mFFPE切片的 DNA产率。利用QiagenQIAampDNAFF阳组织试剂盒根据生产商的使用说明实施基于柱 的DNA提取。洗脱后，将所提取的DNA的体积调整至ImlW允许与液化DNA进行比较。利 用如bitdsDNABR测试试剂盒在如bit巧光计2. 0上根据生产商的使用说明测定DNA浓 度。ACq化iq-Extr)代表液化的和柱提取的DNA之间的Cq差值；Cq值基于Hamfjord 等人值iagnMolF*athol2011;20:158 - 165)通过实施用于野生型BRAF基因的基于 TaqMan?的qPCR反应来获得。结果示出在表1中。
[0133]表 1:DNA产率和ACq化iq-Extr) 阳134]
[013引如在表I中所示的，除了样品2W外，对于所有样品来说，利用液化方法的DM产 率较高，在样品2中按照提取方法的DNA产率与按照本发明的液化方法的DNA产率相比较 高。另外，如在表1的最右列示出的，通过液化和基于柱的提取所获得的DNA之间的Cq值 差值表明在液化条件下能够扩增目标DNA的更多拷贝数。与DNA定量结果一致，只有样品 2显示负的ACq值，对应于在该液化切片中较少的可扩增的DNA。
[0136] 实施例3.利用商业液化方法的DNA的qPCR功能性。
[0137] 比较了在本发明的乳化裂解物中和在商业可获得的液化组合物 如ic陆xtract?FFPEDNA提取溶液巧picentre，Madison,Wisconsin)中所释放的DNA的 qPCR功能性。如在前面的实施例中所描述的，进行10ymFFPE切片的液化和随后的qPCR分 析。调整商业液化组合物巧picentre如ic陆xtract?FFPEDNA提取溶液）的体积W允许 与本发明的液化组合物进行1:1比较。将产生的液化裂解物用作用于qPCR的原料（input material);基于Hamfjord等人值ia即Mol化thol2011 ;20:158 - 165)在 25Ji1 反应体 积中利用用于野生型BRAF基因的基于TaqMan数的检测反应来进行反应。
[013引图1示出了从FFPE样品在含有清洁剂Oleth饭-8的乳化裂解物（灰色）中所释放 的DNA和从F阳P样品在商业液化组合物（黑色）中所释放的DNA的扩增结果。十字标记曲 线代表几乎未稀释的乳化裂解物样品（20yL/5yL模板/PCR混合物）的扩增，圆圈标记的 曲线代表4倍稀释的乳化裂解物样品的扩增。在80 %的模板条件下，商业液化组合物完全 抑制PCR，而需要因此进一步4倍稀释W允许qPCR分析。相比之下，含有清洁剂Ole化饭 的本发明的液化组合物与直接下游PCR分析相容，允许在PCR中使用更多模板DNA(更高的 拷贝数）并由此提高PCR分析的灵敏度。
[0139] 实施例4.液化组合物在微流体系统中的功能性
[0140] 探索了几种液化组合物在微流体系统处理中的功能性。
[0141] 利用4种不同缓冲剂（有/没有清洁剂和有/没有蛋白酶K)进行3种不同FFPE 样品的液化，每种条件使用单个连续IOymFF阳切片。如在EP1896180、EP1904234和 EP2419705中所描述的，在微流体系统中进行样品的液化和PCR处理。将样品液化在Iml的 液化组合物中并利用前面提及的条件进行加热。利用前面提及的扩增条件将产生的液化混 合物W未稀释用作qPCR的原料。通过用于野生型BRAF基因的qPCR对所测试的液化混合 物评估扩增的DNA。 阳142] 表2总结了对于含有清洁剂的组合物相对于省去清洁剂的参照组合物所获得的 ACq值。在微流体盒中的微流体通道的情况中，将清洁剂如OietlT租-8加入到液化组合物 中将Cq值降低3. 8的平均值，表明与没有清洁剂的参照组合物相比提高了DNA的释放。加 入蛋白酶K进一步将Cq值提高1. 5的平均值。因此，通过将清洁剂加入到液化组合物中提 高了DNA从3种FFPE样品中的释放。 阳1创表2
[0144]
