烷烃的重组合成的制作方法
【专利说明】烧炫的重组合成
[0001] 巧关申请的香叉引用
[0002] 本申请设及2013年1月25日提交的美国临时专利申请61/756, 973号和2013年 5月23日提交的美国临时专利申请61/826, 637号；其均出于全部目的而通过引用在此全 文并入。
[0003] 序列表
[0004] 本发明包含经由EFS-Web提交的序列表，且其通过引用在此全文并入。所述ASCII 拷贝创建于20XX年XX月，命名为XXXXXUS_sequencelisting.txt，大小为X，XXX，XXX字节。
【背景技术】
[0005] 许多现有的光能自养生物（即，植物、藻类和光合细菌）不适合工业化生物处理， 且因此没有显现出商业上的可行性。已经对重组光合微生物进行工程化来W超过该生物体 天然产生的水平的量生产控类和醇类。
【发明内容】
[0006] 本文描述了工程化微生物，其中所述工程化微生物包含编码一种或多种酶的 一种或多种重组基因，所述一种或多种酶具有催化烧控产生的酶活性，其中所述酶活性 包括：烧控脱甲酯单加氧酶活性、硫醋酶活性、簇酸还原酶活性和憐酸泛酷琉基乙胺基 (地OS地opanthetheinyl)转移酶活性；烧控脱甲酯单加氧酶活性、硫醋酶活性、长链脂肪 酸CoA-连接酶活性和长链酷基-CoA还原酶活性；和/或烧控脱甲酯单加氧酶活性、丙酬酸 脱簇酶活性和2-酬酸脱簇酶活性。
[0007] 在一些方面，酶包括烧控脱甲酯单加氧酶、硫醋酶、簇酸还原酶和憐酸泛酷琉基乙 胺基转移酶。在一些方面，烧控脱甲酯单加氧酶具有EC编号4. 1. 99. 5,硫醋酶具有EC编 号3. 1. 2. 14,簇酸还原酶具有EC编号1. 2. 99. 6,和憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶具有EC编 号2. 7. 8. 7。在一些方面，烧控脱甲酯单加氧酶由a血编码，硫醋酶由化巧或化tB2编码， 簇酸还原酶由Ca巧编码，和憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶由entD编码。
[0008] 在一些方面，具有烧控脱甲酯单加氧酶活性的酶具有EC编号4. 1. 99. 5。在一些方 面，具有硫醋酶活性的酶具有EC编号3. 1. 2. 14。在一些方面，具有簇酸还原酶活性的酶具 有EC编号1. 2. 99. 6。在一些方面，具有憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶活性的酶具有EC编号 2. 7. 8. 7〇
[0009] 在一些方面，酶包括烧控脱甲酯单加氧酶、硫醋酶、长链脂肪酸CoA-连接酶和长 链酷基-CoA还原酶。在一些方面，烧控脱甲酯单加氧酶具有EC编号4. 1. 99. 5、硫醋酶具 有EC编号3. 1. 2. 14、长链脂肪酸CoA-连接酶具有EC编号6. 2. 1. 3和长链酷基-CoA还原 酶具有EC编号1. 2. 1. 50。在一些方面，烧控脱甲酯单加氧酶由a血编码，硫醋酶由化巧或 fatB2编码，长链脂肪酸CoA-连接酶由化曲编码，和长链酷基-CoA还原酶由acrM编码。
[0010] 在一些方面，具有烧控脱甲酯单加氧酶活性的酶具有EC编号4. 1. 99. 5。在一些方 面，具有硫醋酶活性的酶具有EC编号3. 1.2. 14。在一些方面，具有长链脂肪酸CoA-连接酶 活性的酶具有EC编号6. 2.I. 3。在一些方面，具有长链酷基-CoA还原酶活性的酶具有EC编号 1. 2. 1. 50。
[0011] 在一些方面，一种或多种重组基因包含编码催化酷基-ACP转化为脂肪酸的硫醋 酶的重组基因。在一些方面，一种或多种重组基因包含编码使由簇酸还原酶基因编码的蛋 白质的ACP部分憐酸泛酷琉基乙胺基化（phosphopatetheinylate)的憐酸泛酷琉基乙胺基 转移酶的重组基因。在一些方面，一种或多种重组基因包含编码催化脂肪酸转化为脂肪醒 的簇酸还原酶的重组基因。在一些方面，一种或多种重组基因包含编码催化脂肪醒转化为 烧控或締控的烧控脱甲酯单加氧酶的重组基因。在一些方面，一种或多种重组基因包含编 码催化脂肪酸转化为酷基-CoA的脂肪酸CoA-连接酶的重组基因。在一些方面，一种或多 种重组基因包含编码催化酷基-CoA转化为脂肪醒的酷基-CoA还原酶的重组基因。
