生物样品与组合物接触用于将样品的至少部分转化成包含所述核酸的裂解 物，所述裂解物能通过微流体系统直接运送；
[0033] -在微流体系统内在裂解物中直接分析核酸。
[0034] 本发明的方法包括发明方法和一起工作用于增强核酸检测敏感度和准确度的组 合物的组合。
[0035] 因此本发明还有的一个方面提供了用于在微流体系统中分析从生物样品中释放 的核酸的方法，所述方法包括W下步骤：
[0036] -将样品与组合物在条件下接触W提供与下游核酸分析系统相容的裂解物，W及
[0037] -在裂解物中直接分析核酸。
[0038] 优选地，在所有方面，在微流体系统中在裂解物中直接分析核酸。
[0039] 本发明的另一个方面提供了用于在微流体系统中分析从生物样品中释放的核酸 的方法，所述方法包括W下步骤：
[0040] -将样品与组合物在条件下接触W提供与下游核酸分析系统相容的裂解物，
[0041] -在微流体系统中处理裂解物用于直接核酸分析，W及
[0042] -在裂解物中直接分析核酸。
[0043] 在具体的实施方式中，本发明的方法适用于新鲜组织样品和/或新鲜冷冻组织样 品和/或固定组织样品和/或包埋组织样品。在具体的实施方式中，生物样品是活组织检 查样品化iopsysample)、固定样品（fixedsample)、蜡包埋样品（wax-embeddedsample) 和/或FFPE样品。
[0044] 在具体的实施方式中，用于本发明的方法的组合物具有液化性质（liquefying property)。在优选的实施方式中，该方法适用于从包含生物样品的蜡中液化或溶解蜡。
[0045] 在具体的实施方式中，用于本发明的方法的组合物具有的性质类似于目前所描述 组合物的必要性质。
[0046] 因此，在本发明的另一个方面，提供了用于从生物样品中释放核酸能够在微流体 系统中直接核酸分析的组合物，所述组合物包含与下游核酸分析系统相容的表面活性剂。 优选地，提供用于从生物样品中释放核酸W形成裂解物的组合物，能够在微流体系统中在 该裂解物中直接核酸分析，所述组合物包含与下游核酸分析系统相容的表面活性剂。优选 地，组合物当与样品接触时提供裂解物，所述裂解物W其未稀释形式与下游核酸分析系统 相容。优选地，裂解物W其未稀释形式或轻微稀释形式与下游核酸分析系统相容。在优选 的实施方式中，组合物具有乳化性质并包含与下游核酸分析系统相容的非离子型表面活性 剂。优选地，非离子型表面活性剂具有式R-O-畑2邸2〇)孔其中n〉7,n> 8,或n= 8 ;R包含 12《C《38,R是烷基链，R是邸3 (邸2)广CH=CH-(邸2) 8,或者R是（邸2) 11 (邸3)。优选地， 离子表面活性剂是C13 (异-十S烷基）脂肪醇PEG酸或油醇PEG酸。最优选地，表面活性 剂是Ole化?-8 (油醇聚離⑩-8 )。Ole化?-8对应于狂)-3, 6, 9, 12, 15, 18, 21，24-八 氧杂四十二烧-33-締-1-醇（狂)-3,6,9, 12, 15, 18,21，24-〇ctaoxadotetracont-33-en-l -ol)(CAS编号 27040-03-5)。
[0047] 在一些实施方式中，组合物包括至少非离子型表面活性剂、热稳定的蛋白酶和抑 缓冲剂，并且尤其用于在加热下与包含蜡的样品接触产生乳化的裂解物，其乳化的裂解物 W其未稀释形式与微流体系统相容并且能够被微流体系统直接处理用于核酸分析。优选 地，W其未稀释形式或轻微稀释形式的乳化的裂解物与微流体系统相容并且能够被微流体 系统直接处理用于核