酸分析。
[0048] 本发明的又一个方面提供了一种能够直接被微流体分析仪处理的用于从样品中 获得核酸的试剂盒，所述试剂盒包括至少本发明的组合物。 W例通过本文所提供的权利要求和详细说明，本发明的运些W及进一步的特征将变得 更加显而易见。
【附图说明】
[0050] 图1 :图描述了利用两种不同方法从FF阳组织样品中获得的液化裂解物的PCR相 容性。X轴代表扩增循环数量；Y轴代表相对巧光单位（RRJ) (103)。显示了代表包含清洁剂 Ole化饭-8的液化组合物（灰色）和商业液化缓冲剂（黑色）的扩增曲线；十字标记曲线 代表几乎未稀释的样品，圆圈标记的曲线代表4倍稀释的样品。较小稀释的样品代表80/20 的裂解物/PCR扩增混合物的比率。 阳化U图2 :图说明了商业缓冲剂与微流体qPCR系统的不相容性。圆圈标记在PCR室中 在通过微流体路径累送商业缓冲剂后气泡的形成。 阳0巧图3 :Cq图说明了在不同DNA提取/液化方法W后在来自带有不同量的黑色素的FF阳黑素瘤样品的DNA上进行的实施试验。X轴代表FFPE样品；Y轴代表所获得的Cq值； 直柱代表：使用商业溶液的DM液化（黑色）、基于柱的NDA提取（深灰色）、和来自本发明 的DNA液化（浅灰色）。较低值表示较低的qPCR阔值并因此提高DNA分析的灵敏度。
[0053] 图4 :视觉表示实施例5中所用的含高黑色素的样品FFPE1、FFPE2和FFPE3。
[0054] 图5 :图说明了结合溫度升高的样品液化（A)和结合溫度升高连同HI即处理的样 品液化度）。 W55] 图6a和化：从来自2个代表性FFPE样品（FFPE1和FFPE2)的单个连续10ym部 分的液化物质狂）和二氧化娃提取的RNA( □)所获得的qRT-PCR曲线。
【具体实施方式】
[0056]用于从生物组织样品提取核酸的技术通常使用两个分开的步骤：a/消化组织，接 着b/纯化核酸。用于从含蜡样品中提取核酸的技术通常使用S个分开的步骤：a/去蜡；接 着b/消化组织；和c/纯化核酸。总体上，运些方法常常十分耗费时间和/或不能直接可转 移到全面整合的诊断系统中，最通常因为核酸提取需要合用试剂（例如乙醇）和子步骤如 样品离屯、，或与塑料（二甲苯）或流体（例如由于在通道运形成泡沫）不相容。本文提供 的方法和组合物现在允许直接分析来自生物样品的核酸，包括含蜡的样品，不需要提前从 样品中纯化核酸。
[0057] 本发明在此提供了用于从各种生物样品，包括含蜡的样品中释放核酸的方法。发 现组合物用于从样品中释放核酸能够在微流体系统中直接核酸分析的方法中、和用于在微 流体系统中分析从样品中释放的核酸的方法中。在特别的应用中，该方法包括W下步骤：将 生物样品与组合物在条件下接触W提供允许从该样品中释放核酸的裂解物，该裂解物与设 计用于下游核酸分析的微流体系统相容。裂解物是液体样品并可W是简单裂解物，或可替 换地是与酶如蛋白酶一起解育的产物。在该应用中，除非另外说明，否则所使用的"裂解物" 表示"裂解物"、"液体样品"或"消化物（消化液，digest)"。裂解物已准备好用于直接核酸 分析，不需要从裂解物中所释放的核酸的进一步纯化。能够在裂解物中直接分析核酸。
[0058] 直接核酸分析是指分析在裂解物中释放的核酸，不需要从裂解步骤中所用的清洁 剂、蛋白、盐类和试剂中纯化核酸。该方法统一适用于在允许自动化微流体系统处理和直接 下游分析、没有损失一些核酸片段和引入长度和纯度偏差的风险的条件下从宽范围的生物 样品中获得核酸。例如，不需要乙醇沉淀、苯酪-氯仿提取或微柱纯化。预期当不使用纯化 步骤时遗传信息是有代表性的。核酸分析，尤其是核酸扩增，在一些情况下可能需要裂解物 的轻微稀释形式，原因例如稀释扩增酶的蛋白抑制剂、稀释使酶不稳定的物质...。核酸分 析，尤其是核酸扩增，可能需要或可能不需要加入用于实施核酸扩增的物质，并因此可能导 致初始裂解物的轻微稀释。用于进一步下游处理样品所需的物质可WW干燥形式提供并可 W直接溶解在裂解物中。
