专利名称：调味品中大肠菌群的快速检测方法
技术领域：
本发明涉及菌群的检测，特别涉及一种调味品中大肠菌群的快速检测方法。
背景技术：
在食品行业，大肠菌群的含量是一项重要的卫生指标。目前传统国家标准方法 (GB)采用9管发酵，48-72小时才可以出结果，存在滞后现象、检测效率低。改进后的方法 如荧光方法(SN)、显色培养基方法，膜过滤方法，这几种方法24-48小时可以出结果，仍不 能达到快速检测的目的。另外，免疫学方法，虽然8小时可以出结果，但检出限有限，同时检 测成本高，一旦菌体发生变异，检测结果就不准确；分子生物学方法，虽然12小时可以出结 果，明显提高了检测灵敏度，但是该方法检测成本较贵、操作繁杂、对操作员的技术要求高， 不利于推广。因此，开发适宜生产需要、操作简单的快速大肠菌群检测方法十分必要。在所有方 法中利用半乳糖苷酶作为标记物检测大肠菌具有较好的应用潜力。可以保证建立的快 速检测方法具有操作简单、低成本等优点，同时该方法也存在很大的挑战，如何达到国家标 准方法的检出限，如何降低检出所消耗的时间，提高检出速率等。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种调味品中大肠菌群的快速检测方法，利用β “半乳 糖苷酶作为标记物检测调味品中的大肠菌群，能以较高的检出速率达到国家标准方法的检 出限。为解决以上技术问题，本发明的技术方案是，一种调味品中大肠菌群的快速检测 方法，包括如下步骤1)将样品利用无菌生理盐水稀释5 40倍，加入助滤剂，用真空过滤法滤过一 级滤膜，取滤后液过二级滤膜，再利用20 50ml无菌生理盐水洗涤，菌体截留在二级滤膜 上；2)将菌体置入增菌增酶培养液中，对菌体进行修复、增菌增酶培养；3)在培养后的菌体悬液中加入包含发光试剂底物、大肠菌群温和裂解液、发光增 强剂的发光检测试剂进行发光值检测，根据发光值判断大肠菌群数量；所述增菌增酶培养液包括以体积比100 1混合的组分A、组分B，组分A为每 IOOOml蒸馏水中含有胰蛋白胨0. 5 2g，氯化钠2 5g，磷酸二氢钾6 8g，氢氧化钠1 2g，组分B为每IOOmL蒸馏水中含有β -半乳糖苷酶诱导物0. 05-0. 2g，亚致死细菌快速 修复物3-6g，细菌快速增长剂2-5g。其中，步骤1)中，所述一级滤膜为30μπι聚丙烯滤膜，所述二级滤膜为 0.2-0. 45 μ m混合醋酸纤维素滤膜。其中，大肠菌群的培养条件为将分离的菌体悬浮于增菌增酶培养液中于39°C 42°C的恒温培养箱中培养6 7小时。
其中，组分A在121°C灭菌15分钟后再与组分B混合。其中，步骤3)中的发光值检测为将50μ 1 100μ 1的增菌增酶培养后的菌体悬液与50 100 μ 1发光检测试剂反应10 50分钟，利用发光光度计于530nm 590nm处 检测发光值，将检样发光值与阴性对照样发光值比对。其中，所述半乳糖苷酶诱导物为乳糖、异丙基硫代半乳糖苷或者半乳糖中的 任一种。其中，所述亚致死细菌快速修复物为甘油、葡萄糖、丙酮酸钠、抗坏血酸、维生素E 中的任一种或多种。其中，所述细菌快速增长剂为三磷酸腺苷、肌酐，肌苷或者牛血清提取物中的任一 种或多种。其中，组分A中，每IOOOml蒸馏水还包括自由基清除剂Ig 3g、十二烷基磺酸钠 0. 03g 0. 06g。其中，所述自由基清除剂为活性炭、可溶性淀粉、半胱氨酸、二苯胺、巯基乙醇或 α-生育酚中的任一种。