专利名称：用于检测小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒的试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种快速鉴别小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒的检测 试剂盒，并涉及一种使用该种试剂盒快速鉴别小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒的方法。
背景技术：
小鹅瘟(Gosling Plague,GP)又称鹅细小病毒病，最早由我国学者方定一 1956年 在扬州发现，并于1961年用鹅胚分离该病病毒(Goose Parvovirus，GPV)。该病主要发生 于1月龄内雏鹅和雏番鸭，是一种传播快、死亡率高的高度接触性传染病。10日龄雏鹅发病 率和死亡率可达100%，在易感群中的致死率高达70%。本病在世界各地均有不同程度的 流行，广泛发生于中国、欧洲各国、以色列、日本等国，是目前危害养鹅业的主要疾病之一。番鸭细小病毒(MuscovyDuck Parvovirus,MDPV)病，我国 1985年报道，法国 1989 年报道。主要侵害3周龄以内的雏番鸭(三周病)，发病率和死亡率高，是以肠炎、腹泻、软 脚和喘气为临诊特征的急性和亚急性传染病。两种病的病原鹅细小病毒和番鸭细小病毒都属于细小病毒科、细小病毒属。在 电镜下病毒呈晶格排列，有实心和空心两种粒子，无囊膜，直径20 24nm ；核酸单链DNA， 5. Ikbp 大小。由于两种病毒均能感染雏番鸭，且症状和病理变化相似，都能造成死亡。因而，如 何对两种病原进行快速鉴别对诊断疾病是一个重要方面。
发明内容
本发明的目的就在于研制一种鉴别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的检测试剂盒及 其检测方法。本发明的技术方案是一种用于检测小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒的试剂盒，包括 以下成分10XPCR buffer、Mg2+(lOmmo 1/L)、dNTP(lOmmol/L)、Taq DNA 聚合酶(5U/μ L) ,2 对特异性引物。其中第一对引物仅仅是小鹅瘟病毒基因组特异的，而番鸭细小病毒基因组是非互补 的Fl :5，-gcagg aacaa ttacc ag_3，Rl :5，-acc acctc ccgca ctgac-3，第二对引物是两种水禽细小病毒基因组都共有的片段F2 :5， -cggaa ggcac catgc cgccg-3，R2 :5， -cagaa tttac agatt ttgag-3，本发明的另一技术方案是使用上述试剂盒检测小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒的方法，其步骤包括
(1)从待测样本中提取病毒基因组采用DNA提取试剂盒进行；(2)用两对引物同时进行PCR，体系如下IOXpCR buffer5μ LMg2+10mmol/L3μ LdNTP 10mmol/L1 μ LTaq DNA 聚合酶 5U/ μ L1 μ L引物 Fl1 μ L引物 Rl1 μ L引物 F21 μ L引物 R21 μ L扩增条件为95°C变性5分钟，94°C 1分钟，50°C 1分钟，72°C 1分钟，30个循环， 72°C延伸10分钟。(3)电泳鉴定取10微升PCR产物用1 %琼脂糖凝胶进行电泳，如果电泳结果同时 出现大小约为774bp和1145bp大小的两条带，则判定为小鹅瘟病毒感染；如果电泳结果只 出现大小约为1145bp大小的条带，则判定为番鸭细小病毒感染；如果电泳结果未扩增出条 带，则判定没有这两种病毒感染。本发明与现有技术相比，其优点和积极效果表现在本发明建立了快速鉴别小鹅 瘟病毒和番鸭细小病毒的检测试剂盒及其检测方法，本试剂盒根据水禽细小病毒基因序列 特点的设计了两对引物，一对只能扩增鹅细小病毒特有的基因片段，另一对能扩增两种病 毒共同的基因片段。本发明建立的鉴别诊断技术，特异性强，有很高的灵敏度，可用于小鹅 瘟病毒和番鸭细小病毒的鉴别诊断。本发明解决了现有技术中无法快速鉴别小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒缺陷，提供的 鉴别诊断试剂盒及其检测方法，快速、准确性高、灵敏性好，可应用于兽医临床领域。
图1是二重PCR鉴定GPV和MDPV电泳图，其中M为DL2000标准分子量Marker， 第1泳道为阳性GPV对照，第2泳道为阳性MDPV对照，第3泳道为阴性对照，第4、5泳道为 GPV感染病料，第6泳道为MDPV感染病料。