[0012] 在一些方面，酶包括烧控脱甲酯单加氧酶、丙酬酸脱簇酶和2-酬酸脱簇酶。
[0013] 在一些方面，所述微生物是细菌。在一些方面，所述微生物是革兰氏阴性细菌。在 一些方面，所述微生物是大肠杆菌。
[0014] 在一些方面，所述微生物是光合微生物。在一些方面，所述微生物是蓝细 菌。在一些方面，所述微生物是耐热性蓝细菌。在一些方面，所述微生物是聚球藻属 (Synechococcus)的种。
[0015] 在一些方面，包含一种或多种重组核酸序列的操纵子的表达受重组启动子控制， 其中启动子是组成型或诱导型的。在一些方面，所述操纵子被整合到所述微生物的基因组 中。在一些方面，所述操纵子在染色体外。
[0016] 在一些方面，所述烧控的长度小于或等于11个碳原子。在一些方面，所述烧控的 长度为7至11个碳原子。在一些方面，所述烧控的长度为7、8、9、10或11个碳原子。在一 些方面，所述烧控的长度小于或等于18个碳原子。在一些方面，所述烧控的长度为7至18 个碳原子。在一些方面，所述烧控的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个 碳原子。
[0017] 在一些方面，所述重组基因与表中所示序列至少90%或至少95%相同。
[0018] 本文还描述了包含培养基和本文所述微生物的细胞培养物。
[0019] 本文还描述了生产控的方法，其包括：在培养基中培养本文所述工程化微生物，其 中相对于在相同条件下培养的其他方面相同但缺乏所述重组基因的微生物，所述工程化微 生物产生增加量的烧控。在一些方面，该方法还包括允许烧控在培养基或生物体中积累。在 一些方面，该方法还包括分离烧控的至少一部分。在一些方面，该方法还包括处理分离的烧 控W产生经处理的材料。
[0020] 本文还描述了用于生产控的方法，其包括：（i)在培养基中培养本文所述工程化 微生物；和（ii)使所述工程化微生物暴露于光和无机碳，其中所述暴露导致所述无机碳被 所述微生物转化为烧控，其中所述烧控W比由在相同条件下培养的其他方面相同但缺乏所 述重组基因的微生物产生的量更大的量产生。在一些方面，该方法还包括允许烧控在培养 基或生物体中积累。在一些方面，该方法还包括分离烧控的至少一部分。在一些方面，该方 法还包括处理分离的烧控W产生经处理的材料。
[0021] 本文还描述了包含烧控的组合物，其中所述烧控由本文所述方法产生。在一些方 面，组合物包含至少50 %、至少60 %、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少 99 %的烧控。
[0022] 本发明在某些实施方式中提供了由工程化生物生产短链烧控或締控的方法，该方 法包括：在工程化微生物中表达重组烧醒（a化anal)脱甲酯单加氧酶（"ADM");和在有效 地生产短链烧控或締控的条件下在含有碳源的培养基中培养工程化微生物。
[0023] 在实施方式中，ADM催化醒转化为烧控或締控，其中醒选自乙醒、下醒、丙醒、异下 醒、下醒、3-甲基-1-下醒和2-苯基乙醒。在实施方式中，烧控或締控选自甲烧、丙烷、乙 烧、下烧、丙烷、异下烧和甲苯。在实施方式中，由工程化生物产生短链烧控或締控的方法包 括在工程化微生物中表达重组丙酬酸脱簇酶（"Pdc")。在某些实施方式中，Pdc与SEQID N0:46至少90%相同。在实施方式中，由工程化生物产生短链烧控或締控的方法包括在工 程化微生物中表达2-酬酸脱簇酶。在某些实施方式中，Pdc或2-酬酸脱簇酶在受单一启 动子控制的操纵子中表达。
[0024] 在实施方式中，操纵子包含ADM。在某些实施方式中，ADM与SEQIDNO: 36至少 90%相同。
[00巧]本文还提供了包含工程化微生物的实施方式，其中工程化微生物包含编码烧醒脱 甲酯单加氧酶（"ADM")的重组基因，并且其中工程化微生物还包含编码选自丙酬酸脱簇酶 和2-酬酸脱簇酶的酶的重组基因。
[0026] 在一个实施方式中，ADM催化醒转化为烧控或締控，其中醒选自乙醒、下醒、丙醒、 异下醒、2-甲基-1-下醒、下醒、3-甲基-1-下醒和2-苯基乙醒。在某些实施方式中，烧控 或締控选自甲烧、丙烷、乙烧、下烧、丙烷、异下烧和甲苯。
