一种快速检测纺织品中大肠菌群的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及纺织品微生物检测领域，特别是一种快速检测纺织品中大肠菌群的方 法。
【背景技术】
[0002] 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞 杆菌，大肠菌群在环境中广泛存在，该菌主要来自人畜粪便，以此作为粪便污染指标来评价 产品的卫生质量，推断产品中受肠道致病菌污染的程度，大肠菌群超标也意味着致病菌超 标的机会增大，危害人体健康的几率也增加。
[0003] 传统的纺织品中样品采集，大肠菌群的检测方法主要有：
[0004] 传统方法1 (SN/T 3335-2012《进出口纺织品微生物项目检验规范》），打开3个以 上包装，共称取20g剪碎，制成1:10样液乳糖胆盐发酵，将待检样品接种于乳糖，胆盐发酵 管内，置36°C ±1°C温箱内，培养24h±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告 为大肠菌群阴性，如有产气者，则进行分离培养，将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼 脂平板上，置36°C ±1°C温箱内，培养8h~24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏 染色和证实试验；在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1个~2个进行革兰氏染色，同 时接种乳糖发酵管，置36°C ±1°C温箱内培养24h±2h，观察产气情况，凡乳糖管产气、革 兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。
[0005] 传统方法2(GB/T18204. 4-2013《公共场所卫生检验方法第4部分：公共用品用具 微生物》）选取5cmX5cm的面积范围，用灭菌湿润棉拭子涂抹5次，制成1:10样液多管发 酵法，用lmL灭菌吸管吸取1:10稀释液lmL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的 试管内，振摇试管混匀，做成1:100的稀释液，另取lmL灭菌吸管，按上条操作依次做10 倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支lmL灭菌吸管，根据检样污染情况的估计，选 择三个稀释度，每个稀释度，接种3管，多管发酵法包括初（步）发酵试验、板分离和复 发酵试验三个部分：
[0006] 1、初（步）发酵试验发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套 管因为大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气，培养基内加有溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸 后，培养基即由原来的紫色变为黄色，水样接种于发酵管内，37°C下培养，24h内小套管中有 气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果，但也有个别其 他类型的细菌在此条件下也可能产气；此外产酸不产气的也不能完全说明是阴性结果。在 量少的情况下，也可能延迟到48h后才产气，此时应视为可疑结果，因此，以上两种结果均 需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。48h后仍不产气的为阴性结果。
[0007] 2、平板分离平板培养基一般使用复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基，Endo ' s medium)或（伊红美蓝琼脂eosin methylene blueagar，EMB agar)，前者含有碱性复红染 料，在此作为指示剂，它可被培养基中的亚硫酸钠脱色，使培养基呈淡粉红色，大肠菌群发 酵乳糖后产生的酸和乙醛即和复红反应，形成深红色复合物，使大肠菌群菌落变为带金属 光泽的深红色。亚硫酸钠还可抑制其他杂菌的生长。伊红美蓝琼脂平板含有伊红与美蓝染 料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物， 使大肠菌群产生与远藤氏培养基上相似的、带核心的、有金属光泽的深紫色（龙胆紫的紫 色）菌落。初发酵管24h内产酸产气和48h产酸产气的均需在以上平板上划线分离菌落。
[0008] 3、复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽胞杆菌者， 通过此试验再进一步证实。原理与初发酵试验相同，经24h培养产酸又产气的，最后确定为 大肠菌群阳性结果。
[0009] 传统方法对大肠菌群的测定达到只限在水，及食品检测领域，在纺织品中由于纺 织品采样及细菌的含量低等问题导致应用受到限制。
[0010] 纺织品的样品采集常用的方法：
[0011] 第一种是涂抹法，这种方法最大优点是不破坏样品，适用于样品质地比较薄而密 集，细菌含量较高的样品，但在实际运用中，由于纺织品具有多孔结构和吸水特性，而且纺 织品有一定的厚度，仅用表面涂抹取样不能完全检测到样品受污染真正情况，当遇到细菌 含量较低的样品或质地较厚实的样品时，涂抹过程中会出现样品采集不彻底，样品不完全 采集的情况，易因检出率低，引起假阴性结果，从而误导检测人员产生错误判定。
[0012] 第二种是剪碎20g称量法，这种方法破坏了样品，适用于细菌含量低的小面积纺 织品，但实际中纺织品种类千差万别，面积大小、厚度不一，如果仅称量20g作为检样，不具 代表性，如果样品吸水性强，所制样品不均质，更易造成假阴性结果。传统的检测方法，不仅 耗费时间较长而且多为定性检测，而现实中定量检测更具意义。
【发明内容】
[0013] 针对现有纺织品中样品采集，大肠菌群的检测过程中所存在的问题，本发明的目 的在于提供一种纺织品中大肠菌群检测新方法，克服现有纺织品中样品采集，大肠菌群检 测的过程中存在的不足与缺陷，