其中，所述大肠菌温和裂解液为细胞膜破坏试剂，所述细胞膜破坏剂为EDTA、 Nisin、Tween-80、硫酸粘菌素B、曲拉通、CATB中的任一种。其中，所述发光试剂底物为AMP⑶、铕试剂、荧光素-β -半乳糖苷中的任一种。其中，所述发光增强剂为季铵盐高聚物。其中，所述助滤剂为吐温-60或吐温-80。本发明的检测方法具有如下优点本发明针对蚝油、黄豆酱等调味品成分复杂特点，利用菌体分离富集技术收集菌 体，去除干扰菌体生理状态、影响半乳糖苷酶与检测用酶底物反应的物质；通过高效增 菌增酶培养液对菌体悬液进行培育，使快速增菌的同时增加β “半乳糖苷酶的量；检测时， 所用发光检测试剂，通过添加大肠菌温和裂解液使半乳糖苷酶(胞内酶)释放到培养 液中，提高酶的得率和活力；通过选用好的检测用发光试剂底物及添加发光增强剂，提高检 出速率和提高灵敏度。本发明检测方法速度快，8小时内即可准确检出大肠菌群存在与否， 远快于国家标准方法(48-72小时)，而且检测成本低廉，检测成本为3元/样品。
图1是本发明调味品中大肠菌群的快速检测方法的流程图。
具体实施例方式本发明的基本构思是，利用半乳糖苷酶作为标记物对调味品中的大肠菌群进 行检测，针对蚝油、黄豆酱等调味品成分复杂特点，先利用菌体分离富集技术收集菌体，去 除干扰菌体生理状态、影响半乳糖苷酶与检测用酶底物反应的物质；以高效增菌增酶 培养液对分离后的菌体进行培育，使菌体在快速增菌的同时增加半乳糖苷酶的量；而 后在培育后的菌悬液中加入发光检测试剂，该发光检测试剂通过添加大肠菌温和裂解液使
半乳糖苷酶(胞内酶)释放到培养液中，提高酶的得率和活力，选用好的检测用发光试 剂底物及添加发光增强剂，提高检出速率和提高灵敏度。
参见图1，图1是本发明调味品中大肠菌群的快速检测方法的流程图。本发明的调味品中大肠菌群的快速检测方法包括如下步骤Si、对样品进行菌体分离富集； 此步骤中，利用菌体分离富集技术对样品进行菌体分离富集，使菌体从样品中分 离出来，去除干扰菌体生理状态、影响β “半乳糖苷酶与检测用酶底物反应的物质，具体步 骤为称取一定量蚝油或黄豆酱利用无菌生理盐水稀释5-40倍，利用真空过滤方法滤过一 级滤膜，取滤后液过二级滤膜，再利用20-50ml无菌生理盐水洗涤2-3次，菌体截留在滤膜 上，用于下一步培养。通过第一步抽滤去除大颗粒渣粒，第二步抽滤去除小分子干扰物质， 达到菌体分离富集，并去除干扰菌体生理状态、影响β “半乳糖苷酶活性及检测反应体系 的物质。S2、对分离后的菌体以增菌增酶培养液进行修复、增菌增酶培养；在此步骤中，以增菌增酶培养液对分离富集得到的菌体进行培育，使菌体在快速 增菌的同时增加半乳糖苷酶的量，具体步骤为将截留细菌的膜用无菌镊子夹取，放入 装有增菌增酶培养液的试管中，在39-42°C的恒温培养箱中培养6-7小时。其中，增菌增酶 培养液组成与制备过程如下培养液组分A 胰蛋白胨0. 5 2g，氯化钠2 5g，自由基清除剂1 3g，十二烷 基磺酸钠0. 03~ 0. 06g,磷酸二氢钾6 8g，氢氧化钠1 2g，溶解于IOOOml蒸馏水，取IOml 分装到试管中，121°C灭菌15分钟，室温保存供使用。培养液组分B β -半乳糖苷酶诱导物0. 05 0. 2g，亚致死细菌快速修复物3_6g， 细菌快速增长剂2 5g，溶于IOOmL蒸馏水，过滤除菌，取100 μ 1到IOml组分A培养液中。S3、对培育后的菌体加入发光检测试剂进行发光值检测；在此步骤中，对培育后的菌体进行发光值检测。