专利名称：一种虫草菌粉亮氨酸含量快速检测方法
技术领域：
本发明涉及虫草菌粉氨基酸含量检测领域，尤其涉及一种虫草菌粉亮氨酸含量快速检测方法。
背景技术：
冬虫夏草属于子囊菌纲、麦角科、虫草属，是我国特有的名贵强壮滋补中药材。由于天然冬虫夏草产区具有局限性，产量稀少，加上长期以来乱采滥挖造成生态破坏严重，野生虫草远远不能满足日益增长的市场需求。因此大量替代品被开发，其中最有效的是人工发酵虫草菌粉，即将分离的天然冬虫夏草真菌菌株进行发酵，得到菌丝体，再经纯化加工后得到干燥的真菌粉末。虫草菌粉中含有多种不同类型的化合物，营养丰富，具有增强身体免疫力，抗疲劳，抗肿瘤，保肝护肝，改善心血管功能，治疗肾脏衰竭等多种药理活性和功能。氨基酸作为主要功能性成分之一，在虫草菌粉中的含量可达20 40%，且包含所有人体必需氨基酸。必需氨基酸中包含有三种支链氨基酸，亮氨酸即是其中一种。研究表明，运动与蛋白质合成的分子调节直接与亮氨酸浓度水平有关；亮氨酸还对胰岛素信号有修饰作用，可纠正糖代谢异常并明显减少体脂肪含量。在天然虫草中，亮氨酸的含量在
2.2g/100g左右，而市场上所销售的发酵虫草菌粉亮氨酸含量和比例差异却很大，因此，对发酵虫草菌粉中亮氨酸含量进行检测，可以作为发酵虫草菌粉质量的评价标准之一，对控制产品质量有重要意义。传统的氨基酸检测方法多是使用以离子交换色谱分离各种氨基酸为基础的氨基酸自动分析仪。根据GB T5009. 124-2003，该方法分析步骤为先称取一定量的样品于水解管内，再加入6mol/L的盐酸，新蒸馏的苯酚，将水解管冷冻，再抽真空充氮气，重复三次后， 将已封口的水解管放在110 ± I °C的恒温干燥箱内水解22h ；再将水解液全部转移到50mL容量瓶内用去离子水定容；最后准确吸取O. 200mL混合氨基酸标准溶液，用pH2. 2缓冲液稀释到5mL，此标准稀释液浓度为5. ΟΟηπιοΙ/δΟμ L，作为测定用的氨基酸标准液；用氨基酸自动分析仪外标法测定样品待测液的氨基酸含量。该方法样本预处理耗时耗力、操作复杂，并且需使用多种化学试剂，不仅会对环境造成一定污染，有的还会对人体造成一定伤害。因此， 急需研究一种简单、快速、无损的氨基酸检测方法和技术。电磁波波长800 2500nm范围内为物质分子振动光谱的倍频和组合频谱带，含氢基团C-H，0-H, N-H, S-H对光波有很强的吸收，因而包含了绝大多数类型有机物组分和分子结构的丰富信息，可用于物质有机物质含量的定量测定。近红外光谱由于其可实现快速、无破坏、无污染、低消耗地分析样品组分，已广泛应用于农业、制药、食品和化工等领域，在快速检测、产品质量研究中具有很大的应用潜力。
发明内容
本发明提供了一种虫草菌粉亮氨酸含量快速检测方法，用于虫草菌粉中亮氨酸含量的快速、无损、准确检测，解决了现有检测方法操作繁琐、耗时、耗力、成本高、污染环境等问题。一种虫草菌粉亮氨酸含量快速检测方法，包括(I)取虫草菌粉,分别米集波长 1213nm、1417nm、1475nm、1536nm、1697nm、1741nm、 1782nm、1845nm、1922nm、2010nm、2059nm、2115nm 和 2205nm 光波所对应的虫草菌粉的反射率；(2)将各反射率转化为相应的吸光度；(3)将各吸光度代入多元线性回归方程y = -4. 718 λ ^0. 72 λ 2+29. 85 λ 3-31· 20
6λ 4-33· 143 λ 5+78. 637 λ 6-16. 819 λ 7-37. 782 λ 8+34. 359 λ 9-18. 701 λ 1(ι-9. 296 λ η-27. 276 λ 12+23. 373 λ 13+2. 564，计算得到虫草菌粉中亮氨酸的含量；方程中，y为虫草菌粉中亮氨酸的含量，单位为g/100g;Xi λ 13分别为波长 1213nm、1417nm、1475nm、1536nm、1697nm、1741nm、1782nm、1845nm、1922nm、2010nm、2059nm、 2115nm和2205nm光波所对应的虫草菌粉的吸光度。由于虫草菌粉样本是非透明介质，当光波照射在其表面时，除部分被吸收外，其余均发生反射，而光波吸收的多少(或者反射率)是跟虫草菌粉内部化学物质含量相关的。但对其中的亮氨酸来说，这类物质的含量仅跟少数特征波长下的反射率有关。步骤(I)中，所述虫草菌粉的粒径优选为80-100目。所述的虫草菌粉可以为天然虫草经干燥、粉碎后得到的粉末；也可以为人工发酵虫草经干燥、粉碎后得到的粉末。