专利名称：耐热菌的elisa快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种耐热菌的检测方法，具体是耐热菌的ELISA快速 检测方法，属于食品微生物检测领域。
背景技术：
ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)为酶联免疫分析技术 的縮写，该方法是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与 酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的分析技术。其 基本原理是①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫 活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原 或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，被检样品(含 有受检的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体与固相载体表面的抗原或抗体 结合。通过洗涤除去未结合的游离反应物，最后，结合在固相载体上的 酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物
被酶催化变为有色产物，产物的量与样品中受检物质的量直接相关，使 用酶标仪即可定性或定量分析。
旨i:5f月旨;^ffilf， (y4//qyc/o6ac///us ac/cfoferra^r&)， iJ^^月旨l&自 芽孢杆菌属(^//c;^/o6""7/"s)的一员，是一种耐热、嗜酸的细菌，俗称 耐热菌。苹果浓縮汁中的耐热菌芽孢能经受酸性条件下的巴氏杀菌过程 而存活，在适宜条件下，在果汁中大量繁殖时，产生不良气味化合物， 同时使果汁产生轻微沉淀或雾状浑浊，对果汁感官品质有很大影响。尽 管耐热菌并不致病，也不产生毒素，但其引起的果汁感官性状劣变，甚至引起果汁腐败，完全破坏了果汁的食用性和商品价值。所以，国际贸 易中对耐热菌含量要求很严，是苹果浓縮汁产品的必检项目，常常成为 苹果浓縮汁贸易中的技术壁垒，从而为苹果浓縮汁的生产、贸易和商检 提出了新的挑战。
我国鲜苹果出口量和出口额分别位居世界第一位和第五位，苹果浓
縮汁出口量居世界第一位，占60%的国际市场份额。然而耐热菌的超标 是苹果浓縮汁质量安全的一个常见问题，解决这一问题的关键之一是要 有快速、特异、灵敏的检测技术手段，以便及时反馈到生产线，实施有 效的控制，以保证产品质量与安全。
目前，国内外对苹果浓縮汁中耐热菌检测的通用方法是细菌平皿培 养记数法，检测周期为4-5天，不能及时有效控制产品质量安全。关于 耐热菌快速检测方法，有日本学者建立的RT-PCR检测方法，国内有陕 西师范大学食品工程与营养科学学院建立的PCR及QC-PCR检测方法。 基于PCR的耐热菌检测方法，虽达到了快速、特异，但对设备和实验 条件要求高，步骤较繁锁，推广应用较困难。
发明内容
本发明的目的是公开一种耐热菌的ELISA快速检测方法，解决目前 耐热菌检测方法存在的缺陷。 本发明的操作步骤如下
耐热菌的捕集一耐热菌预增菌一耐热菌包被酶标板一封闭酶标板一 加耐热菌多克隆抗体一加酶标抗体一加底物工作液一酶标仪测定。
本发明将样品中捕集到的耐热菌抗原包被在固相载体上，形成固相 抗原，加入封闭液，封闭没有包被到的酶标板空隙部分，从而降低非特 异性吸附。加入耐热菌多克隆抗体，其中抗体与固相抗原形成抗原-抗体复合物，再加入酶标抗体，与上述复合物结合，此时加入底物工作液， 复合物上的酶则催化底物而显色，由于每步之间均有冲洗步骤，因此， 若样品中不含耐热菌，则耐热菌多克隆抗体、酶标抗体将被洗掉，底物
不显色而呈阴性反应；若样品中含有耐热菌，经过预增菌则可以达到所 需检测浓度，最终使底物显色而呈阳性反应。本发明简便、易行，适合 于现场检测，检测限可达国际标准，可满足苹果浓縮汁中耐热菌不得超 过1个/10mL的检测标准要求，整个操作过程可以在24小时内完成，可 成功用于果汁中耐热菌的快速检测。
具体实施例方式
本发明按以下具体步骤进行
a.耐热菌的捕集
a.l取10-20g待检苹果浓縮汁，以无菌水适度稀释， a.2用溶剂过滤器过滤捕集耐热菌，滤膜孔径0.45pm，
a. 3耐热菌被截留于滤膜表面；
b. 耐热菌预增菌
b.l采用402培养基预增菌14-15h，使培养液中耐热菌浓度达到5xl04 个/mL以上，