[0027] 在一个实施方式中，工程化微生物包含重组丙酬酸脱簇酶（"Pdc")。在某些实施 方式中，Pdc与SEQIDNO:46至少90%相同。在一个实施方式中，工程化微生物包含2-酬 酸脱簇酶。在某些实施方式中，Pdc或2-酬酸脱簇酶在受单一启动子控制的操纵子中表达。
[0028] 在一个实施方式中，操纵子包含ADM。在一些实施方式中，工程化微生物是工程化 蓝细菌。在某些实施方式中，ADM与SEQIDNO: 36至少90%相同。
[0029] 本文还提供了包含细胞培养物的实施方式，所述细胞培养物包含重组微生物和含 有碳源的培养基，其中当重组微生物在有效地表达多肤的条件下在培养基中培养时，催化 醒转化为烧控的多肤在重组微生物中过表达，并且烧控或締控在细胞培养物中产生。在实 施方式中，多肤具有烧醒脱甲酯单加氧酶活性。在实施方式中，多肤包含与SEQIDN0:36 具有至少90 %同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，醒选自乙醒、下醒、丙醒、异下醒、 下醒、3-甲基-1-下醒和2-苯基乙醒。
[0030] 在实施方式中，烧控或締控选自甲烧、丙烷、乙烧、下烧、丙烷、异下烧和甲苯。在实 施方式中，烧控是短链烧控。在某些实施方式中，烧控包含C2到C4烧控。在一些实施方式 中，烧控包含Cz到C7烧控。在实施方式中，烧控或締控被分泌到培养基中。
[0031] 在实施方式中，重组微生物还包含包括丙酬酸脱簇酶（"Pdc")活性的重组多肤。 在某些实施方式中，Pdc与沈QIDN0:46至少90%相同。在实施方式中，工程化微生物还 包含重组2-酬酸脱簇酶。在一些实施方式中，Pdc或2-酬酸脱簇酶在受单一启动子控制 的操纵子中表达。在实施方式中，操纵子包含ADM。
[0032] 在实施方式中，重组微生物选自酵母、真菌、丝状真菌、藻类和细菌。在一些实施方 式中，微生物是蓝细菌。
[0033] 本文还提供了包含用于生产异下烧或异下烧衍生物的方法的实施方式，该方法包 括在体外将ADM与醒接触。在实施方式中，ADM与SEQIDNO: 36至少90%相同。在某些实 施方式中，ADM是点形念珠藻（Nostocpuncti化;rme)ADM。在实施方式中，醒是3-甲基下 醒。
[0034] 本发明的运些实施方式和其他实施方式于此在附图、说明书、实施例和权利要求 中作进一步描述。
【附图说明】
[003引图1.示出AcrM蛋白质在大肠杆菌中过表达的SDS-PAGE凝胶。
[0036] 图2. (A)癸酷基-CoA和做月桂酷基-CoA分析的TIC色谱图。实线：野生型 化21 0E3);虚线：acrM-表达化21 0E3)。
[0037] 图3.示出检测到由表达A血、CarB、TesA和ElntD蛋白质的聚球藻（Synechococ州S SP. )PCC7002株产生的C13和C15烧控的GC/FID色谱图。灰色迹线：对照菌株（不表达 CarB蛋白质）；黑色实线迹线：C13、C14和C15正烧控的标准品；黑色虚线迹线：表达A血、 CarB、TesA和化tD蛋白质的聚球藻P(X7002株。
[0038] 图4.来自酸喂食（acid-fed)(虚线）或对照（实线）的表达A血和CarB的聚球 藻P(X7002的样品的TIC色谱图。A和D:辛酸喂食；B和E:癸酸喂食；C和F:十二烧酸喂 食。
[0039] 图5.示出检测到由表达A血、CarB、化tB2和化tD蛋白质的聚球藻P(X7002株在 1化和7化时产生的壬烧的GC/FID色谱图。实线迹线：对照菌株（野生型）；点状迹线：表 达A血、CarB、化tB2和化tD蛋白质的聚球藻P(X7002株。
[0040] 图6.烧控产生途径的实例。注意，可W通过产生使Ca巧蛋白质的ACP部分憐酸 泛酷琉基乙胺基化的entD(憐酸泛酷琉基乙胺基转移酶）的产物来促进CarB的使用。例 如，可W使用芽抱杆菌度acillus)entD，其酶产物具有包括CarB在内的广泛底物谱。
[0041] 图7.当用癸酸和十二烧酸喂食时，检测到由表达A血、硫醋酶、CarB、和化tD蛋白 质的聚球藻？(：口002株产生的壬烧（A)和^^一烧度）。圆圈：在细胞团块中检测的烧控；S 角形：在十六烧上覆层（overlay)中检测的烧控。
[0042] 图8.示出了通过表达A血、硫醋酶、CarB、和化tD蛋白质的聚球藻P(X7002株从 C〇2生物合成壬烧（A)和十一烧度）（其分泌到十六烧上覆层中）的GC/FID色谱图。实线 迹线：第0天的样品；点状迹线：第5天的样品。
