用于植物的转化方法的土壤杆菌属细菌的制作方法【
技术领域：
】[0001]本申请主张基于2013年3月29日提出的日本申请特愿2013-072177的优先权，在本说明书中引入其全部内容。[0002]本发明设及含有3种质粒的、用于植物的转化方法的±壤杆菌属细菌及其用途。【
背景技术：
】阳00引对于植物的转化而言，通常利用向植物细胞导入外来DNA的技术，使得能够在结果种子的后代或营养繁殖体中保持并表达外来基因。使用该技术，实际上能够对非常多的单子叶植物、双子叶植物进行转化。对于转化作物而言，除了玉米、水稻、小麦、大麦、高梁、大豆、油菜巧、向日葵、棉花、马铃馨、番茄等，还能制作水果类、其它的蔬菜类，在商业上也很受关注。[0004]在植物的转化方法中，已知有聚乙二醇法、电穿孔法、基因枪法等物理/化学的方法值NA的直接导入法）和利用±壤杆菌属细菌具有的功能的生物学的方法值NA的间接导入法）。在直接导入法中，高频率地发生使目的基因片段化而导入的、多拷贝导入的现象。因此，高频率地出现未表达目的基因的转化体、较弱地显示出异常表达（基因沉默）的转化体。另外，在使用原生质体的方法中，由于培养时间长期化，因此，在得到的转化体中，容易发生培养变异引起的种子不结果或崎形等。相比之下，经由±壤杆菌属细菌的基因导入法不容易发生运样的问题。在±壤杆菌属法中，通过控制Ti或化质粒的病原性区域（Vir区域）中的基因群的表达来导入目的基因。根据Vir基因所编码的蛋白质群，目的基因经过植物细胞与细菌的相互作用的识别和信号转导、Vir基因的表达诱导、IV型分泌通路的形成、T-DNA边界重复序列的识别、T-DNA链的形成、T-DNA链向植物细胞的转移和向核的转移、W及T-DNA向植物核基因组的插入等多个过程而导入。因此，较低地保持目标基因的导入拷贝数，发生片段化而导入的情况较少。其结果是，在得到的转化体中目标基因高表达的个体数量多且能稳定地得到，与直接导入法相比，存在表达量的个体之间差异较小的巨大优点。[0005]运样，±壤杆菌属法是非常优异的植物转化方法，但是，实际情况是转化的能否成功W及效率依赖于植物种类、基因型W及使用的植物组织，有很大差异（Po付ykusetal.，1997)。仍然不能W充分的效率进行转化的植物还有很多，在现实情况下，可W容易地获得多个转化体的作物的种类仅限定于一部分。因此，强烈地期望能够解决运样问题的改进方法。[0006]迄今为止开发了各种转化用载体，进行了解决上述问题的努力。W下，对与载体开发有关的背景进行说明。原来，野生型上壤杆菌属的Ti质粒巨大，为190化W上，因此，在标准的基因工程的方法中，难W在质粒上的T-DNA中插入基因。因此，开发了用于在T-DNA上插入外来基因的方法。首先，制作了作为具有从肿瘤性的Ti质粒的T-DNA中除去了植物成长调节物质合成基因的卸甲型Ti质粒的菌系的LBA4404化oekemaetal.,1983)、GV3850狂amb巧skietal.，1983)、GV3TillSE(化al巧etal.，1985)、C58-Z707〇fepburnetal.,1985)、GV3101::pMP90〇(onczandSchell,1986)、GV3101::pMP90服化onczandSchell,1986)、GV2260(McBrideandSumme;rfelt,1990)、NTI(pKPSF2)(Palanichelvametal.，2000)等。[0007]而且，通过使用运些菌株，开发了将期望的基因导入±壤杆菌的Ti质粒的T-DNA中、或者将具有期望的基因的T-DNA导入±壤杆菌的两种方法。其中一种方法被称为中间载体法（化aleyetal.,1983)，基因操作容易且可W插入期望的基因，是通过S系杂交法值ittaetal.，1980)经由同源重组将能够用大肠杆菌复制的中间载体导入±壤杆菌的卸甲型Ti质粒的T-DNA中同源重组的方法。另一种方法被称为双元载体法，该方法基于W下结果化eeandGelvin,2008):虽然在T-DNA向植物的插入中需要Vir区域，但为了使其发挥作用，并不需要存在于与T-DNA相同的质粒上化oekemaetal.,1983)。在该Vir区域中存在virA、virB、virC、virD、Vi巧及VirG等。双元载体是将T-DNA插入于在±壤杆菌和大肠杆菌两者中均能复制的小质粒中而得到的，将其导入具有卸甲型Ti质粒的±壤杆菌来使用。将双元载体导入±壤杆菌可W使用电穿孔法、=系杂交法等方法。在双元载体中存在地IN19度evan,1984)、pBI221(Jefferson,1987)、pGA482(Anetal.，1988)等，W此为基础能够构建大量新双元载体，可W用于转化化eeandGelvin，2008)。[0008]上壤杆菌属A281(Watsonetal.,197f5)是强病原性（super-virulence)的菌株，其宿主范围广，转化效率高于其它菌系化omarietal.，1986)。该特性依赖于具有A281的Ti质粒的pTiBo542(Jinet曰1.