用于分析定义的多细胞组合的方法和设备的制造方法
【专利说明】用于分析定父的多细胞组合的方法和设备
[0001 ]相夫申请
[0002] 本申请要求3015年3月13日提交的美国临时申请号61/852, 135的优先权，其内 容通过引用并入本文。 发明领域
[0003] 本发明设及用于分析单独的细胞和定义的细胞组合的方法和设备。
[0004] 宜量
[0005] 许多出版物已讨论了操作单细胞的方法，包括W下（其中没有一个被承认是 现有技术）：Sims 等人，2007, "Analysis of sin邑Ie mammalian cells on-chip"Lab Qiip 7:423-440;Wheeler 等人，2.003, "Microfluidic device for single-cell analysis'"Anal Chem 75:3581-3586 ;Skelley 等人，2009"Microf Iuidic control of cell pairing and fusion"Nat Methods 6:147-152 ;Mar州s 等人，2006, "Microf Iuiclic single-cell mRNA isolation and analysis'"Anal Chem 78:3084-3089 ;Bontoux 等人， 2008"Integrating whole transcriptome assays on a lab-on-a-chip for single cell gene profiling"Lab ChipS:443---450 ;Zhong 等人，2008"A microfluidic processor for gene expression profiling of single hum曰n embryonic stem cells"L曰b Chip 8:68---74 ;Wheeler2003"MicrofIuidic Device for Single-Cell Analysis Anal. Qiem. "75:3581-3586 ;和怖ite 等人，August 23, 201 l"Hi曲-t虹OU曲put microfluidic single-cell RT-qPCR PNAS"第 108 卷，34:13999-14004。W上列出的出版物的每个通 过引用并入本文。
[0006] 本发明提供了具有在现有技术的方法和设备不存在的特征和优势的新方法。
[0007] 发巧概沐
[0008] 本发明设及用于分析单独的细胞和定义的细胞组合的方法和设备。W下实施方案 并不意图是限制性的。相反，应该理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明性的目 的，且根据其的各种修改或改变将被暗示给本领域技术人员，并被包括在本申请的精神和 范围内。
[0009] 在实施方案和整个说明书的W下叙述中，为简单起见，通常提到"单独的细胞"或 "单个捕获的细胞"。除非从上下文的地方另有清楚，对于每一个运样的引述，预期在可选的 实施方案中"单独的细胞"和"单个捕获的细胞"应被理解为"单独的细胞单元"和"单个捕 获的细胞单元"。还预期其中在一些区段和过程中捕获单个细胞和在其他区段和过程中捕 获单个细胞单元的实施方案。
[0010] 在一个方面，本申请公开了方面1，其是用于细胞分析的方法，包括进行至少两轮 细胞捕获、表征、和运送，每轮包括：a)使包含多个单独的细胞（和/或细胞单元）的溶液 流入第一微流通道；b)将通道分隔为多个连续的区段（S)，由此在至少一个区段中捕获至 少一个细胞，其中i) 一个或更多个所述区段包含单个捕获的细胞（和/或单个捕获的细胞 单元），和C)确定一个或更多个所述单个捕获的细胞和/或细胞单元的至少一个特性；和 d)基于所确定的特性将每个所述捕获的细胞或单元独立地运送至指定的细胞保持室，由此 对于每个指定的目标室，运送至其的细胞的特性是已知的。
[0011] 在一个方面，本申请公开了方面2,方面1的方法，其中进行至少=轮、至少四轮、 至少五轮、至少六轮、至少10轮、至少15轮、或至少20轮的细胞捕获、表征、和运送。
[0012] 在一个方面，本申请公开了方面3,任一前述方面的方法，其中在化）中至少30% 所述区段包含不超过一个细胞。
[0013] 在一个方面，本申请公开了方面4,方面3的方法，其中大多数所述区段包含不超 过一个细胞。
[0014] 在一个方面，本申请公开了方面5,任一前述方面的方法，其中一个或更多个区段 不包含任何细胞。
[0015] 在一个方面，本申请公开了方面6,任一前述方面的方法，其中流入被分隔的第一 微流通道的部分的单独的细胞（或细胞单元）的数目小于由于分隔产生的区段的数目。
