专利名称：一种抗草甘膦5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学和植物遗传工程学领域，具体的说。本发明涉及一种抗草 甘膦基因以及该基因编码的蛋白质。可以通过遗传转化的方法使该基因在植物体内表达从 而提高植物对草甘膦的耐受能力，方便农田中的杂草清除。本发明可以运用在作物的育种、 植物细胞培养的筛选。
背景技术：
草甘膦是使用最为广泛的广谱除草剂，具有对人畜无毒，自然条件下杂草和农作 物难以对它产生抗性，低土壤残留量等特点，市场潜力巨大。然而由于草甘膦无选择性的杀 死杂草和作物，限制了其只能在作物出苗前或非作物种植区使用，这便制约了它在农业上 的应用。为了获得抗草甘瞵作物，从上世纪80年代，人们便开始培育抗草甘膦农作物，其中 最成功的例子是将改良的草甘膦靶标酶EPSP合酶导入植物中，以提高转基因植物对草甘 膦的抗性。草甘膦是通过抑制芳香族氨基酸生物合成中的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合 酶(EPSPS)，该酶催化莽草酸代谢途径倒数第二个反应。正常情况下EPSPS催化磷酸烯醇式 丙酮酸(PEP)与3-磷酸莽草酸(S3P)反应生成5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)和 无机磷。该酶只在植物和微生物中存在，在动物体中不存在该酶。由于草甘膦与PEP结构 相似，在植物和微生物体内可形成EPSP合成酶-S3P-草甘膦复合物，阻截PEP与酶的结合， 从而阻断芳香族氨基酸的合成。在一些极端环境下，如草甘膦工厂的废液池、长期喷洒草甘 瞵的农田等，发现了部分细菌的EPSPS对草甘膦具有部分抗性，并且被分离获得。植物可以 通过转基因表达细菌的抗性EPSPS而获得抗草甘膦的能力。农杆菌CP4、荧光假单胞菌G2 禾口 Salmonella typhimurium CT7的EPSPS已经在植物中得到广泛的验证和应用。现已被确定EPSP合成酶分为两个家族(Ming He等2001)，家族I包括来源于大 肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的EPSP合成酶；家族II包括来源于根癌农杆菌CP4、无色杆菌 LBAA、假单胞菌PG2982。家族II的EPSP合成酶多克隆抗体与家族I的EPSP合成醉不发生 交叉反应，且两者间的氨基酸同源性低于50%。在天然的植物EPSPS基因中，叶绿体转运肽区域包含在天然的编码序列中(例如 CTP2, Klee 等，Mol. Gen. Genet. 210 :47_442，1987). CTP 在叶绿体膜上从 EPSPS 酶上裂解下 来，产生成熟的EPSPS。由于细菌及真菌来源的EPSPS基因不能编码植物蛋白所特有的转运 肽(transitp印tide)序列，而EPSP合酶只有被转运到叶绿体中才能发挥其作用，所以必须 人为为其添加一条转运肽序列。
发明内容
本发明通过一种全新的方法克隆到一种aroA基因，该基因编码的EPSPS具有很高 的抗草甘膦能力，可以用来生产抗草甘膦植物，也可以作为微生物和植物细胞培养中的筛选标记。本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的提供一种抗草甘膦基因，该基因的核苷酸序列为SEQ ID No :1。序列表中的SEQ ID No 1由1602个核苷酸组成，其中前213bp编码高粱EPSPS 基因的转运肽，该转运肽与已报道的序列无任何同源性；214-1602bp为psedomonas moraxelIaceaeNo. 