具体步骤为取孵育完毕的菌悬 液，置于发光检测仪的检测孔中，加入包含发光试剂底物、发光增强剂和大肠菌温和裂解液 的发光检测试剂反应一段时间，而后在振荡器上摇勻振荡，进行发光检测，测定样品的发光值。在一定范围内，半乳糖苷酶的量与发光强度呈正相关，因此，通过发光值可以 间接测定大肠菌群的数量。利用已知大肠菌群阴性样的发光值，计算6h检样发光值与阴性 对照样发光值的比值Tl，当比值Tl少于或等于1.2(阀值A)时，判断为大肠菌群阴性，当比 值Tl大于1. 2时，需进行培养7小时检测，计算7h检样发光值与阴性对照样发光值的比值 T2，若T2与Tl的比值K少于或等于1. 1 (阀值B)，则判断为大肠菌群阴性，若T2与Tl的比 值K大于1. 1，则判断为大肠菌群阳性，并与国标法进行比对。其中阀值A、B的理论值应 为1，但检测过程中发光值会有轻微的波动，故将阀值设为略高于1。其中阀值A为1. 2、阀 值B为1. 1，这是由大量检测数据经统计学分析得出。下面，以具体实施例对本发明的调味品中大肠菌群的快速检测方法进行说明。实施例一1、菌体分离富集用电子天平移取IOg黄豆酱样品(样品代号为1)到含有灭菌玻璃珠的90ml无菌 生理盐水中，振荡摇勻，加入助滤剂吐温-60，取该样品稀释液IOml过一级滤膜30 μ m聚丙 烯滤膜，去除大颗粒酱渣，滤后液过二级滤膜0. 45 μ m混合醋酸纤维素滤膜，用无菌生理盐水对截留在膜上的菌体反复冲洗三次，去除干扰菌体生理状态、影响β -半乳糖苷酶活性 及检测反应体系的物质。2、增菌增酶培养将截留细菌的膜用无菌镊子夹取，放入装有IOml增菌增酶培养液的试管中，在 39°C的恒温培养箱中培养6 7小时。其中，增菌增酶培养液组成与制备过程如下培养液组分A 胰蛋白胨0. 5g，氯化钠2g，活性炭lg，十二烷基磺酸钠0. 03g,磷酸 二氢钾6g，氢氧化钠lg，溶解于IOOOml蒸馏水，取IOml分装到试管中，在121°C下灭菌15 分钟，室温保存供使用。培养液组分B 乳糖0. 05g,甘油3g，三磷酸腺苷2g，溶于IOOmL蒸馏水，过滤除菌， 取100 μ 1到IOml培养液组分A中。3、检测过程取孵育完毕的菌悬液100 μ 1，置于发光检测仪96孔板中相应检测孔中，加入 50 μ IAMP⑶、季铵盐高聚物和EDTA混合试剂反应10分钟，在振荡器上摇勻振荡1分钟后， 进行发光检测，发光检测的波长为560nm，检测积分时间为0. 5秒，测定样品的发光值，6h检 样发光值为2508。对于蚝油、黄豆酱等调味品，国家标准规定大肠菌群< 30MPN/100g，因此根据检样 发光值与阴性对照样发光值的比值，设置一个阈值即可判定大肠菌群存在与不存在。已知 大肠菌群阴性样的发光值为2745，计算得出6h检样发光值与阴性对照样发光值的比值Tl 为0.91，T1少于1.2(阀值Α)，因此，可判断为大肠菌群阴性，与国标法进行比对，检测结果 正确。检测结果参见表1。实施例二1、菌体分离富集用电子天平移取IOg蚝油样品(样品代号为2)到含有灭菌玻璃珠的90ml无菌生 理盐水中，振荡摇勻，加入助滤剂吐温-80，取该样品稀释液IOml过一级滤膜30 μ m聚丙烯 滤膜，滤后液过二级滤膜0. 25 μ m混合醋酸纤维素滤膜，用无菌生理盐水对截留在膜上的 菌体反复冲洗二次。2、增菌增酶培养将截留细菌的膜用无菌镊子夹取，放入装有IOml增菌增酶培养液的试管中，在 40°C的恒温培养箱中培养6 7小时。其中，增菌增酶培养液组成与制备过程如下培养液组分A 胰蛋白胨lg，氯化钠3g，半胱氨酸2g，十二烷基磺酸钠0. 