[0059] 轻微稀释形式是指全然在未稀释至2倍稀释范围内用核酸裂解物扩增物质稀释 核酸裂解物。
[0060] 因此，本发明提供了用于从生物样品中释放核酸使得能够在微流体系统中直接核 酸分析的方法，包括W下步骤：
[0061] -将样品与组合物在条件下接触W提供与下游核酸分析系统相容的裂解物，
[0062]-在微流体系统中处理裂解物用于核酸分析，W及
[0063] -在裂解物中直接分析核酸。
[0064] 具体地，本发明提供了用于释放包含在生物样品中的核酸的方法，所述方法包括W下步骤： 阳〇化]-将生物样品与组合物接触用于将样品的至少部分转化成包含所述核酸的裂解 物，所述裂解物能通过微流体系统直接运送；
[0066] -在微流体系统内分析包含在裂解物中的核酸。
[0067] 尤其是，本发明提供了用于释放包含在生物样品中的核酸的方法，所述方法包括W下步骤：
[0068] -将生物样品与组合物接触用于将样品的至少部分转化成包含所述核酸的裂解 物，所述裂解物能通过微流体系统直接运送；
[0069] -在微流体系统内在裂解物中直接分析核酸。
[0070] 因此，本发明提供了用于在微流体系统中分析从生物样品中释放的核酸的方法， 所述方法包括W下步骤：
[0071] -将样品与组合物在条件下接触W提供与下游核酸分析系统相容的裂解物，W及
[0072] -在微流体系统中处理裂解物用于直接核酸分析，W及
[0073] -在裂解物中直接分析核酸。
[0074] 更具体地，本发明提供了用于在微流体系统中分析从生物样品中释放的核酸的方 法，所述方法包括W下步骤：
[0075] -在微流体系统中，将样品与组合物在条件下接触W提供与下游核酸分析系统相 容的裂解物，W及
[0076] -在所述微流体系统中处理裂解物用于直接核酸分析，W及
[0077] -在裂解物中直接分析核酸。
[0078] 本文所用的"核酸"（W及等价术语"多核巧酸"）是指在核巧酸亚单位之间包含 憐酸二醋键的核糖核巧或脱氧核糖核巧的聚合物。核酸包括，但不限于，基因DNA、cDNA、 hnRNA、mRNA、rRNA、tRNA、微RNA、片段核酸、从亚细胞器如线粒体获得的核酸，W及从可能出 现在样品上或样品中的微生物或病毒获得的核酸。核酸可W是双链或者单链、环状或线性 的。优选地，从生物样品中释放核酸。核酸由DNA和RNA组成，RNA优选为总的RNA。"样品 或生物样品"意在包括各种包含核酸和/或细胞物质的生物资源。核酸和/或细胞物质来 自待测试细胞W测定是否存在一种或多种特殊标记物。所包括的样品是下述样品：来自细 胞培养物、真核微生物或诊断样品如体液、体液沉淀物、洗胃样本、细针抽取物、活组织检查 样品、组织样品、癌细胞、来自病人的细胞、来自组织的细胞或来自待测试和/或治疗疾病 或感染的个体的体外培养的细胞、或法医样品。体液样品的非限制性实例包括全血、骨髓、 脑脊液、腹膜液、胸膜液、淋己液、血清、血浆、尿、乳糜、粪便、射精、疲、乳头吸液、唾液、棉签 样本、冲洗或灌洗液和/或擦拭样本。
[0079] 在一些实施方式中，样品是新鲜样品、新鲜冷冻样品、细针抽取物、已处理用于保 存并由于固定处理可能含有交联反应位点的样品、蜡接触或蜡包埋样品、或WFFPE切片形 式的FFPE样品。新鲜冷冻样品是在冷冻-能凝固介质如OCT-化合物中硬化和包埋的样品。 本文所用细针抽取物包括但不限于离屯、后被蜡包埋的细胞，进行或不进行在先固定处理。
[0080] "蜡"是指在组织化学领域中用于包埋用于组织化学或其他分析的生物样品所使 用的组合物，通常由高级控类的复合混合物组成，经常包括醋类或高级脂肪酸和高级二醇 类，并且可W矿物、天然的或合成来源。
[0081] 石蜡是组织化学领域中最常用的蜡的实例。术语"石蜡"与"烧控"同义使用，是 指具有通式化肥n巧的控类。如本文所用的，术语"石蜡"包括固体石蜡（石蜡，paraffin wax)和石蜡共混物型包埋介质。"固体石蜡（paraffin wax)"是指落在20《n《40范围 内的烧控类的混合物。石蜡共混物包括可增强石蜡在包埋操作中的性能的其他物质。
