专利名称：高粱epsp合酶突变体及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物分子生物学和植物遗传工程学领域。具体的说，本发明涉及四种 高粱EPSP合酶突变体及其编码基因。可以通过遗传转化的方法使该基因在植物体内表达 从而提高植物对草甘膦的耐受能力，方便农田中的杂草清除。本发明可以运用于作物的育 种、植物细胞培养的筛选。
背景技术：
草甘膦是使用最为广泛的广谱除草剂，具有对人畜无毒，自然条件下杂草和农作 物难以对其产生抗性，低土壤残留量等特点，市场潜力巨大。然而由于草甘膦无选择性的杀 死杂草和作物，限制了其只能在作物出苗前或非作物种植区使用，这便制约了其在农业上 的应用。为了获得抗草甘膦作物，从上世纪80年代，人们便开始培育抗草甘膦农作物，其中 最成功的例子是将改良的草甘膦靶标酶EPSP合酶导入植物中，以提高转基因植物对草甘 膦的抗性。草甘膦是通过抑制芳香族氨基酸生物合成中的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合 酶(EPSPS)，该酶催化莽草酸代谢途径倒数第二个反应。正常情况下EPSPS催化磷酸烯醇式 丙酮酸(PEP)与3-磷酸莽草酸(S3P)反应生成5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)和无 机磷。由于草甘膦与PEP结构相似，在植物和微生物体内可形成EPSP合成酶-S3P-草甘膦 复合物，阻截PEP与酶的结合，从而阻断芳香族氨基酸的合成。该酶只在植物和微生物中存 在，在动物体中不存在。在一些极端环境下，如长期喷洒草甘膦的农田、草甘膦工厂的废液 池以及人为的加大对某植株草甘膦的选择压力等，发现了部分对草甘膦具有耐受能力的细 菌和植物。如Amrhein等人通过逐渐增加草甘膦的浓度，分离到一个耐受草甘膦的矮牵牛 细胞系；Baerson等人在长期喷洒草甘膦的果园中发现了一株耐受草甘膦的牛筋草，经过 后期实验证明这些抗性的产生均为EPSPS基因发生了突变，导致了其与草甘膦的结合能力 降低，并且保证了正常的催化能力。植物可以通过转化对草甘膦具有耐受能力的EPSPS基 因而获得抗草甘膦的能力。根癌农杆菌CP4、荧光假单胞菌G2和Salmonella typhimurium CT7的EPSPS已经在植物中得到广泛的验证和应用。现已被确定EPSP合成酶分为两个家族(Ming He等2001)，家族I包括来源于大 肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的EPSP合成酶；家族II包括来源于根癌农杆菌CP4、无色杆菌 LBAA、假单胞菌PG2982。家族II的EPSP合成酶多克隆抗体与家族I的EPSP合成酶不发生 交叉反应，且两者间的氨基酸同源性低于50%。在天然的植物EPSPS基因中，叶绿体转运肽区域包含在天然的编码序列中(例如 CTP2, Klee 等，Mol. Gen. Genet. 210 :47_442，1987)，CTP 在叶绿体膜上从 EPSPS 酶上裂解下 来，产生成熟的EPSPS。
发明内容
本发明克隆到高粱的EPSPS基因，并对其功能位点进行了人为突变，突变后的基因编码的EPSPS具有很高的抗草甘膦能力，可以用来生产抗草甘膦植物，也可以作为微生 物和植物细胞培养中的筛选标记。本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的提供四种5-烯醇 丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶突变体，名称为SbEPSPS-L37、SbEPSPS_L38、SbEPSPS_L39、 SbEPSPS-L40，这四种基因的核苷酸序列分别为SEQ ID No :4、SEQ ID No :6、SEQ ID No :8、 SEQID No :10o序列表中的SEQ ID No :4由1521个核苷酸组成，其中前186bp编码蛋白包含 高粱EPSPS基因的转运肽，该转运肽与已报道的序列无任何同源性；187-1521bp编码 SbEPSPS-L37基因序列，将其与野生型高粱EPSPS的核苷酸序列(序列表中的SEQ ID No: 1)进行比较，结果如图1所示，其核苷酸变化从5’端至3’端第491位由c变成了 t，相应 的502位由c变成了 t。