04g,磷酸 二氢钾7g，氢氧化钠2g，溶解于IOOOml蒸馏水，取IOml分装到试管中，在121°C下灭菌15 分钟，室温保存供使用。培养液组分B 半乳糖0. lg，丙酮酸钠4g，肌酐3g，溶于IOOmL蒸馏水，过滤除菌，取100 μ 1到IOml培养液组分A中。3、检测过程取孵育完毕的菌悬液50 μ 1，置于发光检测仪96孔板中相应检测孔中，加入50 μ 1 发光试剂底物、发光增强剂和大肠菌温和裂解液混合试剂反应30分钟，在振荡器上摇勻振 荡1分钟后，进行发光检测，发光检测的波长为550nm，检测积分时间为0. 5秒，测定样品的 发光值，6h检样发光值为3330。
对于蚝油、黄豆酱等调味品，国家标准规定大肠菌群< 30MPN/100g，因此根据检样 发光值与阴性对照样发光值的比值，设置一个阈值即可判定大肠菌群存在与不存在。已知 大肠菌群阴性样的发光值为2745，计算得出6h检样发光值与阴性对照样发光值的比值Tl 为1. 21，Tl大于1. 2 (阀值A)，需进行培养7小时检测，7h检样发光值为3480，计算得出7h 检样发光值与阴性对照样发光值的比值T2为1. 20，T2与Tl的比值K为0. 99，少于1. 1 (阀 值B)因此，可判断为大肠菌群阴性，与国标法进行比对，检测结果正确。检测结果参见表1。实施例三1、菌体分离富集用电子天平移取IOg蚝油样品(样品代号为3)到含有灭菌玻璃珠的90ml无菌生理盐水中，振荡摇勻，加入助滤剂吐温-60，取该样品稀释液IOml过一级滤膜30 μ m聚丙烯 滤膜，滤后液过二级滤膜0. 3 μ m混合醋酸纤维素滤膜，用无菌生理盐水对截留在膜上的菌 体反复冲洗二次。2、增菌增酶培养将截留细菌的膜用无菌镊子夹取，放入装有IOml增菌增酶培养液的试管中，在 41°C的恒温培养箱中培养6 7小时。其中，增菌增酶培养液组成与制备过程如下培养液组分A 胰蛋白胨lg，氯化钠3g，可溶性淀粉2g，十二烷基磺酸钠0. 04g,磷 酸二氢钾8g，氢氧化钠lg，溶解于IOOOml蒸馏水，取IOml分装到试管中，121°C灭菌15分 钟，室温保存供使用；培养液组分B 半乳糖0. lg，丙酮酸钠4g，肌酐3g，溶于IOOmL蒸馏水，过滤除菌， 取100 μ 1到IOml组分A培养液中。3、检测过程取孵育完毕的菌悬液80 μ 1，置于发光检测仪96孔板中相应检测孔中，加入包含 80 μ 1铕试剂、季铵盐高聚物和Tween-80的发光检测试剂反应40分钟，在振荡器上摇勻振 荡1分钟后，进行发光检测，发光检测的波长为570nm，检测积分时间为0. 5秒，测定样品的 发光值，6h检样发光值为6884。对于蚝油、黄豆酱等调味品，国家标准规定大肠菌群< 30MPN/100g，因此根据检样 发光值与阴性对照样发光值的比值，设置一个阈值即可判定大肠菌群存在与不存在。已知 大肠菌群阴性样的发光值为2745，计算得出6h检样发光值与阴性对照样发光值的比值Tl 为2. 51，Tl大于1. 2 (阀值A)，需进行培养7小时检测，7h检样发光值为11454，计算得出7h 检样发光值与阴性对照样发光值的比值T2为3. 94，T2与Tl的比值K为1. 57，大于1. 1 (阀 值B)，因此，可判断为大肠菌群阳性，与国标法进行比对，检测结果正确。检测结果参见表
Io实施例四1、菌体分离富集用电子天平移取IOg蚝油样品(样品代号为4)到含有灭菌玻璃珠的90ml无菌生 理盐水中，振荡摇勻，加入助滤剂吐温-80，取该样品稀释液IOml过一级滤膜30 μ m聚丙烯 滤膜，滤后液过二级滤膜0. 35 μ m混合醋酸纤维素滤膜，用无菌生理盐水对截留在膜上的 菌体反复冲洗二次。2、增菌增酶培养