[0016] 在一个方面，本申请公开了方面7,任一前述方面的方法，其中方法在包含两个或 更多个分隔通道的设备中进行，且细胞可从任何分隔通道的任何区段运送至任何细胞保持 室。
[0017] 在一个方面，本申请公开了方面8,方面7的方法，其中存在两个分隔通道。
[0018] 在一个方面，本申请公开了方面9,任一前述方面的方法，其中第一（分隔）微流通 道的内腔基本上无特征。
[0019] 在一个方面，本申请公开了方面10,方面1-9的任一项的方法，其中确定的特性是 细胞大小、形态、或存在或不存在胞外或胞内抗原。
[0020] 在一个方面，本申请公开了方面11，方面1-9的任一项的方法，其中确定的特性是 细胞行为。
[0021] 在一个方面，本申请公开了方面12,方面1-9的任一项的方法，其中确定的特性是 细胞对物理、化学或生物激发的响应。
[0022] 在一个方面，本申请公开了方面13,任一前述方面的方法，其中所述细胞通过大量 流体流运送。
[0023] 在一个方面，本申请公开了方面14,任一前述方面的方法，其中使用化合物歧管系 统从任何区段运送细胞至任何细胞保持室。
[0024] 在一个方面，本申请公开了方面15,任一前述方面的方法，其中从区段运送至细胞 保持室的每个细胞被运送通过（例如，流过）相同连接通道。
[0025] 在一个方面，本申请公开了方面16,任一前述方面的方法，其中所述区段的每个与 共同第二微流通道流体连通，且所述捕获的细胞被运送通过第二微流通道，输送至道指定 的细胞保持室。
[0026] 在一个方面，本申请公开了方面17,任一前述方面的方法，其中至少10个单独的 细胞（或细胞单元）被从区段运送至细胞保持室和/或至少10个细胞保持室被细胞占据。
[0027] 在一个方面，本申请公开了方面18,方面16或17的方法，其中化合物歧管连接至 少5个区段和至少5个细胞保持室。
[0028] 在一个方面，本申请公开了方面19,方面18的方法，其中化合物歧管连接至少10 个区段和至少10个细胞保持室。
[0029] 在一个方面，本申请公开了方面20,方面19的方法，其中化合物歧管连接至少10 个区段和至少10个细胞保持室。
[0030] 在一个方面，本申请公开了方面21，方面20的方法，其中化合物歧管连接至少20 个区段和至少20个细胞保持室。
[0031] 在一个方面，本申请公开了方面22,方面21的方法，其中化合物歧管连接至少10 个区段和至少10个至100个细胞保持室。
[0032] 在一个方面，本申请公开了方面23,方面22的方法，其中化合物歧管连接至少50 个区段和至少50个-100个细胞保持室。
[0033] 在一个方面，本申请公开了方面24,任一前述方面的方法，其中区段的数目与细胞 保持室的数目的比大于1。
[0034] 在一个方面，本申请公开了方面25,方面24的方法，其中区段的数目比细胞保持 室的数目大了约10%、约20%、约50%、约75%、约100%、或约200%倍。
[0035] 在一个方面，本申请公开了方面26,任一前述方面的方法，其中将多个细胞单独地 运送至同一细胞保持室，由此产生包含定义的细胞组合的细胞保持室。
[0036] 在一个方面，本申请公开了方面27,方面26的方法，其中将两个、=个或四个细胞 单独地运送至同一细胞保持室。
[0037] 在一个方面，本申请公开了方面28,方面27的方法，其中每个单独运送的细胞在 不同轮分隔中被捕获。
[0038] 在一个方面，本申请公开了方面29,任一前述方面的方法，其中流入第一微流通道 的细胞是真核细胞。
[0039] 在一个方面，本申请公开了方面30,方面29的方法，其中细胞是动物细胞。
[0040] 在一个方面，本申请公开了方面31，方面30的方法，其中细胞是人细胞。
[0041] 在一个方面，本申请公开了方面32,任一前述方面的方法，其中细胞是植物细胞。
[0042] 在一个方面，本申请公开了方面33,任一前述方面的方法，其中（a)中的包含多个 单独的细胞（或细胞单元）的溶液包含来自两种不同真核物种的细胞。
[0043] 在一个方面，本申请公开了方面34,任一前述方面的方法，其中（a)中的包含多个 单独的细胞（或细胞单元）的溶液包含来自相同物种的两种不同个体或样本的细胞。
[0044] 在一个方面，本申请公开了方面35,任一前述方面的方法，其中（a)中的多个单独 的细胞（或细胞单元）包括稀有细胞和其他细胞，步骤（d)中运送至细胞保持室的至少一 种细胞是稀有细胞，且所述溶液中所述其他细胞与所述稀有细胞的比大于100:1，有时大于 1000:1，有时大于10, 000:1，且有时大于100, 000:1。