b, 2将增菌后的培养液以10000-12000rpm/min，离心10-15min;
c. 耐热菌包被酶标板
c.l用0.05mol/L、 pH9.6的碳酸缓冲液制成菌悬液作为包被液，
c2将包被液均匀加到酶标板中，每孔100-150pL,
c.3酶标板在55-6(TC烘箱中2-3 h烘干，
c.4用0.01mol/L， pH7.4的PBS-吐温20洗板，
c.5每隔1分钟洗板一次，共洗板5-6次，c. 6洗完之后，倒扣酶标板，轻轻拍掉悬浮液珠；
d. 封闭酶标板
d.l封闭液为5% - 8%的脱脂奶粉，
d.2将封闭液均匀的加到酶标板各孔中，每孔200-300^iL， d.3在37。C温箱中孵育2-3 h， d.4洗板
d.4.1用0.01mol/L、 pH7.4的PBS-吐温20洗板 d.4.2每隔1分钟洗板一次，共洗板5-6次
d. 4.3洗完之后，倒扣酶标板，轻轻拍掉悬浮液珠；
e. 加耐热菌多克隆抗体
e.l耐热菌多克隆抗体为免疫大白兔得到的多克隆抗体， e.2免疫程序为
e.2.1给大白兔耳静脉注射耐热菌，注射的耐热菌浓度为1X108- 1 Xl(f个/mL，每隔4天注射一次，共注射6次，第一次注射量为0.5 mL， 以后每次注射量比上一次增加0.5 mL
e.2.2免疫注射6次后，于第22-25天取血，分离血清即为耐热菌多 克隆抗血清
e.2.3将耐热菌多克隆抗血清经过盐析、DEAE-纤维素层析纯化即得 耐热菌多克隆抗体，
e.3耐热菌多克隆抗体与PBS-吐温20的稀释比例为1 : 1600，
e.4将稀释的耐热菌多克隆抗体加到酶标板各孔中，每孔 跳150nL，
e.5在37。C温箱中孵育1-2 h，
e.6洗板e.6.1用0.01mol/L、 pH7.4的PBS-吐温20洗板 e.6.2每隔1分钟洗板一次，共洗板5-6次
e. 6.3洗完之后，倒扣酶标板，轻轻拍掉悬浮液珠；
f. 加酶标抗体
f.l酶标抗体为酶标山羊抗兔抗体，
f.2酶标抗体与PBS-吐温20的稀释比例为1 : 20000,
[3将稀释的酶标抗体加到酶标板各孔中，每孔加100-150^iL，
f.4 37。C温箱中孵育1-2 h，
f.5洗板
f.5.1用0.01mol/L， pH7.4的PBS-吐温20洗板 f.5.2每隔1分钟洗板一次，共洗板5-6次
f. 5.3洗完之后，倒扣酶标板，轻轻拍掉悬浮液珠；
g. 加底物工作液
g.l底物工作液配方如下
g.1.1取25.7mL 0.2mol/LNa2HP04和24.3mL O.lmol/L拧檬酸液放入 lOOmL容量瓶，用蒸馏水定容至刻度即为底物缓冲液
g丄2精确称取0.02g3，3'，5，5'-四甲基联苯胺粉末，溶于20mL无水 乙醇，即为3,3' ，5，5'-四甲基联苯胺母液
g丄3底物缓冲液与3，3'，5，5'-四甲基联苯胺母液按1:1的比例混合， 每毫升混合液再加入2mL 30%h2o2即为底物工作液，
&2将底物工作液加到酶标板各孔中，每孔加100-150pL，
g.3反应15-20 min，
g.4加终止液终止反应
g.4.1终止液为2mol/L的硫酸g. 4.2酶标板每孔各加50-75^L;
h. 酶标仪测定
h.l将终止反应的酶标板放入酶标仪， h.2在波长为450nrn处测定OD值，
h.3以样品孔OD值-阴性孔OD值顺性孔OD值22.1为阳性判断标
准
h.3.1样品孔为加经捕集并经预增菌处理的样品液，以及耐热菌多克 隆抗体、酶标抗体、底物工作液及终止液的酶标孔
h.3.2阳性样为加耐热菌抗原，以及耐热菌多克隆抗体、酶标抗体、 底物工作液及终止液的酶标孔
h.3.3阴性孔为不加耐热菌抗原，而加耐热菌多克隆抗体、酶标抗体、 底物工作液及终止液的酶标孔。
权利要求
1.耐热菌的ELISA快速检测方法，其特征是按以下操作步骤进行耐热菌的捕集；耐热菌预增菌；耐热菌包被酶标板；封闭酶标板；加耐热菌多克隆抗体；加酶标抗体；加底物工作液；酶标仪测定。
2. 根据权利要求1所述的耐热菌的ELISA快速检测方法，其特 征是按以下具体操作步骤进行2. a耐热菌的捕集2. a.l取10-20g待检苹果浓縮汁，以无菌水适度稀释， 2. a.2用溶剂过滤器过滤捕集耐热菌，滤膜孔径0.45Mm, 2. a.3耐热菌被截留于滤膜表面； 2. b耐热菌预增菌2. b.l采用402培养基预增菌14-15h，使培养液中耐热菌浓度达 到5xl()4个/mL以上，2.b.2将增菌后的培养液以10000-12000 rpm/min，离心10-15min; 2. c耐热菌包被酶标板2.c.1用0.05mol/L、pH9.6的碳酸缓冲液制成菌悬液作为包被液，,2. c2将包被液均匀加到酶标板中，每孔100-150nL，2. c.3酶标板在55-6(TC烘箱中2-3 h烘干，2. c.4用0.01mol/L, pH7.4的PBS-吐温20洗板，2. c.5每隔l分钟洗板一次，共洗板5-6次，2. c.6洗完之后，倒扣酶标板，轻轻拍掉悬浮液珠；2. d封闭酶标板2. d.l封闭液为5% - 8%的脱脂奶粉，2.