[0082] 化学固定保存组织免于降解并帮助保持细胞的结构和亚细胞成分。包埋的生物样 品通常W福尔马林固定石蜡包埋的样品（FFPE样品）形式保存或储存。"FFPE"是指通过暴 露于中性缓冲的福尔马林（通常是在憐酸盐缓冲盐水中的4%的甲醒），随后完全浸入疏水 基质如石蜡或石蜡共混物中处理使得石蜡或石蜡共混物渗透组织或细胞的组织或细胞。
[0083] 作为在示例性部分中示出的非限制性实例，本发明的方法成功地在黑素瘤样品上 实施。因此，在本发明的一些实施例中，样品是来自询问生物状态如健康状态、疾病或感染 的个体的生物样品。可替换地，样品是来自诊断生物状态但询问预后或治疗性措施如治疗 选择或治疗结果的个体。在具体的实施方式中，生物状态是疾病并包括瘤形成疾病，尤其是 肿瘤或癌症。
[0084] 生物状态、疾病、感染或对治疗措施的应答可W使用标记物（marker)来评估。
[00化]"标记物"、"测试标记物"、"生物标记物"或"生物学标记物"是客观测定评估过的 特征，并是指对特殊生物状态特定的细胞成分。标记物可W是核酸或蛋白成分或其部分。优 选地，其是核酸、DNA或RNA。
[0086] 在一个实施方式中，标记物旨在包括但不限于与疾病或感染相关的易位、微卫星 (microsatellite)、等位基因、突变、单核巧酸多态性（SNP)、插入、缺失、剪接变异体、转位 子（transposes)、微RNA的表达分布等。在一些实施方式中，使用DNA来确认SNP、插入、缺 失或易位。在其他实施方式中，使用RNA来确认表达水平。表达水平能最终与SNP或其他 基因变异相联系。示例性部分显示本发明的方法成功地用于检测BRAF基因的存在。存在 特定分析W检测该基因的突变体的存在（例如基于Hamfjordetal.,Dia即MolPathol 2011 ;20:158-165)。因此，在一些实施方式中，标记物是适用于诊断或预后癌症或疾病、预 测癌症或疾病治疗结果、选择适合治疗的患者、选择将使用的治疗方案、或选择治疗方案改 变的标记物。在一些实施方式中，标记物包括与疾病相关的核酸修饰，优选突变、SNP、插入、 缺失或易位。
[0087] 在本发明的方法中，样品与组合物接触W提供释放核酸的裂解物，所述组合物优 化用于微流体分析仪中。该组合物能通过微流体系统运送。在所提供方法的一些实施方式 中，运种接触步骤因此可在微流体系统自身中实施或可替换地可W需要研究者在微流体系 统分析之前手动移液（manualpipetting)。因此，在一些实施方式中，微流体系统可接受样 品并在分析之前利用本发明的方法处理样品。在一些实施方式中，该系统将接受和分析预 先准备好的裂解液。
[00蝴"接触"是指将样品和组合物放在一起、暴露、解育、或混合。
[0089]本发明的方法包括发明的物理的（热、化化…）和生物化学的（酶类、盐类、还原 剂…）方法和组合物的组合一起作用W增强核酸测定的灵敏度和准确度。如在示例性部分 所显示的，使组合物经受加热和HI即与经受加热结合揽拌或震荡相比产生提高的乳化能 力。尤其是，将溫度加热至约 60°c(例如 60°C±rc;60°c±2°C、60°C±3°C、60°C±4°C、 60°C±5°C)产生提高的乳化效果。在优选的实施方式中，将溫度从室溫逐步升高至60°C， 接着进行HI即处理。优选地，HI即功率不超过2. 25W。
[0090] "释放"是指释出、获得和/或反转交联。为了从样品中释放核酸，可能需要来自组 合物的蛋白酶活性和抑缓冲。释放可能需要来自组合物的在研究样品中存在的除了核酸 W外的组分的潜在沉淀活性，W及固定剂的去除/溶解。释放可能需要如加热或高强度聚 焦超声化I即）的条件。从FFPE样品中获得的核酸通常含有核巧酸至核巧酸和核巧