[0043] 图9.通过表达A血、硫醋酶、CarB、和化tD蛋白质的聚球藻P(X7002株从C〇2生物 合成十一烧角形）和壬烧（圆圈）（其分泌到十六烧上覆层中）的时程。
[0044] 图10.示出检测到由表达A血、CarB、TesAm和化tD蛋白质的7002株产生的C13 和C15烧控的GC/FID色谱图。实线：对照株；虚线：ALK-C13C15 (实验株）。
[0045] 图11.ALK-C13C15在10天时间的生长曲线。
[0046] 图12.ALK-C13C15在10天时间的十S烧和十五烧的产量曲线。
[0047] 图13.描述了化S厂标记ADM酶的Ni-NTA纯化的级分。标示出合并W用于分析 的收集的级分。
[0048] 图14.通过JCC6036从C02生物合成^^一烧（S角形）的时程。
[004引图15.当用癸酸喂食时，检测到由表达A血、CarB和化tD蛋白质的7002株产生的 壬烧。通过表达pAQ3上的化is标记A血，初始活性与pAQ4上的相比明显提高。
【具体实施方式】
[0050] 除非本文中另有限定，关于本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术 人员通常理解的含义。此外，除非上下文需要，单数术语应该包含复数而复数术语应当包含 单数。通常，与本文中描述的生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学及蛋白 质和核酸化学作用及与杂交相关使用的术语及其技术是本领域众所周知和常用的。
[0051] 除非另有注明，本发明的方法和技术通常依据本领域公知的常规方法和按本说明 书中引用和讨论的各种一般的和更具体的参考文献中描述的进行。参见，例如，Sambrook 等，MolecularCloning:ALaboratoryManual，第二片反，ColdSpringHarborLaboratory Press，ColdSpringHarbor，N.Y. (1989);Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecular Biology,GreenePublishingAssociates(1992,和 2002 增刊）；Ha;rlow和Lane, Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpring Harbor，N.Y. (1990) ;Taylor和Drickamer，IntroductiontoGlycobiology，OxfordUniv. Press(2003)；WorthingtonEnzymeManual,WorthingtonBiochemicalCorp.，Freehold， N.J.；HandbookofBiochemistry:SectionAProteins，VolI，CRCPress(1976)； HandbookofBiochemistry:SectionAProteins，VolII，CRCPress(1976)；Essentials ofGlycobiology，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1999)。
[0052] 本文中设及的所有公开出版物、专利和其他参考文献通过引用在此全文并入。
[0053] W下术语，除非另有说明，应当被理解为具有W下含义：
[0054] 术语"多核巧酸"或"核酸分子"是指至少10个碱基长度的核巧酸聚合形式。该术 语包括DNA分子（如cDNA或者基因组DNA或合成DNA)和RNA分子（如mRNA或合成RNA)， W及包含非天然核巧酸类似物、非原始核巧间键（intemucleosidebond)或两者的DNA或 RNA类似物。核酸可W是任何拓扑构象。例如，核酸可W是单链的、双链的、=链的、四重体 的、部分双链的、分枝的、发夹的、环形的或是扣锁构象的。
[005引除非另有说明，并作为在本文中妒'SEQIDNO:"的一般形式描述的所有序列的例 子，"包含SEQIDNO: 1的核酸"是指其至少一部分具有（i)SEQIDNO: 1的序列，或（ii)与 SEQIDNO: 1互补的序列的核酸。运两者间的选择由上下文决定。例如，如果该核酸被用作 探针，运两者间的选择由探针与所希望的祀互补的需要决定。