，1987)。[0009]迄今为止开发了使用pTiBo542的3种转化系统。第一种是使用了具有pTiBo542的卸甲型Ti质粒的菌系EHAlOl(Hoodetal.，1986)、EHA105(Hoodetal.，1993)、AGLO化azoetal.，1991)或AGLULazoetal.，1991)的转化系统。通过将运些菌系应用于上述的双元载体系统，可W作为转化能力高的系统而应用于各种植物的转化。[0010]第二种是超级双元载体系统（super-binaryvector)Glieietal.,1994;Ishidaetal.，1996)。由于该系统由具有vir区域（全部的virA、virB、virC、virD、vi巧及virG、virj)的卸甲型Ti质粒和具有T-DNA的质粒构成，因此是双元载体系统的一种。但是，在使用将从pTiBo542的Vir区域被切下的14.8化的化nl片段（VirDl基因的一部分、VirB基因、VirC基因及VirG基因）插入化omari,1990)具有T-DNA侧的质粒、即双元载体中而形成的超级双元载体方面不同。该化nl片段在最初的论文中被认为是15.8化Qinetal.，1987)，但准确而言为14.8化。需要说明的是，为了在具有超级双元载体的±壤杆菌中导入插入了期望的基因的T-DNA区域，可W使用经由S系杂交法的同源重组来作为容易的方法化omarietal.，1996)。已知该超级双元载体系统在许多植物种类中具有非常高的转化效率（Saitoetal.，1992;Hieietal.，1994;Ishidaetal.，1996)。报导了特别是在玉米的转化中，超级双元载体系统表现出卓越的效果（Ishidaetal.,1996)。另外，化annaand化ggard(2003)在通过使用不是强病原性的±壤杆菌属菌株LBA4404和超级双元载体PHK21的组合，成功地获得了用LBA4404和通常的双元载体抑K22的组合完全无法得到的小麦转化体。[0011]第S种是将在质粒上具有从pTiBo542的Vir区域被切下的14.8化的化nl片段（VirDl的一部分、virB、VirC及VirG)的质粒PT0K47Qinetal.，1987)作为用于提高转化效率的加强载体化OOStervector)追加导入双元载体系统的系统。通常，在双元载体系统中进一步追加加强载体的载体系统被称为元载体系统"，但是由于该系统在加强载体中含有上述14.8化的化nl片段，因此，在本说明书中将其特别称为"超级=元载体(super-ternaryvector)系统"。在该系统中，分别使用能在±壤杆菌属内共存的不亲合性组具有不同复制起点（ori)的质粒。在各自的ori中，Rep蛋白质（起始子）的编码区域是必须的，通常使其接近而使用。报导了利用PT0K47的超级S元载体系统在许多植物种类中显不出较高的转化效率（Wencketal.,1999;Tang，2003;DongandQu,2005!Arokiarajetal.，2009)。PT0K47的复制起点（ori)是IncW不亲合性组，在具有利用运些S元载体系统的报导例的T-DNA的质粒中主要使用了属于IncP不亲合性组的ori。报导了在超级双元载体系统中，使用了加强载体PT0K47的超级S元载体系统稍差，但在玉米的转化中是有用的（W02007/148819A1)。另外，有如下报道（Amo址etal.，2001;Wuetal.，2008):与PT0K47同样地，将来自pTiBo542Vir区域的14.8化化nl片段使用配置在与具有T-DNA的质粒不同的质粒上的超级S元载体系统进行了小麦的转化。Amo址etal.(2001)和Wuetal.(2008)使用的载体系统由虽然仅具有IncWori但是缺乏其rep基因的pGreen化ellensetal.,2000)、W及在反式部分具有IncW的rep基因且在自身复制中具有需要的IncP的o;riV的pSoup化ellensetal.,2000)构成。目P，采用了pSoupW补充pGreen的复制的形式在±壤杆菌中稳定地保持两者的质粒的结构。因此，特别被称为双重双元载体系统。但是，实际上可W认为是由卸甲型Ti质粒、双元载体pSoup及S元载体pGreen的3种质粒构成的超级=元载体系统。[0012]与oTiBo542的Vir区域有关的化解[0013]Jinetal.(1987)使各种长度的super-vir(pTiBo542的vir区域）附加性地保持在±壤杆菌中，评价了冠瘦的形成能力。该试验中，与通常的菌株A348-起使用了具有super-vir全部区域的强病原性菌株A281。其结果表明：在任一种菌株中，对于提高转化能力（冠瘦形成能力）而言，super-vir的Vi巧和VirG的附加是重要的。其另一方面，关于VirD或vi;rE区域，没有观察到附加效果（Jin,S.,Komari,T.,Gordon,M.P.,andP'Jester,E.W.