序列表中的SEQ ID No :6由1521个核苷酸组成，其中前186bp编码蛋白包含 高粱EPSPS基因的转运肽，该转运肽与已报道的序列无任何同源性；187-1521bp编码 SbEPSPS-L38基因序列，将其与野生型高粱EPSPS的核苷酸序列(序列表中的SEQ ID No: 1)进行比较，结果如图1所示，其核苷酸变化从5’端至3’端第502位由c变成了 t。序列表中的SEQ ID No :8由1521个核苷酸组成，其中前186bp编码蛋白包含 高粱EPSPS基因的转运肽，该转运肽与已报道的序列无任何同源性；187-1521bp编码 SbEPSPS-L39基因序列，将其与野生型高粱EPSPS的核苷酸序列(序列表中的SEQ ID No: 1)进行比较，结果如图1所示，其核苷酸变化从5’端至3’端第503位由c变成了 t。序列表中的SEQ ID No:10由1521个核苷酸组成，其中前186bp编码蛋白包 含高粱EPSPS基因的转运肽，该转运肽与已报道的序列无任何同源性；187-1521bp编码 SbEPSPS-L40基因序列，将其与野生型高粱EPSPS的核苷酸序列(序列表中的SEQ ID No:
1)进行比较，结果如图1所示，其核苷酸变化从5’端至3’端第488位由g变成了c。这四种基因的氨基酸序列分别为SEQ ID No :3、SEQ ID No :5、SEQ ID No :7、SEQ ID No :9。序列表中的SEQ ID No :3由506个核苷酸组成，其中前62个氨基酸包含高 粱EPSPS基因的转运肽，该转运肽与已报道的序列无任何同源性；63-506个氨基酸为 SbEPSPS-L37氨基酸序列，将其与野生型高粱EPSPS的氨基酸序列(序列表中的SEQ ID No:
2)进行比较，结果如图2所示，其氨基酸变化从N端至C端第164位由T变成了I，相应的 168位由P变成了 S。序列表中的SEQ ID No :5由506个核苷酸组成，其中前62个氨基酸包含高 粱EPSPS基因的转运肽，该转运肽与已报道的序列无任何同源性；63-506个氨基酸为 SbEPSPS-L38氨基酸序列，将其与野生型高粱EPSPS的氨基酸序列(序列表中的SEQ ID No: 2)进行比较，结果如图2所示，其氨基酸变化从N端至C端第168位由P变成了 S。序列表中的SEQ ID No :7由506个核苷酸组成，其中前62个氨基酸包含高 粱EPSPS基因的转运肽，该转运肽与已报道的序列无任何同源性；63-506个氨基酸为 SbEPSPS-L39氨基酸序列，将其与野生型高粱EPSPS的氨基酸序列(序列表中的SEQ ID No: 2)进行比较，结果如图2所示，其氨基酸变化从N端至C端第168位由P变成了 L。序列表中的SEQ ID No :3由506个核苷酸组成，其中前62个氨基酸包含高粱EPSPS基因的转运肽，该转运肽与已报道的序列无任何同源性；63-506个氨基酸为 SbEPSPS-L40氨基酸序列，将其与野生型高粱EPSPS的氨基酸序列(序列表中的SEQ ID No: 2)进行比较，结果如图2所示，其氨基酸变化从N端至C端第163位由G变成了 A。利用本发明的基因编码的蛋白质序列，可以设计和人工合成密码子优化的有利于 在植物中表达的核苷酸序列。例如Campbell和Gowri (1990)的报道(Plant Physiol. 92 1-11)。这些氨基酸序列同源性较高的蛋白质一般具有相同的功能，因此与SEQ ID No:3、 SEQ ID No :5、SEQ ID No :7、SEQ ID No :9所示氨基酸序列具有80%及以上同源性的基 因都可能拥有草甘膦抗性。氨基酸的同源件可以通过httD: //V驟.ncbi. nhn. nih. rov/中 blastP获得。通过上述方法获得的基因属于本发明的保护范围。含有本发明基因的表达载体、转基因细胞、寄主菌均属于本发明的保护范围。所述表达载体中的EPSPS编码基因的上游与启动子相连，下游与控制转录终止的 调控序列相连。转基因细胞的获得方法可为农杆菌介导法、基因枪法、原生质体介导法等转化方 法。所述细胞可以为水稻、玉米、小麦、大麦、高粱等单子叶植物或烟草、棉花、杨树、大 豆、甘薯、马铃薯、白菜、甘蓝等双子叶植物。
下面通过实施例和附图进一步详细叙述本发明图 1 抗草甘膦基因 SbEPSPS-L37、SbEPSPS_L38、SbEPSPS_L39、SbEPSPS_L40 与野 生型SbEPSP的氨基酸序列比较分析；图 2 抗草甘膦基因 SbEPSPS-L37、SbEPSPS_L38、SbEPSPS_L39、SbEPSPS_L40 与野 生型SbEPSPS的核苷酸序列比较分析；图 3 植物表达载体 pHMEP-L37、pHMEP_L38、pHMEP_L39、pHMEP-L40 构建路线示意 图；图4 转基因玉米的PCR检测结果；图5 用草甘膦涂抹转基因玉米叶片的实验结果。
