专利名称：根癌土壤杆菌实时荧光pcr快速检测方法
技术领域：
本发明涉及植物检测方法，是一种根癌土壤杆菌实时荧光PCR快速检测方法。
背景技术：
目前，根癌土壤杆菌的检测方法，一般通过目测、培养基、免疫荧光鉴定等步骤后再进行指示植物鉴别及致病力检测。这种检测方法的不足是步骤繁琐，耗时长，有时超出苗木存活容许的时间范围，由于需要要对病原进行分离纯化，所以经常出现样品带菌少和分离纯化过程复杂而失败，从而造成漏检，导致疫情的逃逸和扩散。
发明内容
本发明目的是，提供一种根癌土壤杆菌实时荧光PCR快速检测方法，它可以实现实时监控整个PCR过程，使其具有时间短、更高的准确性和灵敏度，整个过程无需对PCR产物进行后期无害化处理，能够避免漏检及疫情的逃逸和扩散等。
本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现根癌土壤杆菌实时荧光PCR快速检测方法，其检测步骤如下1、材料采用根癌土壤杆菌菌株；
2、试剂DNA聚合酶，基因克隆载体；3、对细菌DNA及植物肿瘤组织的DNA的提取；首先对根癌土壤杆菌DNA的提取，挑取培养基上细菌菌落至液体培养基，28℃过夜振荡培养，波长600nm时吸收度值在0.4-0.8时，提取细菌DNA，或将细菌煮沸5分钟，裂解释放DNA；再对植物肿瘤组织DNA的提取，用注射法使根癌土壤杆菌感染落地生根，一到两周后叶片、茎上的感染部位形成肿瘤组织，切取植株的肿瘤组织、健康组织，提取总DNA备用；4、引物设计与合成引物1TCGCAAACCCGCTTTGTC和引物2TGTATTGCAGGATCAGGTTGTCA在引物对扩增片段区间找出根癌土壤杆菌稳定性点突变区，应用引物和探针设计根癌土壤杆菌特异探针AGCCACCGCCAAGCGTTGTCA，探针采用化学合成标记方法，5’端标记荧光染料，3’端标记淬灭荧光染料；5、实时荧光PCR检测反应将样品放入荧光PCR仪ABIPRISM7900型的96孔反应板上打开控制软件，按PCR循环参数，94℃预变性3min，94℃变性40s；退火温度设为54℃，时间40s，72℃延伸1min，循环扩增反应40次，设置PCR反应条件，PCR扩增体系10×Buffer2.5ul，25mmol/L Mgcl22.5ul，2.5mmol/L dNTP 2ul，5U/ulDNA聚合酶0.4ul，上、下游引物各1ul(10pmol/ul)，探针2ul(10pmol/ul)，DNA模板2ul，无菌超纯水补充至25ul；PCR产物电泳鉴定与测序用引物1和引物2对模板DNA进行常规PCR，将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上，120V电压电泳40min，置凝胶成像仪进行分析，从凝胶中回收PCR电泳产物并纯化，与基因克隆载体在连接酶的作用下，16℃连接40分钟，将上述连接产物10ul与100ul大肠杆菌B21感受态细胞混合转化，并涂布于含抗生素的固体培养基上进行蓝白斑筛选，挑取白色菌落在含氨苄青霉素的液体培养基中37℃过夜培养；6、实时荧光PCR检测的特异性将发根农杆菌、大肠杆菌B21、白菜软腐病菌、风信子黄腐病菌、香石竹细菌性萎蔫病菌、梨火疫病菌、豌豆细菌性萎蔫病菌、番茄溃疡病菌以1.4.2反应体系进行实时荧光PCR扩增反应，观察反应结果；7、阳性植物材料的实时荧光PCR检测将植物肿瘤组织中感病及健康组织的总DNA进行以PCR循环参数反应体系进行实时荧光PCR扩增反应；8、实时荧光PCR检测的灵敏度将109CFU/mL根癌土壤杆菌菌液按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5做梯度稀释，煮沸5分钟，裂解释放DNA，以PCR循环参数反应体系循环35次进行PCR扩增反应；9、检测结果根癌土壤杆菌毒区基因克隆片段长311bp，将测序结果与基因库中的序列用软件进行同源性分析，结果表明本试验的克隆片段与已发表的相应片段具有100％的同源性；利用引物1和引物2及荧光探针，对根癌土壤杆菌进行实时荧光PCR检测，具有强的荧光信号增加，表现为阳性扩增，荧光探针对根癌土壤杆菌有很强的特异性，可以把根癌土壤杆菌与其它细菌菌株分开；在以植物肿瘤组织、健康植物组织等供试植物材料总DNA为模板的实时荧光PCR反应中，检测结果显示只有肿瘤组织的反应有荧光信号增加，而健康植物组织中无荧光信号增加。