采用人工发酵虫草时，所述的虫草菌粉可以为市售产品，包括发酵虫草菌丝体粉原料、胶囊制剂内容物、蛹虫草菌丝体粉等。所述的虫草菌粉还可以通过如下方法制备将经活化的虫草菌株接种到液体培养基中进行发酵培养，发酵培养后分离得到菌丝体；菌丝体经烘干、粉碎后，得到虫草菌粉。优选地，所述的分离为离心分离，离心的转速为1200转/分钟，离心的时间为20 分钟，这样可以将培养基和菌丝有效分离。优选地，所述的烘干温度为95_105°C。该烘干条件下能减少对虫草菌粉中有益成分(特别是亮氨酸)的破坏。步骤⑵中，反射率转化为吸光度采用如下公式A = log(l/R)；式中，R为反射率，A为吸光度。步骤(3)中，对所述的吸光度进行平滑处理，将平滑处理得到的数值代入所述多元线性回归方程；方程中，A1 λ 13分别为波长1213nm、1417nm、1475nm、1536nm、1697nm、 1741nm、1782nm、1845nm、1922nm、2010nm、2059nm、2115nm 和 2205nm 光波所对应的虫草菌粉
的吸光度经平滑处理后得到的数值。所述的平滑处理优选为Savitzky Golay卷积平滑处理(Savitzky Golay Smoothing)。Savitzky Golay Smoothing卷积平滑处理利用最小二乘法进行最佳拟合,是一种直接处理来自时间域内数据平滑问题的方法。相较其它平滑处理方法能最大程度地保留原始数据相对极大值、极小值和宽度等的分布特性，通过Savitzky Golay Smoothing卷积平滑处理可以有效去除高频噪音，提高信噪比。特征波长的选取或多元线性回归方程的构建会较大程度地影响待测物的检测效果。本发明采取如下方法用傅里叶变换红外光谱采集波长为800 2500nm光波下虫草菌
4粉的反射率，以所获得的全部样本的全波段光谱对虫草菌粉亮氨酸含量进行偏最小二乘回归分析(Partial least squares, PLS);建立模型之后,取拟合效果最好的主成分数目下计算各波长与亮氨酸含量相关程度大小，截取相关度较大的波段，按照波长大小趣出其相关度数值变化图，找出图中波峰波谷位置的波长即为特征波长；将特征波长的反射率值经转化后作为多元线性回归模型的输入变量，实际测量的亮氨酸含量作为输出变量，通过计算可以得到相应的多元线性回归方程。本发明通过上述方法，选取的特征波长分别为1213nm、1417nm、1475nm、1536nm、 1697nm、1741nm、1782nm、1845nm、1922nm、2010nm、2059nm、2115nm 和 2205nm，构建得到上述
的多元线性回归方程，对虫草菌粉中的亮基酸含量预测效果最好。本发明通过少数特征波长进行多元线性回归分析，实现了虫草菌粉中亮氨酸含量的快速、无损、准确检测，大大减少了操作步骤，缩短了检测时间，减少了环境污染，降低了检测成本。
图I为本发明实施例中基于PLS全波段建模在最优主成分数目下的各波长与亮氨酸含量相关度变化图；图2为本发明实施例中建模集样本预测结果散点分布图；图3为本发明实施例中预测集样本预测结果散点分布图。
具体实施例方式实施例发酵虫草菌粉中亮氨酸含量检测随机收集189份杭州中美华东制药有限公司生产的发酵虫草菌粉，为使采集的样本更具代表性和多样性，样本包括保质期内不同年月的批号。可使样本中的亮氨酸含量具有更大的范围，使所建模型具有更好的适应性和鲁棒性。(I)将189个发酵虫草菌粉样本烘干至恒重，然后使用布鲁克傅里叶变换光谱仪 MPA测定发酵虫草菌粉样本全波段光谱的反射率值，同时利用背景技术所提及的传统方法用全自动氨基酸分析仪Biochrom 30+测量所有样本中亮氨酸的含量，色谱柱为Na+阳离子交换柱。(2)随机选取129个样本作为建模集样本，其余60个作为预测集样本。(3)将所得所有样本的反射率转化为吸光度值,并做Savitzky Golay Smoothing 卷积平滑处理。(4)用傅里叶变换光谱仪获得的建模集的全光谱对亮氨酸含量进行偏最小二乘回归分析，建立模型之后，取拟合效果最好的主成分数目下(此样本中为9个主成分)计算各波长与亮氨酸含量相关程度大小，截取相关度较大的波段，按照波长大小趣出其相关度数值变化图(图I)，找出该图中波峰波谷位置的波长作为特征波长，分别为1213nm、 1417nm、1475nm、1536nm、1697nm、1741nm、1782nm、1845nm、1922nm、2010nm、2059nm、2115nm 和 2205nm。(5)然后将建模集的各特征波长所对应的值作为自变量，相应的实际测量得到的发酵虫草菌粉中亮氨酸含量作为因变量，利用多元线性回归方法(Multiple linearregression, MLR)得到如下多元线性回归方程y = -4. 718 λ !+0· 72 λ 2+29· 85 λ 3_31· 206 λ 4—33. 143 λ 5+78· 637 λ 6_16· 819 λ 7_3