[0056]"分离"的RNA、DNA或混合聚合物是在其天然宿主细胞中与天然多核巧酸自然伴随 的其他细胞成分（如与其自然相关的核糖体、聚合酶W及基因组序列）基本上分离的RNA、 DNA或混合聚合物。
[0057] 如本文所用，"分离的"有机分子（如烧控）是与其所来源的宿主细胞的细胞成分 (膜脂质、染色体、蛋白质），或与宿主细胞在其中培养的培养基基本上分离的有机分子。尽 管特定的分离的生物分子可W被纯化至接近均质，但该术语不要求生物分子与所有其他化 学物质分离。
[005引术语"重组的"是指（1)已从其所天然存在的环境中移除的，似不与在其中天然 发现该基因的多核巧酸的全部或部分相关联的，（3)与并非与之天然相连的多核巧酸可操 作地相连的，或（4)自然界中不存在的生物分子，如基因或蛋白质。术语"重组的"可用于 指克隆的DNA分离物、化学合成的多核巧酸类似物、或通过异源系统生物合成的多核巧酸 类似物，W及由运样的核酸编码的蛋白质和/或mRNA。
[0059] 如本文所用，如果异源序列被置于与内源核酸序列相邻使得该内源核酸序列的表 达被改变，则生物体的基因组中的该内源核酸序列（或该序列的编码蛋白质产物）在本文 中被认为是"重组的"。在运种情况下，异源序列是与内源核酸序列非天然相邻的序列，无论 该异源序列是其自身内源的（源自相同的宿主细胞或其后代）还是外源的（源自不同的宿 主细胞或其后代）。举例来说，启动子序列可W替换（例如通过同源重组）宿主细胞基因组 中的基因的天然启动子W使得该基因表达模式改变。因为该基因至少与一些天然位于其侧 翼的序列分离，该基因现变为是"重组的"。
[0060] 如果核酸含有任何对于基因组中的相应核酸并非天然存在的改变，则该核酸也被 认为是"重组的"。例如，如果内源编码序列含有人为导入（如通过人为干预）的插入、缺失 或点突变，则该内源编码序列被认为是"重组的"。"重组的核酸"也包括在异源位点整合到 宿主细胞染色体中的核酸W及作为附加体存在的核酸构建体。
[0061] 如本文所用，短语参考核酸序列的"简并变体"包括可W依据标准遗传密码翻译W 提供与从参考核酸序列翻译的氨基酸序列相同的氨基酸序列的核酸序列。术语"简并寡核 巧酸"或"简并引物"用于表示能够与序列上不是必须相同而是在一个或多个特定区段内彼 此同源的祀核酸序列杂交的寡核巧酸。
[0062] 设及核酸序列的术语"百分序列同一性"或"相同"是指当W最大对应性比对时 相同的两个序列中的残基。序列同一性比较的长度可W覆盖至少约9个核巧酸的延伸，通 常至少约20个核巧酸，更经常至少约24个核巧酸，通常至少约28个核巧酸，更通常至少 约32个核巧酸，且优选至少36个或更多的核巧酸。本领域中有多种已知的不同算法可用 于测定核巧酸序列同一性。例如，可W使用作为WisconsinPackage版本10. 0，Genetics ComputerGroup(GCG)，Madison,Wis中的程序的FASTA、Gap或Beatfit来比较多核巧酸 序列。FASTA提供查询和检索序列间最佳重叠区域的比对和百分序列同一性。化arson, MethodsEnzymol. 183:63-98(1990)(通过引用全文并入本文）。例如，核酸序列间的百分序 列同一性可W利用FASTAW其默认参数化的字长和用于得分矩阵的NOPAM因子），或使用 GCG版本6.1 (通过应用并入全文）中提供的GapW其默认参数来确定。可选择地，可W使 用计算机程序BLAST来比较序列（Altschul等，J.Mol.Biol. 215:403-410 (1990);Gish和 States,化 1:ureGenet. 3:266-272(1993);Madden等，Meth.Enzymol. 266:131-141 (1996); Altschul等，NucleicAcidsRes. 25:3389-3402(1997);Zhang和Madden,Genome Res. 7:649-656(1997))，特别是blas1:p或忧lastn(Altschul等，NucleicAcids Res.25:3389-3402(1997))。
[0063] 术语"基本