本发明的优点在于能够快速、敏感、准确地检测进境种苗中的根癌土壤杆菌，建立了一种可应用于日常检测的方法，有效地避免了假阳性和假阴性。本发明所述的荧光PCR技术操作步骤简单，具有自动化程度高、检测快速、灵敏度高的特点，另外整个过程闭管操作，减少了体系污染的可能，降低了检测结果的假阳性几率等。
具体实施例方式
本发明的根癌土壤杆菌实时荧光PCR快速检测方法，其检测步骤如下1、材料采用根癌土壤杆菌菌株；2、试剂DNA聚合酶，基因克隆载体；3、对细菌DNA及植物肿瘤组织的DNA的提取；首先对根癌土壤杆菌DNA的提取，挑取培养基上细菌菌落至液体培养基，28℃过夜振荡培养，波长600nm时吸收度值在0.4-0.8时，提取细菌DNA，或将细菌煮沸5分钟，裂解释放DNA；再对植物肿瘤组织DNA的提取，用注射法使根癌土壤杆菌感染落地生根，一到两周后叶片、茎上的感染部位形成肿瘤组织，切取植株的肿瘤组织、健康组织，提取总DNA备用；4、引物设计与合成引物1TCGCAAACCCGCTTTGTC和引物2TGTATTGCAGGATCAGGTTGTCA在引物对扩增片段区间找出根癌土壤杆菌稳定性点突变区，应用引物和探针设计根癌土壤杆菌特异探针AGCCACCGCCAAGCGTTGTCA，探针采用化学合成标记方法，5’端标记荧光染料，3’端标记淬灭荧光染料；5、实时荧光PCR检测反应将样品放入荧光PCR仪ABIPRISM7900型的96孔反应板上打开控制软件，按PCR循环参数，94℃预变性3min，94℃变性40s；退火温度设为54℃，时间40s，72℃延伸1min，循环扩增反应40次，设置PCR反应条件，PCR扩增体系10×Buffer2.5ul，25mmol/L Mgcl22.5ul，2.5mmol/L dNTP 2ul，5U/ulDNA聚合酶0.4ul，上、下游引物各1ul(10pmol/ul)，探针2ul(10pmol/ul)，DNA模板2ul，无菌超纯水补充至25ul；PCR产物电泳鉴定与测序用引物1和引物2对模板DNA进行常规PCR，将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上，120V电压电泳40min，置凝胶成像仪进行分析，从凝胶中回收PCR电泳产物并纯化，与基因克隆载体在连接酶的作用下，16℃连接40分钟，将上述连接产物10ul与100ul大肠杆菌B21感受态细胞混合转化，并涂布于含抗生素的固体培养基上进行蓝白斑筛选，挑取白色菌落在含氨苄青霉素的液体培养基中37℃过夜培养；6、实时荧光PCR检测的特异性将发根农杆菌、大肠杆菌B21、白菜软腐病菌、风信子黄腐病菌、香石竹细菌性萎蔫病菌、梨火疫病菌、豌豆细菌性萎蔫病菌、番茄溃疡病菌以1.4.2反应体系进行实时荧光PCR扩增反应，观察反应结果；
7、阳性植物材料的实时荧光PCR检测将植物肿瘤组织中感病及健康组织的总DNA进行以PCR循环参数反应体系进行实时荧光PCR扩增反应；8、实时荧光PCR检测的灵敏度将109CFU/mL根癌土壤杆菌菌液按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5做梯度稀释，煮沸5分钟，裂解释放DNA，以PCR循环参数反应体系循环35次进行PCR扩增反应；9、检测结果根癌土壤杆菌毒区基因克隆片段长311bp，将测序结果与基因库中的序列用软件进行同源性分析，结果表明本试验的克隆片段与已发表的相应片段具有100％的同源性；利用引物1和引物2及荧光探针，对根癌土壤杆菌进行实时荧光PCR检测，具有强的荧光信号增加，表现为阳性扩增，荧光探针对根癌土壤杆菌有很强的特异性，可以把根癌土壤杆菌与其它细菌菌株分开；在以植物肿瘤组织、健康植物组织等供试植物材料总DNA为模板的实时荧光PCR反应中，检测结果显示只有肿瘤组织的反应有荧光信号增加，而健康植物组织中无荧光信号增加。
权利要求