[0014] 其解决问题的技术方案是：
[0015] 一种快速检测纺织品中大肠菌群的方法，包括以下步骤：
[0016] 步骤一：检样采集
[0017] 在送检的纺织品四周和中间均匀布控5个~10个采样点，用灭菌不锈钢直尺测 量，每个采样点按5cmX 5cm(25cm2)面积范围剪裁，每25cm2采样面积为1份检样，根据纺织 品面积大小，每件纺织品共采集5份~10份检样；如果被检样品面积过大或过小，采样面积 可按比例扩大或缩小；
[0018] 步骤二：样液制备
[0019] 将采集好的5份~10份检样放入盛有200mL灭菌生理盐水的全滤网无菌均质袋 中，用拍击式均质器拍打lmin~2min，得到一个生理盐水样液，制成样液作为原液，如果被 检样品大量吸水而导致不能吸出足够样液时，灭菌生理盐水量可按每次l〇〇mL递增，直至 能抽提有足够100mL~120mL的测试样液；每个样液30min内抽提检测完毕；
[0020] 步骤三：样液稀释，过滤
[0021] 应根据样品污染情况确定样液的稀释倍数，以滤过一张无菌滤膜后能产生小于 100个菌落为宜，每张滤膜过滤lOOmL样液；如果样品污染严重，可将样液原液稀释10倍， 取lOOmL稀释液过滤；
[0022] 步骤四：菌群培养检测
[0023] 取出大肠菌群测试片，在室温下放置lOmin，揭开覆盖薄膜，吸取lmL无菌水或生 理盐水于测试片培养基上，盖上覆盖薄膜，常温放置lh，使测试片培养基完全水化，用无齿 灭菌镊子夹取孔径为0. 45 y m微孔灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤 床上，固定好滤器，将制好的样液注入滤器中，打开滤器阀门，在负0. 5 X 105Pa下抽滤，样液 滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在大肠 菌群测试片上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与测试片完全贴紧，两者间不留有气泡，然后 将测试片放入36°C ±1°C培养箱内培养24h±2h，大肠菌群在测试片上培养出的菌落具有 以下特征：红色小菌落，周围有气泡；
[0024] 步骤五：结果计算
[0025] 直接计数微生物测试片上产气泡的菌落，以每平方厘米样品中的大肠菌群个数报 告结果；
[0026] 按式⑴计算，
【主权项】
1. 一种快速检测纺织品中大肠菌群的方法，其特征在于包括w下步骤： 步骤一：检样采集 在送检的纺织品四周和中间均匀布控5个~10个采样点，用灭菌不诱钢直尺测量，根 据纺织品面积大小，每件纺织品共采集5份~10份检样；采样面积可按送检的纺织品面积 大小扩大或缩小； 步骤二：样液制备 将采集好的5份~10份检样放入盛有200mL灭菌生理盐水的全滤网无菌均质袋中，用 拍击式均质器拍打Imin~2min，得到一个生理盐水样液，制成样液作为原液，如果被检样 品大量吸水而导致不能吸出足够样液时，灭菌生理盐水量可按每次lOOmL递增，直至能抽 提有足够lOOmL~120mL的测试样液海个样品30min内抽提检测完毕； 步骤样液稀释，过滤 应根据样品污染情况确定样液的稀释倍数，W滤过一张无菌滤膜后能产生小于100 个菌落为宜，每张滤膜过滤lOOmL样品；如果样品污染严重，可将样液原液稀释10倍，取 lOOmL稀释液过滤； 步骤四；菌群培养检测 取出大肠菌群测试片，在室温下放置lOmin，揭开覆盖薄膜，吸取ImL无菌水或生理盐 水于测试片培养基上，盖上覆盖薄膜，常温放置比，使测试片培养基完全水化，用无齿灭菌 綴子夹取孔径为0. 45ym微孔灭菌滤膜边缘部分，将粗趟面向上，贴放在已灭菌的滤床上， 固定好滤器，将制好的样液注入滤器中，打开滤器阀口，在负0. 5大气压下抽滤，样液滤完 后，再抽气约5s，关上滤器阀口，取下滤器，用灭菌綴子夹取滤膜边缘部分，移放在大肠菌群 测试片上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与测试片完全贴紧，两者间不留有气泡，然后将测 试片放入36°c±rc培养箱内培养2化+化，大肠菌群在测试片上培养出的菌落具有W下 特征；红色小菌落，周围有气泡； 步骤五：结果计算 直接计数微生物测试片上产气泡的菌落，W每平方厘米样品中的大肠菌群个数报告结 果： 按式（1)计算，
步骤六：结果报告 如果样品原液测试片上无菌落长出，结果报告为0C即/cm2;如果10倍样品稀释液测试 片上无菌落长出，结果报告为<10C即/cm2;其它选择测试片上菌落数小于100C即的测试 片计数，按式（1)计算报告。
2. 根据权利要求1所述的一种快速检测纺织品中大肠菌群的方法，其特征在于步骤一 中检样采集每个采样点按5cmX5cm面积范围剪裁，每25cm2采样面积为1份检样。
3. 根据权利要求1所述的一种快速检测纺织品中大肠菌群的方法，其特征在于步骤四 中菌群分离检测采用滤膜法。
【专利摘要】本发明涉及纺织品微生物检测领域，特别是一种快速检测纺织品中大肠菌群的法包括以下步骤：步骤一：检样采集；步骤二：样液制备；步骤三：样液稀释，过滤；步骤四：菌群培养检测；步骤五：结果计算；步骤六：结果报告，本发明采用生理盐水洗脱纺织品中的微生物，采用孔径为0.45μm微孔薄膜快速抽提，此种滤膜能滤过大量液体，并将样液中所含的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜贴在相应微生物测试片上，经过培养后，大肠菌群在测试片上长出具有相应特征性的菌落，直接计数菌落数，计算出每平方厘米中样品所含大肠菌群数，本发明检测法考虑了各种样品面积的大小、及厚度，采集的样品更具代表性，使检测结果更准确，对样品的真实情况反映更确切。
【IPC分类】C12Q1-10, C12R1-19
【公开号】CN104789637
【申请号】CN201510150109
【发明人】郭会清, 李轲, 苗丽, 杨娜, 乔晴, 禹建鹰, 王永杰, 白杰, 王新辉, 王珊
【申请人】郭会清
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年4月1日