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体实施步骤参考 (Sambrook 等人，分子克隆实验指南，New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press， 1989)，所用术语和缩写均是本领域技术人员通用的术语和缩写。实施例1、高粱5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶突变体SbEPSPS_L37、 SbEPSPS-L38、SbEPSPS-L39、SbEPSPS_L40 的获得。1、高粱EPSP合酶cDNA全长的克隆根据http://www. phytozome. net中高粱EPSP合酶的cDNA全序列，我们分析发现 其5’端为GC富集区。我们尝试通过PCR过程获得其全长，但是没有获得成功。而后我们 根据现有的序列进行了人工合成其5’端735bp，第734bp为Seal的酶切位点，5’端添加 EcoRI、Bglll酶切位点，为了方便后期的载体构建我们在不改变氨基酸序列的前提下将第234位的C变成了 T，改变其Bgl II的酶切位点。并在第491位由C变成了 T，相应的502 位由C变成了 T得到了 SbEPSPS-L375，端；将其核苷酸变化从5，端至3，端第502位由C 变成了 T得到了 SbEPSPS-L385，端；将其核苷酸变化从5，端至3，端第503位由C变成了 T得到了 SbEPSPS-L395’端；将其核苷酸变化从5’端至3’端第488位由G变成了 C得到 了 SbEPSPS-L405，端。3，端采用常规的RT-PCR的方法扩增高粱BTX623自交系cDNA 扩增 引物为SbEPSP3，F :5，GCGGAGGCGAACCAAAC 3，SbEPSP3，R :5’ GGTACCCTTAGTTCTTGACGAACGTGCTC 3’扩增产物连T-easy克隆载体，测序正确后SacI、Kpnl消化，与SacI、Kpnl消化 的 pUC19 连接，得到 pUC 19+SbEPSPS 3，，再将 pUC 19+SbEPSPS3，与合成的 SbEPSPS_L37、 SbEPSPS-L38、SbEPSPS-L39、SbEPSPS-L405，端分别用 SacI、EcoRI 消化，回收目的条带连接 得到 SbEPSPS-L37、SbEPSPS-L38、SbEPSPS_L39、SbEPSPS_L40。2、植物表达载体 pHMEP-L37、pHMEP_L38、pHMEP_L39、pHMEP-L40 的构建首先通过已有的植物表达载体pHM102，其图谱如附图3所示，分别用BamHI、Kpnl 消化PHM102，用 Bgl II,Kpnl 消化 SbEPSPS-L37、SbEPSPS-L38、SbEPSPS-L39、SbEPSPS_L40， 由于BamHI与Bgl II酶切后产生的粘性末端相同，因此可以进行连接，将两个片段连接， 得到 SbEPSPS-L37、SbEPSPS-L38、SbEPSPS_L39、SbEPSPS_L40 的植物表达载体 pHMEP_L37、 PHMEP-L38、pHMEP-L39、pHMEP_L40。实施例2、抗草甘膦基因 SbEPSPS-L37、SbEPSPS_L38、SbEPSPS_L39、SbEPSPS_L40 在玉米中的表达。1、转抗草甘膦基因 SbEPSPS-L37、SbEPSPS_L38、SbEPSPS_L39、SbEPSPS_L40 玉米 的获得转基因玉米的获得方法为采用基因枪法将插入序列导入受体植株的愈伤组织，经 除草剂草丁膦筛选后获得转基因植株。具体方法为(一)、诱导II型愈伤组织a、去除苞叶切除果穗顶端约1cm左右，用镊子从顶端插入果穗，这样可以以镊子 当作把手，有利与操作，然后把果穗放入含有消毒液的烧杯里，根据实际需要，可以在同一 个烧杯里放4-6个果穗。b、向烧杯里加约700ml的消毒液(50%的漂白剂或5. 25%的次氯酸钠，并加入一 滴Tween20)用来浸泡果穗，在消毒20分钟过程当中，不时的旋转果穗同时轻轻拍打烧杯以 驱除子粒表面的气泡，从而达到最佳的消毒效果。消毒结束后，取出果穗并放入盛满灭菌水 的烧杯里，在水里洗3次，然后准备剥胚。c、把消过毒的果穗一端放在一个大的培养皿上，用大的手术刀削掉籽粒的顶部 (l-2mm)，在这过程当中，要勤消毒所用的工具，如手术刀片、培养皿、剥胚刀等。d、用剥胚刀的刀尖插在胚和胚乳之间，然后轻轻向上撬出幼胚，用小的手术刀尖 轻轻托起幼胚，确保幼胚不受到任何的损伤，把幼胚的胚轴面紧贴放有滤纸的N6E培养基， 胚的密度大约是2X2cm (20-25个/皿)。e、新鲜的幼胚大约1. 5-1. 8mm大小，放置在N6E培养基上面，每隔10_15天继代一 次，刚获得的幼胚容易长出芽状组织，这样可以提早去掉该组织，而不用等到10-15天。