7.782 λ 8+34. 359 λ 9-18. 701 λ 1(ι-9. 296 λ η-27. 276 λ 12+23. 373 λ 13+2. 564方程中，y为发酵虫草菌粉中亮氨酸的含量，单位为g/100g DW ; λ i λ 13分别为波长 1213nm、1417nm、1475nm、1536nm、1697nm、1741nm、1782nm、1845nm、1922nm、2010nm、 2059nm、2115nm和2205nm所对应的发酵虫草菌粉样品吸光度经过Savitzky Golay Smoothing卷积平滑处理后的数值。利用上述多元线性回归方程对建模集和预测集发酵虫草菌粉的亮氨酸含量进行预测，并对预测结果进行评价。评价指标中相关系数越接近于1，均方根误差、偏差的绝对值和截距的绝对值越小，说明模型预测性能越好。结果如下表I
权利要求
1.一种虫草菌粉亮氨酸含量快速检测方法，包括(1)取虫草菌粉，分别采集波长1213nm、1417nm、1475nm、1536nm、1697nm、1741nm、 1782nm、1845nm、1922nm、2010nm、2059nm、2115nm 和 2205nm 光波所对应的虫草菌粉的反射率；(2)将各反射率转化为相应的吸光度；(3)将各吸光度代入多元线性回归方程y= -4. 718 λ ^0. 72 λ 2+29. 85 λ 3-31· 206 λ 4-33. 143 λ 5+78· 637 λ 6_16· 819 λ 7_37· 782 λ 8+34· 359 λ 9_18· 701 λ 1(Γ9· 296 λ η_27· 276 λ 12+23.373 λ 13+2. 564，计算得到虫草菌粉中亮氨酸的含量；方程中，Y为虫草菌粉中亮氨酸的含量，单位为g/100g ; λ i λ 13分别为波长1213nm、 1417nm、1475nm、1536nm、1697nm、1741nm、1782nm、1845nm、1922nm、2010nm、2059nm、2115nm 和2205nm光波所对应的虫草菌粉的吸光度。
2.根据权利要求I所述的虫草菌粉亮氨酸含量快速检测方法，其特征在于，步骤(I) 中，所述虫草菌粉的粒径为80-100目。
3.根据权利要求I所述的虫草菌粉亮氨酸含量快速检测方法，其特征在于，步骤(I) 中，所述的虫草菌粉通过如下方法制备将经活化的虫草菌株接种到液体培养基中进行发酵培养，发酵培养后分离得到菌丝体；菌丝体经烘干、粉碎后，得到虫草菌粉。
4.根据权利要求3所述的虫草菌粉亮氨酸含量快速检测方法，其特征在于，所述的烘干温度为95-105°C。
5.根据权利要求I所述的虫草菌粉亮氨酸含量快速检测方法，其特征在于，步骤(3) 中，对所述的吸光度进行平滑处理，将平滑处理得到的数值代入所述多元线性回归方程； 方程中，λ ! λ 13 分别为波长 1213nm、1417nm、1475nm、1536nm、1697nm、1741nm、1782nm、 1845nm、1922nm、2010nm、2059nm、2115nm和2205nm光波所对应的虫草菌粉的吸光度经平滑处理后得到的数值。
6.根据权利要求5所述的虫草菌粉亮氨酸含量快速检测方法，其特征在于，所述的平滑处理为Savitzky Golay卷积平滑处理。
全文摘要
本发明公开了一种虫草菌粉亮氨酸含量快速检测方法，包括取虫草菌粉，分别采集波长1213nm、1417nm、1475nm、1536nm、1697nm、1741nm、1782nm、1845nm、1922nm、2010nm、2059nm、2115nm和2205nm光波所对应的虫草菌粉的反射率；将各反射率转化为相应的吸光度；将各吸光度代入多元线性回归方程，计算得到虫草菌粉中亮氨酸的含量。本发明通过少数特征波长进行多元线性回归分析，实现了虫草菌粉中亮氨酸含量的快速、无损、准确检测，大大减少了操作步骤，缩短了检测时间，减少了环境污染，降低了检测成本。
文档编号G01N21/35GK102590134SQ20121005234
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月1日 优先权日2012年3月1日
发明者何勇, 徐宁, 魏萱 申请人:浙江大学