将截留细菌的膜用无菌镊子夹取，放入装有IOml增菌增酶培养液的试管中，在 42°C的恒温培养箱中培养6 7小时。其中，增菌增酶培养液组成与制备过程如下培养液组分A 胰蛋白胨2g，氯化钠3g，半胱氨酸、二苯胺、巯基乙醇3g，十二烷基 磺酸钠0. 05g，磷酸二氢钾8g，氢氧化钠2g，溶解于IOOOml蒸馏水，取IOml分装到试管中， 121°C灭菌15分钟，室温保存供使用；培养液组分B 乳糖0. 15g，丙酮酸钠5g，肌苷3g，溶于IOOmL蒸馏水，过滤除菌，取100 μ 1到IOml组分A培养液中。3、检测过程取孵育完毕的菌悬液70 μ 1，置于发光检测仪96孔板中相应检测孔中，加入 100 μ 1包含荧光素_ β _半乳糖苷、季铵盐高聚物和硫酸粘菌素B的发光检测试剂反应50 分钟，在振荡器上摇勻振荡1分钟后，发光检测的波长为580nm，检测积分时间为0. 5秒，测 定样品的发光值，6h检样发光值为4255。对于蚝油、黄豆酱等调味品，国家标准规定大肠菌群< 30MPN/100g，因此根据检样 发光值与阴性对照样发光值的比值，设置一个阈值即可判定大肠菌群存在与不存在。已知 大肠菌群阴性样的发光值为2745，计算得出6h检样发光值与阴性对照样发光值的比值Tl 为1. 55，Tl大于1. 2 (阀值A)，需进行培养7小时检测，7h检样发光值为5243，计算得出7h 检样发光值与阴性对照样发光值的比值T2为1.80，T2与Tl的比值K为1. 16，大于1. 1 (阀 值B)，因此，可判断为大肠菌群阳性，与国标法进行比对，检测结果正确。检测结果参见表
Io实施例五1、菌体分离富集用电子天平移取IOg蚝油样品(样品代号为5)到含有灭菌玻璃珠的90ml无菌生 理盐水中，振荡摇勻，加入助滤剂吐温-80，取该样品稀释液IOml过一级滤膜30μπι聚丙烯 滤膜，滤后液过二级滤膜0. 3 μ m混合醋酸纤维素滤膜，用无菌生理盐水对截留在膜上的菌 体反复冲洗三次。2、增菌增酶培养将截留细菌的膜用无菌镊子夹取，放入装有IOml增菌增酶培养液的试管中，在 42°C的恒温培养箱中培养6 7小时。其中，增菌增酶培养液组成与制备过程如下培养液组分A 胰蛋白胨0. 9g，氯化钠5g，巯基乙醇3g，十二烷基磺酸钠0. 06g,磷 酸二氢钾6g，氢氧化钠lg，溶解于IOOOml蒸馏水，取IOml分装到试管中，121°C灭菌15分 钟，室温保存供使用；培养液组分B 乳糖0. 2g，抗坏血酸4g，牛血清提取物4g，溶于IOOmL蒸馏水，过滤 除菌，取100 μ 1到IOml组分A培养液中。3、检测过程取孵育完毕的菌悬液80 μ 1，置于发光检测仪96孔板中相应检测孔中，加入 100 μ 1包含铕试剂、季铵盐高聚物和曲拉通的发光检测试剂反应35分钟，在振荡器上摇勻 振荡1分钟后，发光检测的波长为590nm，检测积分时间为0. 5秒，测定样品的发光值，6h检 样发光值为2526。对于蚝油、黄豆酱等调味品，国家标准规定大肠菌群< 30MPN/100g，因此根据检样发光值与阴性对照样发光值的比值，设置一个阈值即可判定大肠菌群存在与不存在。已知大肠菌群阴性样的发光值为2745，计算得出6h检样发光值与阴性对照样发光值的比值Tl 为0. 92，T1小于1.2(阀值Α)，因此，可判断为大肠菌群阴性，与国标法进行比对，检测结果 正确。