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f、挑选优等II型愈伤第二次愈伤继代时，II型愈伤已经开始形成，其特征为颜 色米黄，生长速度快，松散易碎，新生愈伤顶端呈现米粒状颗粒。可以根据其特征来进行有 针对性的挑选，可以把已经分化出的II型愈伤分成麦粒状大小，每皿(90cm)放20-25块。g、为了保证愈伤的质量，保证每次继代的时间间隔不能超过15天，同时保证一直 有400皿以上的II型愈伤，以便做基因枪转化。( 二)、金粉的准备和基因枪轰击a、称量15mg金粉并放入灭菌后的1. 5ml的印pendorf离心管当中，这样结果是 10X的量。b、在超净台下，向每个离心管中加入500ul冰冻(-20°C )无水乙醇，震荡15sec， 在超净台上收集金粉到离心管底部，静置30min，直到金粉全部沉淀。c、然后转速3000rpm离心60sec，彻底去除乙醇。再向离心管中加入冰浴的无菌 ddH20，用手指轻弹混勻，然后转速3000rpm离心60sec。重复上述步骤2_3次，最后一次用 转速5000rpm离心15sec，然后移去上清，再用500ulddH20悬浮。震荡15sec，然后快速悬 浮混勻，边混边分装。d、具体的分装方法是先把10个离心管放好，用25ul的量分装，重复分装两次， 第一遍从第一个管开始，第二遍从最后一个管开始，这样每个离心管含有50ul水，1. 5mg金 粉。然后盖上盖子于-20°C保存。e、上午先把要打枪的愈伤分成小块，堆积在渗透培养基(N60SM)的中央区域，根 据计划做准备。f、目的DNA的包裹，先把分装好的金粉(-20°C )(每管1. 5mg并保存在50微升超 纯水当中)放在冰上，同时把CaCL2浓度为2. 5M(4°C )和亚精胺浓度为0. 1M(-70°C )也放 在冰上融化，其中CaCL2和亚精胺分装成一次性使用的包装。g、用手指轻轻弹装有金粉的离心管使之悬浮起来，然后加入目的DNA(60-200ng)， 迅速用手指轻弹使之混勻然后加入50微升CaCL2并用枪头轻轻吸吐使之混勻，然后加入20 微升亚精胺，静置30秒把离心管放在漩涡振荡器上面震荡10分钟(注意使旋涡液体不要 上升太高，同时使液体全部悬浮起来)。h、离心管放到冰上静置5分钟(如果震荡以后有金粉在液体表面漂浮，静置前再 用手指轻弹使之沉淀下来)，2000rpm离心15秒，然后用吸头吸掉上清加入预冷(_20°C )的 无水乙醇250微升，并用枪头轻轻(20微升的枪调到10-13微升)吸吐混勻。重复以上步 骤3-4次，然后加入无水乙醇120-140微升使之平均分成8份并加到宏载片上面开始基因 枪轰击。i、基因枪轰击以后的1-12小时把愈伤倒至N6E培养基上进行恢复。(三)、转基因植株的获得a、在N6E培养基上诱导愈伤组织10_14天后，转移到N6S(选择培养基)上(2. Omg/ Lbialaphos)，开始选择含有转化子的细胞，然后用parafilm封口膜封培养皿。b、3周以后，把胚转移到新鲜的N6S培养基上，大约6-8周，就会选到抗草胺膦的克隆。c、把II型愈伤组织每皿转移15片(4mm/片)到再生培养基I上，25度暗培养2_3 周，并用通风带封住培养皿。
d、2_3周后，把成熟的胞质胚转移到再生培养基II上准备发芽，同时用通风带封 住培养皿，植株将在这个培养基里长叶和根。e、移栽成活的转化植株长出7-8叶时，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基 因，转基因植株开花后套袋自交或姊妹交结实。种子播种在温室，植株长到4-6叶期时取叶 片提取DNA，采用PCR技术检测是带有外源基因。