[0045] 在一个方面，本申请公开了方面36,方面35的方法，其中稀有细胞是干细胞、肿瘤 细胞，任选地循环肿瘤细胞、循环内皮细胞、或胎儿细胞。
[0046] 在一个方面，本申请公开了方面37,方面1-36的任一项的方法，其中在细胞保持 室中培养细胞。
[0047] 在一个方面，本申请公开了方面38,方面37的方法，其中培养细胞约1小时至约4 星期。
[0048] 在一个方面，本申请公开了方面39,方面37的方法，其中培养细胞约1小时至约 24小时。
[0049] 在一个方面，本申请公开了方面40,方面37-39的任一项的方法，其中细胞分裂产 生后代。
[0050] 在一个方面，本申请公开了方面41，方面37-40的任一项的方法，其中在培养期间 观察细胞中。
[0051] 在一个方面，本申请公开了方面42,方面37-41的任一项的方法，其中在培养期间 激发细胞。
[0052] 在一个方面，本申请公开了方面43,方面37-42的任一项的方法，其中激发包括将 细胞暴露于试剂。
[0053] 在一个方面，本申请公开了方面44,方面43的方法，其中试剂是药物、测试试剂、 蛋白、核酸或小分子。
[0054] 在一个方面，本申请公开了方面45,方面37-44的任一项的方法，其中第一细胞或 细胞的组合被培养至少一小时，且然后在设备中通过细胞捕获、表征、和运送获得的一个或 更多个另外的细胞被引入细胞保持室。
[00巧]在一个方面，本申请公开了方面46,方面37-45的任一项的方法，其中培养一段时 间后，从细胞保持室中收获有存活力的细胞。
[0056] 在一个方面，本申请公开了方面47,方面37-46的任一项的方法，其中培养一段时 间后，将细胞保持室中的细胞原位固定。
[0057] 在一个方面，本申请公开了方面48,方面37-45的任一项的方法，其中将试剂、溶 液或物理刺激应用于在一个或更多个细胞保持室中的一个或多个细胞，并导致所述一个或 多个细胞的裂解。
[0058] 在一个方面，本申请公开了方面49,方面48的方法，其中将从裂解的细胞释放的 大分子运出至少一个细胞保持室。
[0059] 在一个方面，本申请公开了方面50,方面49的方法，其中收集大分子。
[0060] 在一个方面，本申请公开了方面51，方面49的方法，其中将从裂解的细胞释放的 大分子运出细胞保持室进入相应微流室，其中所述相应微流室与所述细胞保持室流体连通 且不与其他细胞保持室流体连通。
[0061] 在一个方面，本申请公开了方面52,方面50或51的方法，其中大分子是核酸，任选 地扩增所述核酸（任选地逆转录），且任选地所述核酸或相应扩增子在微流系统中测定，其 中所述步骤全部在流体回路内发生，其中任选地所述测定确定遗传特性或基因、RNA或蛋白 表达模式。
[0062] 在一个方面，本申请公开了方面53,微流设备中的室，其被配置W用于接收并保 持活细胞，该室包括：输入通道，其被配置使得有核的真核细胞可完整通过输入通道并进入 室；四个或更多个的多个排出通道，其被配置使得流体可W而有核的真核细胞不可W退出 该室；和气体透性膜，其把室和供给通道分开，其中供给通道被配置为将气体混合物带至 室，且气体透性膜被配置为使得气体可在室和供给通道之间互相交换。
[0063] 在一个方面，本申请公开了方面54,方面53的室，其中将室或输入通道连接至试 剂通道，所述试剂通道被配置用于供应用于保持或处理室中的细胞的流体，所述流体包含 一种或更多种试剂。
[0064] 在一个方面，本申请公开了方面55,方面54的室，其中将试剂通道连接至包含细 胞营养物质的流体的供给。
[0065] 在一个方面，本申请公开了方面56,方面54的室，其中将试剂通道连接至将流体 递送进入室后裂解细胞的流体的供给。
[0066] 在一个方面，本申请公开了方面57,方面53-56的任一项的室，其中输入通道朝向 室逐渐变尖细，由此指引细胞朝向室的中屯、。
[0067] 在一个方面，本申请公开了方面58,方面53-57的任一项的室，其中排出通道W允 许流体从输入通道流入室且流出排出通道而不吸引室中的细胞朝向排出通道的方式围绕 室分布。
[0068] 在一个方面，本申请公开了方面59,方面58的室，其中室具有基本上是环形或楠 圆形的周界，且排出通道超过周界的180度分布。
[0069] 在一个方面，本申请公开了方面60,方面53-59的任一项的室，所述室包含十个或 更多个排出通道。
[0070] 在一个方面，本申请公开了方面61，方面53-60的任一项的室，其中排出通道通过 排出口连接至室，且输入通道通过输入口连接至通道，且排出口的直径小于输入口的直径 的20%，由此抑制完整细胞通过进入排出通道。