具体实施例方式下列实例进一步说明本发明，但不应该当作对本发明的限制。实施例1 按下列配方制作快速鉴别小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒的检测试剂盒10XPCR buffer、Mg2+(lOmmo 1/L)、dNTP (IOmmo 1/L)、Taq DNA 聚合酶(5U/μ L) ,2 对特异性引物(引物由Irwitrogen公司合成)。其中第一对引物仅仅是小鹅瘟病毒基因组特异的，而番鸭细小病毒基因组是非互补 的Fl :5，-gcagg aacaa ttacc ag_3，(SEQ ID NO. 1)Rl :5，-acc acctc ccgca ctgac-3，(SEQ ID NO. 2)第二对引物是两种水禽细小病毒基因组都共有的片段
F2 :5，-cggaa ggcac catgc cgccg-3，(SEQ ID NO. 3)R2 :5，-cagaa tttac agatt ttgag-3，(SEQ ID NO. 4)实施例2 利用快速鉴别小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒的检测试剂盒检测番鸭群中 细小病毒感染情况(1)从病料(2份小鹅瘟病毒感染病料、1份番鸭细小病毒感染病料)及未感染组 织(阴性对照)中提取病毒基因组采用Quiagen公司DNA提取试剂盒进行；(2)用两对引物同时进行PCR，同时设置取GPV和MDPV核酸做阳性模板对照，体系
如下10XPCR buffer5μ LMg2+10mmol/L3μ LdNTP 10mmol/L1 μ LTaq DNA 聚合酶 5U/ μ L1 μ L引物 Fl1 μ L引物 Rl1 μ L引物 F21 μ L引物 R21 μ L扩增条件为95°C变性5分钟，94°C 1分钟，50°C 1分钟，72°C 1分钟，30个循环， 72°C延伸10分钟。(3)电泳鉴定如图1所示，小鹅瘟病毒感染病料(第4、5泳道)同时出现大小约 为774bp和1145bp大小的两条带；番鸭细小病毒感染病料(第6泳道)只出现大小约为 1145bp大小的条带；而阴性对照(阴性对照)未未扩增出条带。
权利要求
一种用于检测小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒的试剂盒，包括以下成分10×PCR buffer、Mg2+10mmol/L、dNTP 10mmol/L、Taq DNA聚合酶5U/μL、2对特异性引物，其中第一对引物是F15’ gcagg aacaa ttacc ag 3’R15’ acc acctc ccgca ctgac 3’第二对引物是F25’ cggaa ggcac catgc cgccg 3’R25’ cagaa tttac agatt ttgag 3’。
2.—种权利要求1所述检测试剂盒的使用方法，其步骤包括(1)从待测样本中提取病毒基因组采用DNA提取试剂盒进行；(2)用两对引物同时进行PCR，体系如下10XPCR buffer5μ LMg2+10mmol/L3μ LdNTP 10mmol/L1 μ L Taq DNA 聚合酶 5U/μ L 1 μ L引物FlIuL引物RlIuL引物F2IuL引物R2IuL扩增条件为95°C变性5分钟，94°C 1分钟，50°C 1分钟，72°C 1分钟，30个循环，72°C 延伸10分钟。(3)电泳鉴定取10微升PCR产物用琼脂糖凝胶进行电泳，如果电泳结果同时出现 大小约为774bp和1145bp大小的两条带，则判定为小鹅瘟病毒感染；如果电泳结果只出现 大小约为1145bp大小的条带，则判定为番鸭细小病毒感染；如果电泳结果未扩增出条带， 则判定没有这两种病毒感染。
全文摘要
本发明涉及一种用二重PCR技术对感染番鸭群中小鹅瘟病毒(Goose Parvovirus，GPV)和番鸭细小病毒(Muscovy Duck Parvovirus，MDPV)进行快速鉴别诊断的试剂盒及检测方法。本发明含有Taq DNA聚合酶(5U/μL)、10×PCR buffer、Mg2+(10mmol/L)、dNTP(10mmol/L)、2对特异性引物。通过对组织样品中DNA提取、PCR，从而鉴别出感染番鸭群的病毒类型。解决了现有技术无法快速鉴别两种病毒的缺陷。本发明具有特异性强、灵敏度高、快速等特点，适于临床快速鉴别诊断。
文档编号C12Q1/68GK101899534SQ20101017308
公开日2010年12月1日 申请日期2010年5月14日 优先权日2010年5月14日
发明者刘学贤, 刘岳龙, 李清, 王希, 秦爱建, 邵红霞, 金文杰, 钟蕾, 钱琨, 鲍衍清, 鹿钟文 申请人:扬州大学