1菌EPSPS基因序列，在核苷酸序列上，该基因不与任何内外专利序列存 在同源性。本发明所提供的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶名称为EPSPS-Ll，是具有序列 表中SEQID No :2氨基酸序列的蛋白质，其在细胞中能提高抗草甘膦能力。序列表中的SEQ ID No :2由533个氨基酸组成，其中前71个氨基酸包含高粱 EPSPS基因的转运肽，该转运肽与任何已申请专利的氨基酸序列无同源性；72-533个氨基 酸为psedomonas moraxelIaceae No. 1菌EPSPS蛋白序列，该序列与已报道的抗草甘膦 EPSPS 同源性最高的为 68% (US 5627061,5633435) 利用本发明的基因编码的蛋白质序列，可以设计和人工合成密码子优化的有利于 在植物中表达的核苷酸序列。例如Campbell和Gowri (1990)的报道(Plant Physiol. 92 1-11)。这些氨基酸序列同源性较高的蛋白质一般具有相同的功能，因此在SEQ ID No:2所 示氨基酸序列具有80%及以上同源性的基因都可能拥有草甘膦抗性。氨基酸的同源性可以 通过http //www, ncbi. nhn. nih. gov/中bIastP获得。通过上述方法获得的基因属于本发 明的保护范围。含有本发明基因的表达载体、转基因细胞、寄主菌均属于本发明的保护范围。所述表达载体中的EPSPS编码基因的上游与启动子相连，下游与控制转录终止的 调控序列相连。转基因细胞的获得方法可为农杆菌介导法、基因枪法、原生质体介导法等转化方 法。所述细胞可以为水稻、玉米、小麦、大麦、高粱等单子叶植物或烟草、棉花、杨树、大 豆、甘薯、马铃薯、白菜、甘蓝等双子叶植物。
下面通过实施例和附图进一步详细叙述本发明图1 抗草甘膦细菌psedomonas moraxelIaceae No. 1在不同草甘膦浓度的M63培 养基中的生长曲线图；图2 =EPSPS-LO与高粱EPSPS基因信号肽的重组示意图；图3 植物表达载体pHM102EP-Ll图谱构建示意图；图4 转基因玉米的PCR检测结果；图5 用草甘膦涂抹转基因玉米叶片的实验结果；图6 用草甘膦喷洒转基因玉米植株的实验结果。
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体实施步骤参考(Sambrook 等人，分子克隆实验指南，New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press， 1989)，所用术语和缩写均是本领域技术人员通用的术语和缩写。实施例1、抗草甘膦菌株的获得和鉴定1、菌株的获得 固体培养基筛选法分别称取20g极端污染土样(来自湖北某草甘膦生产工厂)， 于0. 1L0. 9%的氯化钠溶液中，磁力搅拌20分钟，涂板于IOOmM草甘膦的M63培养基(配方 磷酸二氢钾3g、磷酸氢二钾7g、硫酸铵2g、硫酸亚铁0. 0005g、硫酸镁0. 4928g、甘油40ml、 VB10. 2g、琼脂15g，调PH6. 80，灭菌后加过滤器灭菌的葡萄糖8g和草甘膦16. 9g，用灭菌水 定容至1000ml)上，24小时后观察结果有不同类型的单菌落长出，将每个单菌落在IOOmM 浓度草甘膦的M63液体培养基中培养过夜，甘油保存备用。2、菌株抗性的鉴定将保存的菌液在IOOmM过夜培养，取等量的菌液在OmM，IOOmM, 200mM, 300mM,......