[0145] 还测试了商业可获得的液化缓冲剂如ic陆xtract?FFPEDNA提取溶液 巧picentre，Madison,Wisconsin)在微流体系统中的功能性。将商业液化缓冲剂通过微流 体盒的微流体通道累入到5个PCR室中重现性地导致气泡的形成（图2,圆形PCR室）。应 当避免运样的气泡，因为在填充PCR室后它们削弱qPCR分析。相比之下，当含有Ole化逝-8 的液化缓冲剂运送至PCR室时没有观察到气泡，表明OIedT驳-8的物理-化学性能与盒的微 流体相容。
[0146] 实施例5.液化组合物在PCR抑制剂存在的情况下的功能性
[0147] 比较了包含变化量的熟知的PCR抑制剂黑色素的样品在DNA提取或液化后的性 能。每个样品的1个FFPE切片或i)在800yL的含有Ol別It般-8的液化组合物中液化或 ii)在商业液化组合物巧Picentre如ic陆xtract?FFPEDNA提取溶液）中液化或iii)根 据生产商的使用说明使用基于柱的提取方法（QiagenQIAampDNAFF阳组织试剂盒）处理 并在200yL肥0或TE中洗脱。按照前面所描述的进行液化并将产生的混合物W未稀释用 作PCR的原料。按照所描述的进行qPCR反应。图3表明DNA释放程序对5种含有变化量 的熟知的PCR抑制剂黑色素的不同FFPE样品的qPCR性能的影响。样品1-4含有高含量的 黑色素（例如，对于样品4来说>95% )，而样品5不含有黑色素。不管是否存在黑色素，本 发明的液化组合物与商业液化组合物相比产生优良的DNA的PCR扩增。对于包含高黑色素 的样品，本发明的液化组合物与基于柱的DNA提取相比通常产生与下游处理更好相容性。 运例如从在图3中描绘的对于FFPE4在不同方法后的Cq值所显而易见。当没有黑色素存 在时观察到相似的性能。因此样品中可能存在没有立刻显现的或知道的其他实时PCR抑制 剂，对此，要求保护的组合物提供提高的性能。图4是在实验中所用的3种含有高黑色素的 样品的可视表示。
[0148]实施例6在工作台上裂解和在Idylla盒的裂解室中裂解的液化缓冲剂的乳化能 力。 阳149] 对于两种条件，将从同一FF阳块连续切除的一个10ym切片浸入到Iml的液化缓 冲剂中。在工作台方案中，将切片在1. 5ml管巧ppendorf)中利用加热块巧ppendorf)加热 至60°C持续15min同时震荡（800;rpm)。在盒（cartridge)中，利用帕尔贴（peltier)(加 热）和压电（高强度聚焦超声或HI即）功能化的组合将溫度在约5分钟内逐步升高（室溫、 45°C、50°C、54°C和58°C)。在最后的步骤中，在决不超过2. 25W的HI即功率下将溫度升高 至60°C并保持lOmin。在两者处理后，将0.5ml运送至高光学透明的圆底管中巧ml抓法 尔康（falcon))，冷却至室溫并在最大功率下满旋。虽然两个实质上相同的切片在相同的缓 冲剂和体积中液化，但与工作台加热和震荡相比通过HI即处理获得优良的石蜡乳化。HI即 处理重现性地产生更不透明的液化和在满旋后在管壁上较少的石蜡沉淀（箭头）。
[0150]实施例7.从液化物质和二氧化娃提取的RNA获得的qRT-PCR曲线。 阳151] 上述的图示出了从来自2个代表性FF阳样品（FFPE1和FFPE2)的单个连续10ym 部分的液化物质和二氧化娃提取的RNA所获得的qRT-PCR曲线。通过根据上面所描述的液 化方法处理FFPE部分在液化条件下获得RNA模板物质。简要地，FFPE部分与液化组合物 接触并利用加热块巧ppendorf)在1. 5ml管巧ppendcxrf)中加热至60°C持续15min，接着 加热至95°C持续IOmin同时震荡（800;rpm)。通过使用QiagenQIAampRNAFFPE组织试剂 盒根据生产商的使用说明处理FFPE部分在二氧化娃提取条件中获得RNA模板物质。随后， 在25yLqRT-PCR反应中利用用于管家基因B2M的RNA-特定分析来分析由每种方法所获 得的5yL模板。 阳152] 图7证明了通过使用用于从FFPE部分释放RNA的液化或者二氧化娃提取方法获 得相似的阔值循环（Ct)。
[0153] 因此，在乳化裂解物中释放的RNA适用于直接微流体分析。