[0071] 在一个方面，本申请公开了方面62,方面53-61的任一项的室，其中排出通道包含 珠或过滤器，由此抑制完整细胞通过进入排出通道。
[0072] 在一个方面，本申请公开了方面63,方面53-62的任一项的室，所述室足够大W容 纳至少3个真核细胞。
[0073] 在一个方面，本申请公开了方面64,方面53-63的任一项的室，所述室足够大W容 纳至少10个真核细胞。
[0074] 在一个方面，本申请公开了方面65,方面53-64的任一项的室，所述室跨在它最窄 处的直径至少50微米。
[00巧]在一个方面，本申请公开了方面66,方面53-65的任一项的室，所述室跨其最窄处 直径至少200微米。
[0076] 在一个方面，本申请公开了方面67,方面53-66的任一项的室，所述室包含凸形下 表面。
[0077] 在一个方面，本申请公开了方面68,方面53-67的任一项的室，所述室包含涂有促 进细胞粘附的物质的下表面。
[0078] 在一个方面，本申请公开了方面69,方面68的室，其中物质是细胞外基质。
[0079] 在一个方面，本申请公开了方面70,方面68的室，其中物质是纤连蛋白。
[0080] 在一个方面，本申请公开了方面71，方面53-70的任一项的室，其中室、输入通道、 和排出通道充满流体。
[0081] 在一个方面，本申请公开了方面72,方面53-71的任一项的室，所述室包含至少两 个真核细胞。
[0082] 在一个方面，本申请公开了方面73,包含根据方面53-71的任一项的四个或更多 个的多个室的设备，所述四个或更多个的多个室各具有它自己的单独的输入通道，其中每 个输入通道被配制为从共用源供给细胞。
[0083] 在一个方面，本申请公开了方面74,根据方面73的设备，其中单独的输入通道各 具有可独立于其他输入通道中的阀口操作的阀口。
[0084] 在一个方面，本申请公开了方面75,根据方面73或74的设备，其中单独的输入通 道是第一多路器的部分，且共用源是将第一多路器与第二多路器连接的连接通道，其中第 二多路器被配制为将细胞从多个不同的源递送至连接通道。
[0085] 在一个方面，本申请公开了方面76,根据方面75的设备，其中不同的源是共同分 隔通道的分隔的区域。
[0086] 在一个方面，本申请公开了方面77,保持培养中的细胞的方法，所述方法包括递送 细胞至根据方面53-72的任一项的室，通过输入通道或单独的试剂通道供给营养培养基进 入室，并且通过供给通道供给气体至气体透性膜。
[0087] 在一个方面，本申请公开了方面78,方面77的方法，所述方法还包括从细胞混合 物单独选择递送至室的细胞。
[0088] 在一个方面，本申请公开了方面79,从根据方面53-72的任一项的室中存在的一 个或更多个细胞提取细胞内组分的方法，所述方法包括通过递送导致细胞裂解的流体进入 室来裂解细胞，并从室回收裂解的产物。
[0089] 在一个方面，本申请公开了方面80，方面79的方法，其中产物通过排放通道回收。
[0090] 在一个方面，本申请公开了方面81，方面79或80的方法，其中产物包含核酸。
[0091] 在一个方面，本申请公开了方面82,方面78-81的任一项的方法，所述方法还包括 使产物经受化学或生物化学反应。
[0092] 在一个方面，本申请公开了方面83,在微流设备中的通道和阀口的构造，包括： (a)输入多路器，其包括：（i)四个或更多个的多个输入通道；（ii)多个输入阀口，其被配置 和排列W控制输入通道使得输入通道的任何一个中的流体可独立于其他输入通道中的流 体流动；（iii)一个或更多个合并通道，其被配置和排列W接受流过输入通道的任何一个 或更多个的流体并通过单一连接通道发送流体；化）连接通道；和（C)输出多路器，其包括： (i)四个或更多个的多个输出通道；扣）多个输出阀n，其被配置和排列W控制输出通道 使得输出通道的任何一个中的流体可独立于其他输出通道中的流体流动；（iii) 一个或更 多个分配通道，其被配置和排列W接收流过连接通道的流体并依据输出阀口的操作通过输 出通道的任何一个或更多个发送流体。
[0093] 在一个方面，本申请公开了方面84,方面83的构造，其中一个或更多个合并通道 是歧管。
[0094] 在一个方面，本申请公开了方面85,方面83或84的构造，其中从任何一个输入通 道通过合并通道至连接通道的路径长度相同。
[0095] 在一个方面，本申请公开了方面86,方面83-85的任一项的构造，其中一个或多个 分配通道是歧管。
[0096] 在一个方面，本申请公开了方面87,方面83-86的任一项的构造，其中从连接通道 通过分配通道至任何一个输出通道的路径长度相同。
[0097] 在一个方面，本申请公开了方面88,方面8