1500mM浓度草甘膦分别培养，在6h、16. 5h、22h、26. 5h、31. 5h、40. 5h、46. 5h测定浓度，绘制 不同单克隆的生长曲线，其中以No. 1抗性最强，可以在900mM浓度的菌液下继续生长，具体 见附图1。3, No. 1抗性菌16S rDNA分子鉴定挑取No. 1菌单克隆，在含有200mM的M63培养基中过夜培养，收集菌体，提取细 菌DNA，以DNA为模板，用细菌16S rDNA通用引物(北京奥科公司合成)扩增，得到一条 1. 5kb左右的条带，连接T-easy克隆载体(北京全式金公司生产)测序(北京奥科公司完 成)。核苷酸和氨基酸分析软件为DNAman和美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation, NCBI, http://www. ncbi. nhn. nih. gov/)白勺 Blast 禾呈序 与Genbank中的16S rDNA序列进行同源性比较(Altschul. 1997)，结果该菌的16S rDNA 与 psedomonas moraxelIaceae 同源性最高，为 95 %,命名为 psedomonas moraxelIaceae No. 1。实施例 2、psedomonas moraxelIaceae No. 1 菌 EPSPS 基因的获得1、全基因组序列获得鉴于psedomonas moraxelIaceae No. 1菌对草甘膦的耐受能力高达9OOmM,必然 是该菌在长期高浓度草甘膦的选择压下，进行了定向突变，而这种定向突变很可能是EPSPS 基因在结构上发生了变化，我们尝试通过同源克隆的方法克隆该菌的EPSPS基因，但一直 未获得成功。为此我们利用目前最为快速、廉价的测序方法solexa测序技术即可在一个 反应中同时加入4种核苷的标签，采用边合成边测序(SBS-sequencing by synthesis)，可 减少因二级结构造成的一段区域的缺失，并具有所需样品量少，高通量，高精确性，拥有简 单易操作的自动化平台和功能强大等特点，此反应可以同时检测上亿个核苷酸片断，因此 在同一个芯片或几个芯片上花费很少(只需常规方法的1%)的成本就可测试全基因组。2、全基因组序列分析及EPSPS基因的克隆利用序列拼接软件将测序结果拼接，在通过已知的psedomonas moraxelIaceae 菌EPSPS基因序列通过与该菌基因组序列比对，找到2条与psedomonas moraxelIaceae 菌EPSPS基因同源的序列，这两条序列无重复区域，经初步分析，我们确定这两条序列为 psedomonasmoraxelIaceae菌的EPSPS基因序列。由于序列没有完全测通，我们分别在这两条序列上设计引物进行扩增，得到1条1. 3kb条带，连τ-easy克隆载体测序，得到 psedomonas moraxelIaceae 菌的 EPSPS 基因全长序列,命名为 EPSPS-L0。 3、EPSPS-LO与高粱EPSPS基因信号肽的重组在EPSPS基因全长序列的基础上，重新设计引物，在5 ’端添加Pst 1酶切位点，3 ’ 端添加KpnI酶切位点，进行再扩增，扩增产物测序后正确克隆提质粒保存。高粱EPSPS基 因信号肽区域由于GC含量过高，我们按照高粱基因序列人工合成了高粱EPSPS基因5’端 213bp，并在5’端添加了 Bgl II酶切位点，3’端天然存在一个PstI酶切位点。在两个片段 重组过程中，我们按照以下步骤进行a、在载体pUC19载体PstI和HindIII之间添加一个 Bgl II的酶切位点；b、用KpnI、PstI分别消化EPSPS-LO和a，然后将两个片段进行连接转 化得到阳性克隆；C、用PstI、Bgl II消化高粱EPSPS基因5’端213bp和b，然后将两个片 段进行连接转化得到阳性克隆，命名为EPSPS-L1，具体构建示意图见附图2实施例3、抗草甘膦基因EPSPS-Ll在玉米中的表达1、植物表达载体的构建首先通过已有的植物表达载体pHM102，其图谱如附图3所示，分别用BamHI、Kpnl 消化PHM102，用Bgl II,KpnI消化EPSPS-L1，由于BamHI与Bgl II酶切后产生的粘性末端 相同，因此可以进行连接，将两个片段连接，得到EPSPS-Ll的植物表达载体pHM102EP-Ll。