检测结果参见表1。实施例六1、菌体分离富集用电子天平移取IOg蚝油样品(样品代号为2)到含有灭菌玻璃珠的90ml无菌生 理盐水中，振荡摇勻，加入助滤剂吐温-60，取该样品稀释液IOml过一级滤膜30 μ m聚丙烯 滤膜，滤后液过二级滤膜0. 45 μ m混合醋酸纤维素滤膜，用无菌生理盐水对截留在膜上的 菌体反复冲洗二次。2、增菌增酶培养将截留细菌的膜用无菌镊子夹取，放入装有IOml增菌增酶培养液的试管中，在 41°C的恒温培养箱中培养6 7小时。其中，增菌增酶培养液组成与制备过程如下培养液组分A 胰蛋白胨0. 5g，氯化钠3g，α -生育酚2g，十二烷基磺酸钠0. 06g, 磷酸二氢钾6g，氢氧化钠1. 5g，溶解于IOOOml蒸馏水，取IOml分装到试管中，121°C灭菌15 分钟，室温保存供使用；培养液组分B 异丙基硫代半乳糖苷0. 2g，丙酮酸钠6g，三磷酸腺苷、5g，溶于 IOOmL蒸馏水，过滤除菌，取100 μ 1到IOml组分A培养液中。3、检测过程取孵育完毕的菌悬液90μ 1，置于发光检测仪96孔板中相应检测孔中，加入 100 μ 1包含荧光素- β -半乳糖苷、季铵盐高聚物和CATB的发光检测试剂反应25分钟，在 振荡器上摇勻振荡1分钟后，发光检测的波长为590nm，检测积分时间为0. 5秒，测定样品的 发光值，6h检样发光值为15201。对于蚝油、黄豆酱等调味品，国家标准规定大肠菌群< 30MPN/100g，因此根据检样 发光值与阴性对照样发光值的比值，设置一个阈值即可判定大肠菌群存在与不存在。已知 大肠菌群阴性样的发光值为2745，计算得出6h检样发光值与阴性对照样发光值的比值Tl 为5. 54，Tl大于1. 2 (阀值A)，需进行培养7小时检测，7h检样发光值为28201，计算得出7h 检样发光值与阴性对照样发光值的比值T2为9. 70，T2与Tl的比值K为1.75，大于1. 1(阀 值B)，因此，可判断为大肠菌群阳性，与国标法进行比对，检测结果正确。检测结果参见表1.表1实施例一 实施例六的大肠菌群检测结果与国标法检测结果对照表 注表1中，结果1代表本发明方法实施例一到实施例六的检测结果；结果2代表 采用国家标准检测法对实施例一到六的样品进行检测的结果。从以上实施例可以得出，本发明的检测方法，检测结果准确，检测速度快。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对 本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改 进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
一种调味品中大肠菌群的快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤1)将样品利用无菌生理盐水稀释5～40倍，加入助滤剂，用真空过滤法滤过一级滤膜，取滤后液过二级滤膜，再利用20～50ml无菌生理盐水洗涤，菌体截留在二级滤膜上；2)将菌体置入增菌增酶培养液中，对菌体进行修复、增菌增酶培养；3)在培养后的菌体悬液中加入包含发光试剂底物、大肠菌群温和裂解液、发光增强剂的发光检测试剂进行发光值检测，根据发光值判断大肠菌群数量；所述增菌增酶培养液包括以体积比100∶1混合的组分A、组分B，组分A为每1000ml蒸馏水中含有胰蛋白胨0.5～2g，氯化钠2～5g，磷酸二氢钾6～8g，氢氧化钠1～2g，组分B为每100mL蒸馏水中含有β-半乳糖苷酶诱导物0.05-0.2g，亚致死细菌快速修复物3-6g，细菌快速增长剂2-5g。