[0154] 考虑到本文所公开的本发明的说明和实践，本发明的其他实施方式对于本领域技 术人员将是显而易见的。旨在认为运些说明和实施例仅是示例性的，本发明的真实范围和 精神将由所附的权利要求所指出。
【主权项】
1. 一种用于释放包含在生物样品中的核酸的方法，所述方法包括以下步骤： -将所述生物样品与组合物接触用于将所述样品的至少部分转化成包含所述核酸的裂 解物，所述裂解物能通过微流体系统直接运送； -在所述微流体系统内分析包含在所述裂解物中的所述核酸。2. 根据权利要求1所述的用于释放包含在生物样品中的核酸的方法，所述方法包括以 下步骤： -将所述生物样品与组合物接触用于将所述样品的至少部分转化成包含所述核酸的裂 解物，所述裂解物能通过微流体系统直接运送； -在所述微流体系统内在所述裂解物中直接分析所述核酸。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中下游核分析需要热循环。4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述下游核分析需要PCR。5. 根据权利要求1至4所述的方法，其中所述样品是固定样品、蜡包埋样品或FFPE样 品。6. 根据权利要求1至5所述的方法，其中所述组合物是包括至少非离子型表面活性剂 的液化组合物。7. 根据权利要求1至6所述的方法，其中所述核酸是DNA或RNA。8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述表面活性剂是具有下式的非离子型表面活性 剂： R-O- (CH2CH2O) nH 其中 n>7 ;n ^ 8 ;或 η = 8 ; 和/或 R 包含 12 < C < 38。9. 根据权利要求8所述的方法，其中其中R是CH 3 (CH2) 7-CH = CH- (CH2) s或 (CH2)11(CH3)2010. 根据权利要求9所述的方法，其中所述非离子型表面活性剂是OIeth_?-8。11. 一种用于从生物样品释放核酸的组合物，所述组合物： -当与所述样品的至少部分接触时将所述样品的至少部分转化成裂解物； -包含至少具有下式的非离子型表面活性剂： R-O- (CH2CH2O) nH 其中 n>7 ;n ^ 8 ;或 η = 8 ; 和/或 R 包含 12 < C < 38。12. 根据权利要求11和12所述的用于释放核酸的组合物，所述组合物具有液化性质。13. 根据权利要求12所述的用于释放核酸的组合物，其中所述非离子型表面活性剂具 有下式： R-O- (CH2CH2O) nH 其中 R 是 CH3 (CH2) 7-CH = CH- (CH2) s或（CH 2) n (CH3) 2。14. 根据权利要求13所述的用于释放核酸的组合物，其中所述非离子型表面活性剂是 OI ct li?-8 ο15. 根据权利要求10至13所述的用于释放核酸的组合物，所述裂解物能通过微流体系 统直接运送。16. 根据权利要求11至15所述的用于从样品释放核酸的组合物，所述裂解物能通过微 流体系统直接运送用于所述裂解物中的直接核酸分析。
【专利摘要】描述了改进的用于处理和分析样品的组合物和方法。尤其是，该组合物和方法从生物样品中释放核酸，使得在微流体系统中直接下游处理核酸。这些组合物、方法和试剂盒可用于诊断、分期、或另外表征各种生物疾病。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN105164259
【申请号】CN201480023809
【发明人】阿克 科恩·范, 巴尔特·克莱斯, 贝努瓦·德沃热拉尔, 海尔特·马尔藤斯, 埃尔温·萨布隆, 帕斯卡莱·霍勒曼斯, 塔尼亚·伊文思
【申请人】拜奥卡蒂斯股份有限公司
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2014年2月18日
【公告号】CA2901641A1, EP2958997A1, WO2014128129A1