2、转抗草甘膦基因EPSPS-Ll玉米的获得转基因玉米的获得方法为采用基因枪法将插入序列导入受体植株的愈伤组织，经 除草剂草丁膦筛选后获得转基因植株。具体方法为(一)、诱导II型愈伤组织a、去除苞叶切除果穗顶端约Icm左右，用镊子从顶端插入果穗，这样可以以镊子 当作把手，有利与操作，然后把果穗放入含有消毒液的烧杯里，根据实际需要，可以在同一 个烧杯里放4-6个果穗。b、向烧杯里加约700ml的消毒液(50%的漂白剂或5. 25%的次氯酸钠，并加入一 滴Tween20)用来浸泡果穗，在消毒20分钟过程当中，不时的旋转果穗同时轻轻拍打烧杯以 驱除子粒表面的气泡，从而达到最佳的消毒效果。消毒结束后，取出果穗并放入盛满灭菌水 的烧杯里，在水里洗3次，然后准备剥胚。C、把消过毒的果穗一端放在一个大的培养皿上，用大的手术刀削掉籽粒的顶部 (l-2mm)，在这过程当中，要勤消毒所用的工具，如手术刀片、培养皿、剥胚刀等。d、用剥胚刀的刀尖插在胚和胚乳之间，然后轻轻向上撬出幼胚，用小的手术刀尖 轻轻托起幼胚，确保幼胚不受到任何的损伤，把幼胚的胚轴面紧贴放有滤纸的N6E培养基， 胚的密度大约是2X2cm (20-25个/皿)。e、新鲜的幼胚大约1. 5-1. 8mm大小，放置在N6E培养基上面，每隔10_15天继代一 次，刚获得的幼胚容易长出芽状组织，这样可以提早去掉该组织，而不用等到10-15天。f、挑选优等II型愈伤第二次愈伤继代时，II型愈伤已经开始形成，其特征为颜 色米黄，生长速度快，松散易碎，新生愈伤顶端呈现米粒状颗粒。可以根据其特征来进行有 针对性的挑选，可以把已经分化出的II型愈伤分成麦粒状大小，每皿(90cm)放20-25块。g、为了保证愈伤的质量，保证每次继代的时间间隔不能超过15天，同时保证一直 有400皿以上的II型愈伤，以便做基因枪转化。
( 二 )、金粉的准备和基因枪轰击a、称量15mg金粉并放入灭菌后的1. 5ml的印pendorf离心管当中，这样结果是 IOX的量。b、在超净台下，向每个离心管中加入500ul冰冻(-20°C )无水乙醇，震荡15sec， 在超净台上收集金粉到离心管底部，静置30min，直到金粉全部沉淀。C、然后转速3000rpm离心60sec，彻底去除乙醇。再向离心管中加入冰浴的无菌 ddH20，用手指轻弹混勻，然后转速3000rpm离心60sec。重复上述步骤2_3次，最后一次用 转速5000rpm离心15sec，然后移去上清，再用500ulddH20悬浮。震荡15sec，然后快速悬 浮混勻，边混边分装。d、具体的分装方法是先把10个离心管放好，用25ul的量分装，重复分装两次， 第一遍从第一个管开始，第二遍从最后一个管开始，这样每个离心管含有50ul水，1. 5mg金 粉。然后盖上盖子于-20°C保存。e、上午先把要打枪的愈伤分成小块，堆积在渗透培养基(N60SM)的中央区域，根 据计划做准备。f、目的DNA的包裹，先把分装好的金粉(-20°C )(每管1. 5mg并保存在50微升超 纯水当中)放在冰上，同时把CaCL2浓度为2. 5M(4°C )和亚精胺浓度为0. IM(-70°C )也放 在冰上融化，其中CaCL2和亚精胺分装成一次性使用的包装。g、用手指轻轻弹装有金粉的离心管使之悬浮起来，然后加入目的DNA(60-200ng)， 迅速用手指轻弹使之混勻然后加入50微升CaCL2并用枪头轻轻吸吐使之混勻，然后加入20 微升亚精胺，静置30秒把离心管放在漩涡振荡器上面震荡10分钟(注意使旋涡液体不要 上升太高，同时使液体全部悬浮起来)。h、离心管放到冰上静置5分钟(如果震荡以后有金粉在液体表面漂浮，静置前再 用手指轻弹使之沉淀下来)，2000rpm离心15秒，然后用吸头吸掉上清加入预冷(_20°C )的 无水乙醇250微升，并用枪头轻轻(20微升的枪调到10-13微升)吸吐混勻。重复以上步 骤3-4次，然后加入无水乙醇120-140微升使之平均分成8份并加到宏载片上面开始基因 枪轰击。i、基因枪轰击以后的1-12小时把愈伤倒至N6E培养基上进行恢复。(三)、转基因植株的获得a、在N6E培养基上诱导愈伤组织10_14天后，转移到N6S(选择培养基)上(2. Omg/ Lbialaphos)，开始选择含有转化子的细胞，然后用parafilm封口膜封培养皿。b、3周以后，把胚转移到新鲜的N6S培养基上，大约6-8周，就会选到抗草胺膦的克隆。c、把II型愈伤组织每皿转移15片(4mm/片)到再生培养基I上，25度暗培养2_3 周，并用通风带封住培养皿。d、2_3周后，把成熟的胞质胚转移到再生培养基II上准备发芽，同时用通风带封 住培养皿，植株将在这个培养基里长叶和根。