1.根癌土壤杆菌实时荧光PCR快速检测方法，其特征在于检测步骤如下(1)材料采用根癌土壤杆菌菌株；(2)试剂DNA聚合酶，基因克隆载体；(3)对细菌DNA及植物肿瘤组织的DNA的提取；首先对根癌土壤杆菌DNA的提取，挑取培养基上细菌菌落至液体培养基，28℃过夜振荡培养，波长600nm时吸收度值在0.4-0.8时，提取细菌DNA，或将细菌煮沸5分钟，裂解释放DNA；再对植物肿瘤组织DNA的提取，用注射法使根癌土壤杆菌感染落地生根，一到两周后叶片、茎上的感染部位形成肿瘤组织，切取植株的肿瘤组织、健康组织，提取总DNA备用；(4)引物设计与合成引物1TCGCAAACCCGCTTTGTC和引物2TGTATTGCAGGATCAGGTTGTCA在引物对扩增片段区间找出根癌土壤杆菌稳定性点突变区，应用引物和探针设计根癌土壤杆菌特异探针AGCCACCGCCAAGCGTTGTCA，探针采用化学合成标记方法，5’端标记荧光染料，3’端标记淬灭荧光染料；(5)实时荧光PCR检测反应将样品放入荧光PCR仪ABIPRISM7900型的96孔反应板上打开控制软件，按PCR循环参数，94℃预变性3min，94℃变性40s；退火温度设为54℃，时间40s，72℃延伸1min，循环扩增反应40次，设置PCR反应条件，PCR扩增体系10×Buffer2.5u1，25mmol/L Mgcl22.5ul，2.5mmo1/L dNTP 2ul，5U/ulDNA聚合酶0.4ul，上、下游引物各1ul(10pmol/u1)，探针2ul(10pmol/u1)，DNA模板2u1，无菌超纯水补充至25ul；PCR产物电泳鉴定与测序用引物1和引物2对模板DNA进行常规PCR，将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上，120V电压电泳40min，置凝胶成像仪进行分析，从凝胶中回收PCR电泳产物并纯化，与基因克隆载体在连接酶的作用下，16℃连接40分钟，将上述连接产物10ul与100ul大肠杆菌B21感受态细胞混合转化，并涂布于含抗生素的固体培养基上进行蓝白斑筛选，挑取白色菌落在含氨苄青霉素的液体培养基中37℃过夜培养；(6)实时荧光PCR检测的特异性将发根农杆菌、大肠杆菌B21、白菜软腐病菌、风信子黄腐病菌、香石竹细菌性萎蔫病菌、梨火疫病菌、豌豆细菌性萎蔫病菌、番茄溃疡病菌以1.4.2反应体系进行实时荧光PCR扩增反应，观察反应结果；(7)阳性植物材料的实时荧光PCR检测将植物肿瘤组织中感病及健康组织的总DNA进行以PCR循环参数反应体系进行实时荧光PCR扩增反应；(8)实时荧光PCR检测的灵敏度将109CFU/mL根癌土壤杆菌菌液按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5做梯度稀释，煮沸5分钟，裂解释放DNA，以PCR循环参数反应体系循环35次进行PCR扩增反应；(9)检测结果根癌土壤杆菌毒区基因克隆片段长311bp，将测序结果与基因库中的序列用软件进行同源性分析，结果表明本试验的克隆片段与已发表的相应片段具有100％的同源性；利用引物1和引物2及荧光探针，对根癌土壤杆菌进行实时荧光PCR检测，具有强的荧光信号增加，表现为阳性扩增，荧光探针对根癌土壤杆菌有很强的特异性，可以把根癌土壤杆菌与其它细菌菌株分开；在以植物肿瘤组织、健康植物组织等供试植物材料总DNA为模板的实时荧光PCR反应中，检测结果显示只有肿瘤组织的反应有荧光信号增加，而健康植物组织中无荧光信号增加。
全文摘要
本发明公开了一种根癌土壤杆菌实时荧光PCR快速检测方法，其检测步骤如下1.材料采用根癌土壤杆菌菌株；2.试剂DNA聚合酶，基因克隆载体；3.对细菌DNA及植物肿瘤组织的DNA的提取；4.引物设计与合成；5.实时荧光PCR检测反应；6.实时荧光PCR检测的特异性；7.阳性植物材料的实时荧光PCR检测；8.实时荧光PCR检测的灵敏度；9.检测结果。本发明能够快速、敏感、准确地检测进境种苗中的根癌土壤杆菌，建立了一种可应用于日常检测的方法，有效地避免了假阳性和假阴性。本发明所述的荧光PCR技术操作步骤简单，具有自动化程度高、检测快速、灵敏度高的特点，另外整个过程闭管操作，减少了体系污染的可能，降低了检测结果的假阳性几率等。
文档编号C12Q1/02GK1844896SQ20061004223
公开日2006年10月11日 申请日期2006年2月5日 优先权日2006年2月5日
发明者吴兴海, 邵秀玲 申请人:吴兴海