(1.2将封闭液均匀的加到酶标板各孔中，每孔200-300nL， 2. d.3在37t)温箱中孵育2-3 h， 2. d,4洗板2. d.4.1用0.01mol/L、 pH7.4的PBS-吐温20洗板 2. d.4.2每隔l分钟洗板一次，共洗板5-6次 2. d.4.3洗完之后，倒扣酶标板，轻轻拍掉悬浮液珠； 2. e加耐热菌多克隆抗体2. e.l耐热菌多克隆抗体为免疫大白兔得到的多克隆抗体， 2. e,2免疫程序为2. e.2.1给大白兔耳静脉注射耐热菌，注射的耐热菌浓度为IX 108-lX109々/mL，每隔4天注射一次，共注射6次，第一次注射量 为0.5mL，以后每次注射量比上一次增加0.5mL2. e.2.2免疫注射6次后，于第22-25天取血，分离血清即为耐 热菌多克隆抗血清2. e.2.3将耐热菌多克隆抗血清经过盐析、DEAE-纤维素层析纯 化即得耐热菌多克隆抗体，2. e.3耐热菌多克隆抗体与PBS-吐温20的稀释比例为1 : 1600，(2. e.4将稀释的耐热菌多克隆抗体加到酶标板各孔中，每孔 跡150nL，2. e.5在37"C温箱中孵育l-2h， 2. e.6洗板2. e.6.1用0.01mol/L、 pH7.4的PBS-吐温20洗板 2. e.6.2每隔l分钟洗板一次，共洗板5-6次 2. e.6.3洗完之后，倒扣酶标板，轻轻拍掉悬浮液珠； 2. f加酶标抗体;2. f.l酶标抗体为酶标山羊抗兔抗体，2. f.2酶标抗体与PBS-吐温20的稀释比例为1 : 20000，2. f3将稀释的酶标抗体加到酶标板各孔中，每孔加100-150pL，2. f.4 37。C温箱中孵育1-2 h，2. f.5洗板2. ￡5.1用0.01mol/L， pH7.4的PBS-吐温20洗板;2. f.5.2每隔1分钟洗板一次，共洗板5-6次2. f.5.3洗完之后，倒扣酶标板，轻轻拍掉悬浮液珠；2. g加底物工作;2. g.l底物工作液配方如下2. g丄1取25.7mL 0.2mol/L Na2HP04和24.3mL 0. lmol/L拧檬酸 液放入100mL容量瓶，用蒸馏水定容至刻度即为底物缓冲液2. g丄2精确称取0.02g 3，3' ，5,5'-四甲基联苯胺粉末，溶于20mL 无水乙醇，即为3，3'，5，5'-四甲基联苯胺母液2.g丄3底物缓冲液与3，3' ,5,5'-四甲基联苯胺母液按1:1的比例 混合，每毫升混合液再加入2pL 30%H2O2即为底物工作液，( 2. g,2将底物工作液加到酶标板各孔中，每孔加100-150^L，2. g.3反应15-20 min，2. g，4加终止液终止反应2. g.4.1终止液为2mol/L的硫酸2. g.4.2酶标板每孔各加50-75^L;2. h酶标仪测定2. h.l将终止反应的酶标板放入酶标仪， 2. ^2在波长为45011111处测定00值，2.h.3以样品孔OD值-阴性孔OD值/阴性孔OD值^2.1为阳性 判断标准2. h.3.1样品孔为加经捕集并经预增菌处理的样品液，以及耐热 菌多克隆抗体、酶标抗体、底物工作液及终止液的酶标孔2. h.3.2阳性样为加耐热菌抗原，以及耐热菌多克隆抗体、酶标 抗体、底物工作液及终止液的酶标孔2. h.3.3阴性孔为不加耐热菌抗原，而加耐热菌多克隆抗体、酶 标抗体、底物工作液及终止液的酶标孔。
全文摘要
本发明涉及一种耐热菌的ELISA快速检测方法，目前采用的细菌平皿培养记数法，检测周期长，PCR及QC-PCR检测方法步骤较繁锁。本发明解决了目前耐热菌检测方法存在的缺陷。操作步骤为耐热菌捕集→预增菌→包被酶标板→封闭酶标板→加耐热菌多克隆抗体→加酶标抗体→加底物工作液→酶标仪测定。由于每步均有冲洗步骤，因此若样品中不含耐热菌，则耐热菌多克隆抗体、酶标抗体被洗掉；若样品中含有耐热菌，经过预增菌可达到所需检测浓度，最终使底物显色而呈阳性反应。本发明简便易行，检测限达国际标准，可满足苹果浓缩汁中耐热菌不超过1个/10mL的检测标准，操作过程可在24小时内完成，达到快速检测的效果。
文档编号G01N33/569GK101566632SQ20091002289
公开日2009年10月28日 申请日期2009年6月10日 优先权日2009年6月10日
发明者余朝舟, 李建科, 峰 王 申请人:陕西师范大学