2、转基因植株的检测根据EPSPS合酶基因序列和PHM102载体上的序列分别设计上游和下游引物，引物 序列如下检测引物F 5，CGTGGCGTCCTGGAGAGTAAAG 3，检测引物R 5，CCAATACGCAAACCGCCTCT 3，分别提取通过上述方法获得的转基因植株的基因组DNA，取0. lyg基因组DNA 为模板，分别在检测引物F和检测引物R的引导下，用PCR法鉴定外源基因SbEPSPS-L37、 SbEPSPS-L38、SbEPSPS-L39、SbEPSPS-L40在基因组上的整合情况，电泳PCR产物结果如图4 所示(泳道M为MarkerIV，泳道CK-为转化有空载体的阴性对照，CK+为质粒DNA阳性对照， 泳道1-5为转基因植株)，可以扩增出700bp左右大小特异片段的即为含有SbEPSPS-L37、 SbEPSPS-L38、SbEPSPS-L39、SbEPSPS_L40基因的转基因阳性植株，通过PCR结果可以看出 1-5均为阳性植株。3、转基因植株田间草甘膦抗性检测首先对非转基因植株涂抹0、0. 5、1、1. 5、2、2. 5、3、3. 5、4、4. 5、5mM不同浓度的草
甘膦，确定正常状态下非转基因植株所能耐受的草甘膦浓度，最终我们确定3mM为正常植 株所能耐受的临界值。选取转基因阳性植株及阴性对照植株叶片涂抹3mM浓度的草甘膦药 剂，结果如图 5 所示，表明含有 SbEPSPS-L37、SbEPSPS_L38、SbEPSPS_L39、SbEPSPS_L40 的 植株对草甘膦的耐受能力明显提高。
权利要求
一种5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶突变体，命名为SbEPSPS-L37，其氨基酸残基如SEQ ID NO3所示。
2.编码权利要求1所述的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶突变体的基因，该基因的 碱基序列如SEQ ID NO 4所示。
3.—种5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶突变体，命名为SbEPSPS-L38，其氨基酸残 基如SEQ ID NO 5所示。
4.编码权利要求3所述的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶突变体的基因，该基因的 碱基序列如SEQ ID NO 6所示。
5.一种5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶突变体，命名为SbEPSPS-L39，其氨基酸残 基如SEQ ID NO 7所示。
6.编码权利要求5所述的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶突变体的基因，该基因的 碱基序列如SEQ ID NO 8所示。
7.—种5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶突变体，命名为SbEPSPS-L40，其氨基酸残 基如SEQ ID NO 9所示。
8.编码权利要求7所述的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶突变体的基因，该基因的 碱基序列如SEQ ID NO 10所示。
9.一种定位到叶绿体的信号肽，其氨基酸残基序列如SEQ ID N0:11所示。
10.编码权利要求9所述的一种定位到叶绿体的信号肽的基因，该信号肽的碱基序列 如 SEQID NO 12 所示。
11.含有权利要求2、4、6、8、10所述的5-烯醇丙酮酰莽草酸_3_磷酸合酶突变体编码 基因的表达元件。
12.含有权利要求2、4、6、8、10所述的5-烯醇丙酮酰莽草酸_3_磷酸合酶突变体编码 基因的转基因细胞。
全文摘要
本发明公开了高粱EPSP合酶突变体及其编码基因与应用，该发明涉及植物分子生物学和植物遗传工程学领域。具体公开了四种高粱5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶突变体，其氨基酸残基如SEQ ID NO3、5、7、9所示。表达这四种5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的植物会拥有对草甘膦的抗性。
文档编号C12N15/54GK101864403SQ20101017220
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月14日 优先权日2010年5月14日
发明者宋伟彬, 赖锦盛, 赵海铭 申请人:中国农业大学