(1987).GenesresponsibleforthesupervirulencephenotypeofAgrobacteriumtumefaciensA281.J.Bacteriol.169,4417-4425.T油Ie3及Figures)。[0014]另夕F，Hieietal.(1994)使用强病原性菌株A281的卸甲型菌株EHAlOl(PIG121血)、W及不仅具有通常的病原性（通常的Vir全区域）还在双元载体上保持了super-vir的一部分（virB、virC、VirG)的超级双元载体LBA4404(pT0K233)，比较了对水稻的转化能力。其结果确认了后者的转化效率更高。该情况表明：关于将super-vir区域用于转化用载体而言，与使用全部区域相比，使用一部分区域（VirB和VirG)的转化能力更高。[0015]关于VirD,VirDl和virD2在边界序列中形成缺口，产生T-DNA，特别是virD2与T-DNA形成复合体。可W认为virD3的保存性较低，在T-DNA的转移中不需要。virD4与Vi巧基因群一起构成IV型分泌系统。可W认为virD5是具有IV型分泌系统的信号功能的附属蛋白质（Ream,W.(2008).ProductionofamobileT-DNAbyAgrobacteriumtumefaciens.InAgrobacterium,T.TzfiraandV.Citovsky,eds(NewYork:SpringerScience+BusinessMedia,LLC)，卵.280-313.)。[0016]通常，对于载体而言，较小者容易进行插入期望的DM等的操作，因此优选小型的载体。另外，推测大肠杆菌可W稳定地保持的外来DNA为每细胞1200~1500化灯ao,Q.，andZhang,H.-B.(1998).CloningandstablemaintenanceofDNAfragmentsover300kbinEscherichiacoliwithconventionalplasmid-basedvectors.NucleicAcids民esearch264901-4909)。因此，大肠杆菌不能稳定地保持一定大小^上的质粒。例如，对于具有来自ColEl的复制起点的质粒而言，每大肠杆菌细胞存在30~40拷贝，因此，不能保持大于30~40化的质粒D[0017]关于pTiBo542的Vir区域，没有见解特别表明VirD区域和VirJ区域对使用上壤杆菌属细菌的转化是有用的。[0018]现有技术文献[0019]专利文献[0020]专利文献1:W02007/148819Al非专利文献[0021]非专利文献1:Amoah,B.K.，Wu,比，Sparks,C.，andJones,比D?口001)?FactorsinfluencingAgrobacterium-mediatedtransientexpressionofuidAinwheatinflorescencetissue.JExpBot52,1135-1142[002引非专利文献2:An，G.，Evert,P.R.，Mitra，A.,andHa，S.B.(1988).Binaryvectors.InPlantMolecularBiologyManualA3,S.B.Gelvinand民.A.Schilperoort，eds(Dordrecht:KluwerAcademicPress),pp.1-19[0023]非专利文献3:Arokiaraj,P.，Leelawathy,R.，andYeang,比Y?口009)?TheSupervirulencePlasmidpToK47fromAgrobacteriumtumefaciensA281ImprovesTransformationEfficiencyofHeveabrasiliensis.AmJBiochemBiotechnol5,137-141[0024]非专利文献4:Bevan,M.(1984)?BinaiyAgrobacteriumvectorsforplanttransformation.NucleicAcidsRes12,8711-8721[00巧]非专利文献5:Qiristie，PJ.(2〇04)?TypeIVSecretion:化eAgrobacteriumVirB/D4andrelatedconjugationsystems,BiochimBiopysActa1694,219-234[0026]非专利文献6:Citovsky,V.，deVos,G.，andZambiTski,P.(1988).Single-StrandedDNABindingProteinEncodedbythevirELocusofAgrobacteriumtumefaciens.Science240,501-504[0027]非专利文献7:Close，T.J.，Tait，R.C.，Rempel，吐C.，Hiro当前第1页1 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