e、移栽成活的转化植株长出7-8叶时，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基 因，转基因植株开花后套袋自交或姊妹交结实。种子播种在温室，植株长到4-6叶期时取叶 片提取DNA，采用PCR技术检测是带有外源基因。
3、转基因植株的检测根据EPSPS-Ll基因序列和PHM102载体上的序列分别设计上游和下游引物，引物 序列如下检测引物F 5，GACGCTTCTTCTGCTACCTATCCTT 3，检测引物R 5，CCAATACGCAAACCGCCTCT 3，分别提取通过上述方法获得的转基因植株的基因组DNA，取0. 1 μ g基因组DNA为 模板，分别在检测引物F和检测引物R的引导下，用PCR法鉴定外源基因EPSPS-Ll在基因 组上的整合情况，电泳PCR产物结果如图4所示(泳道M为MarkerlV，泳道CK-为转化有空 载体的阴性对照，CK+为质粒DNA阳性对照，泳道4-15为转基因植株)，可以扩增出850bp 左右大学特异片段的即为含有EPSPS-Ll基因的转基因阳性植株，通过PCR结果可以看出除 均为阳性植株。4、转基因植株田间草甘膦抗性检测首先对非转基因植株涂抹0、0. 5、1、1. 5、2、2. 5、3、3. 5、4、4. 5、5mM不同浓度的草
甘膦，确定正常状态下非转基因植株所能耐受的草甘膦浓度，最终我们确定3mM为正常植 株所能耐受的临界值。选取转基因阳性植株及阴性对照植株叶片涂抹3mM浓度的草甘膦 药剂，结果如 图5所示，表明含有EPSPS-Ll的植株对草甘膦的耐受能力明显提高。然后我 们以2L/公顷剂量的农达(主要成分为草甘膦)喷洒转基因植株及阴性对照，结果如图6 所示，该照片拍摄于喷洒草甘膦后20天，右侧为转基因植株，左侧为阴性对照植株，表明转 EPSPS-Ll基因玉米受损情况明显低于阴性对照植株，对草甘膦具有较高的抗性。
权利要求
一种抗草甘膦5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸DNA分子，编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶，氨基酸残基如SEQ ID NO2所示。
2.编码权利要求1所述的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶突变体的基因，该基因的 碱基序列如SEQ ID NO 1所示。
3.含有权利要求2所述的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶突变体编码基因的表达 元件。
4.含有权利要求2所述的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶突变体编码基因的转基 因细胞。
全文摘要
本发明公开了一种抗草甘膦5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因及应用，涉及植物分子生物学和植物遗传工程学领域。具体的说，公开了一种细菌5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶氨基酸残基序列，如SEQ ID NO2所示。表达这种5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的植物会拥有对草甘膦的抗性。
文档编号C12N9/12GK101864437SQ201010172220
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月14日 优先权日2010年5月14日
发明者宋伟彬, 赖锦盛, 赵海楠, 赵海铭 申请人:中国农业大学