2.如权利要求1的调味品中大肠菌群的快速检测方法，其特征在于，步骤1)中，所述一 级滤膜为30 y m聚丙烯滤膜，所述二级滤膜为0. 2-0. 45um混合醋酸纤维素滤膜。
3.如权利要求1的调味品中大肠菌群的快速检测方法，其特征在于，步骤2)中，大肠菌 群的培养条件为将分离的菌体悬浮于增菌增酶培养液中于39°C 42°C的恒温培养箱中 培养6 7小时。
4.如权利要求1的调味品中大肠菌群的快速检测方法，其特征在于，组分A在121°C灭 菌15分钟后再与组分B混合。
5.如权利要求1的调味品中大肠菌群的快速检测方法，其特征在于，步骤3)中的发光 值检测为将50ul~100ul的增菌增酶培养后的菌体悬液与50 100 yl发光检测试剂 反应10 50分钟，利用发光光度计于530nm 590nm处检测发光值，将检样发光值与阴性 对照样发光值比对。
6.如权利要求1的调味品中大肠菌群的快速检测方法，其特征在于，所述半乳糖苷 酶诱导物为乳糖、异丙基硫代半乳糖苷或者半乳糖中的任一种。
7.如权利要求1的调味品中大肠菌群的快速检测方法，其特征在于，所述亚致死细菌 快速修复物为甘油、葡萄糖、丙酮酸钠、抗坏血酸、维生素E中的任一种或多种。
8.如权利要求1的调味品中大肠菌群的快速检测方法，其特征在于，所述细菌快速增 长剂为三磷酸腺苷、肌酐，肌苷或者牛血清提取物中的任一种或多种。
9.如权利要求1的调味品中大肠菌群的快速检测方法，其特征在于，组分A中，每 1000ml蒸馏水还包括自由基清除剂lg 3g、十二烷基磺酸钠0. 03g 0. 06g。
10.如权利要求9的调味品中大肠菌群的快速检测方法，其特征在于，所述自由基清除 剂为活性炭、可溶性淀粉、半胱氨酸、二苯胺、巯基乙醇或a “生育酚中的任一种。
11.如权利要求1的调味品中大肠菌群的快速检测方法，其特征在于，所述大肠菌温和 裂解液为细胞膜破坏试剂，所述细胞膜破坏剂为EDTA、Nisin, Tween-80、硫酸粘菌素B、曲 拉通、CATB中的任一种。
12.如权利要求1的调味品中大肠菌群的快速检测方法，其特征在于，所述发光试剂底 物为AMPGD、铕试剂、荧光素-半乳糖苷中的任一种。
13.如权利要求1的调味品中大肠菌群的快速检测方法，其特征在于，所述发光增强剂 为季铵盐高聚物。
14.如权利要求1的调味品中大肠菌群的快速检测方法，其特征在于，所述助滤剂为吐温-60或吐温-80。
全文摘要
本发明公开一种调味品中大肠菌群的快速检测方法，包括如下步骤1)将样品利用无菌生理盐水稀释5～40倍，加入助滤剂，用真空过滤法滤过一级滤膜，取滤后液过二级滤膜，再利用20～50ml无菌生理盐水洗涤，菌体截留在二级滤膜上；2)将菌体置入增菌增酶培养液中，对菌体进行修复、增菌增酶培养；3)在培养后的菌体悬液中加入包含发光试剂底物、大肠菌群温和裂解液、发光增强剂的发光检测试剂进行发光值检测，根据发光值判断大肠菌群数量。本发明的方法具有检测结果准确、检测速度快的优点。
文档编号C12Q1/10GK101838676SQ20101017324
公开日2010年9月22日 申请日期2010年5月11日 优先权日2010年5月11日
发明者严守雷, 吴俊 , 潘思轶, 缪素娜, 邓少雅, 黄文彪 申请人:佛山市海天调味食品有限公司;佛山市海天(高明)调味食品有限公司