专利名称：拟南芥谷胱甘肽依赖型甲醛脱氢酶的原核表达载体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种高效表达拟南芥谷胱甘肽依赖型 甲醛脱氢酶蛋白(ADH)的原核表达载体pET32a-ADH及其在ADH蛋白的原核表达和ADH包 涵体蛋白制备中的应用。
背景技术：
甲醛是一种无色，有强烈刺激气味的气体，易溶于水、醇和醚。它反应能力极强， 能与蛋白质，核酸和脂类产生非特异性的反应(Feldman等，Prog NucleicAcid Res Mol Biol, 1973,13 1_49)，是一种非常活泼的化合物，因此对所有的生物来说都有很高的毒性。 甲醛被广泛用于工业生产中，是制造树脂、胶粘剂、油漆、塑料、人造纤维的原料，是胶粘剂 工业应用最广泛的化学原材料。随着经济的发展和人民生活水平的提高，各种原料制成的 建筑装饰材料已走入各种室内公共场所和家庭，使甲醛成为室内空气污染公认最具代表性 的化学物质。人们入住新居都要进行室内装饰和更新家具，其正是室内空气甲醛污染的主 要来源。甲醛污染危害严重的场所是居室、办公室、会议室、宾馆、KTV包房、家具商场、建 材商场等。室内空气中游离甲醛浓度在中国规定的允许值是0. 08 (mg/立方米)，有调查表 明新的宾馆客房室内空气中甲醛浓度最高达0. 36mg/立方米，平均为0. 173mg/立方米，是 室外对照的13倍。而家具商场最高达0.873mg/立方米，平均为0.432mg/立方米，是室外 对照的33倍。建成一所经过装饰的实验室，空气中甲醛平均浓度高达0. 5mg/立方米，是室 外的62. 5倍。抽样检测发现单位及住户室内环境污染严重，查了 11家只有1户合格，其中 竟有1户甲醛超标25倍。甲醛为较高毒性物质，当室内空气中甲醛含量为0. Img/立方米时，就有异味和不 适感；达到0. 5mg/立方米时，可刺激眼睛，引起流泪；达到0. 6mg/立方米时，可引起咽喉不 适或疼痛。浓度更高时，可引起恶心呕吐，咳嗽胸闷，气喘甚至肺水肿；达到30mg/立方米 时，会立即致人死亡。长期接触低剂量甲醛可引起慢性呼吸道疾病，引起鼻烟癌、结肠癌、脑 瘤、月经紊乱、细胞核的基因突变，DNA单链内交连和DNA与蛋白质交连及抑制DNA损伤的修 复、妊娠综合症、引起新生儿染色体异常、白血病，这就是所谓的装修综合病(sick-house)。相对于油漆中的苯、甲苯、二甲苯、游离甲苯二异氰酸酯(TDI)、挥发性有机化合物 (VOC)等有害物质来说，甲醛具有潜伏周期长(3-15年)、隐藏深、分布广、易挥发、治理难、 危害大等特性。目前清除污染甲醛通常使用的方法有三种一是使用环保材料；二是开窗 通风；三是用植物或除污剂清除污染，使用除污剂有二次污染的可能。用室内栽培植物清除 甲醛污染，是最自然、最环保的方式，科学研究证明确实有些植物能够吸收分解甲醛，但吸 收能力和速度非常有限(Giese 等，1994，Plant Physiol. 104 1301-1309)。已有研究表明外源甲醛能够作为碳源被整合入光合细胞的代谢产物中。比 如，普通的挂兰在14C标记的甲醛上生长时通过一碳代谢产生14C标记的产物，如丝氨 酸和卵磷脂。甲醛可以和谷胱苷肽，精氨酸，天冬酰氨和四氢叶酸形成加合物后通过不
3同的途径进行代谢(GIESE 等，Plant Physiol，1994，104(4) :1301_1309)。对几种真 核生物的生化和遗传学研究表明谷胱苷肽依赖型甲醛脱氢酶(FALDH)是甲醛代谢的关 键酶之一，此酶广泛存在于植物体的所有组织中，它催化的反应以甲醛和谷胱苷肽的 加合物硫代羟甲基谷胱苷肽(S-hydroxymethylglutathione)为底物产生硫代甲酰基 谷胱苷肽(S-formylglutathione)。在植物中还有硫代甲酰谷胱苷肽水解酶，它能把 S-formylglutathione分解为甲酸和谷胱苷肽，这两个酶组成一条甲醛到甲酸的氧化途径。Achkor等人为了检测甲醛脱氢酶在植物中的功能，对源于拟南芥ADH基因进行遗 传操作，得到了不同ADH水平的拟南芥转基因株系。用组成型启动子CaMV 35S过量表达此 酶的拟南芥对外源甲醛的摄取效率提高25%，ADH水平降低的植物(由于共抑制表型或者 反意表达)和野生型拟南芥相比，甲醛脱毒速率显著减慢。这些结果表明植物吸收甲醛的 能力与 ADH活力水平相关(Achkor 等，Plant Physiol, 2003,132(4) :2248_2255)。因此 ADH 的过量表达可用于提高观赏植物代谢甲醛能力的分子育种，把ADH整合到植物基因组后， ADH蛋白在植物中的表达量是转基因是否起作用的关键，其中ADH蛋白特异性抗体是检测 转基因植物中ADH蛋白表达水平的有效工具。有研究用PKK223-3载体和Tac启动子(trp promoter和Iacpromoter的杂合体)在大肠杆菌JM109中表达ADH蛋白，获得有生物活性的 ADH 蛋白(Dolferus 等，Genetics，1997，146 :1131_1141)。Achkor 等把 ADH 亚克隆于酵母 表达载体(pYes2)，然后在酵母菌中表达ADH，从转基因酵母中纯化到ADH蛋白，并用于制备 一些 ADH 的抗体(Achkor 等，Plant Physiol, 2003,132(4) :2248_2255)。但是在酵母表达 系统中ADH蛋白表达量不高，所以ADH蛋白纯化操作过程很复杂，通常用这种方法纯化ADH 蛋白需要大规模培养酵母菌，过几种性质不同的柱子，并用专业的仪器控制洗脱条件，蛋白 纯化的成本很高，因此这种方法不方便重复使用。
发明内容
本发明的目的是提供一种ADH的原核表达载体(pET32a_ADH)，该载体含有T7启动 子和终止子、细菌核糖体结合位点和ADH基因及一个组氨酸标签，利用该载体转化大肠杆 菌(BL21)，实现ADH蛋白的高水平表达，表达的ADH蛋白90%以上形成包涵体，用高浓度的 尿素溶解包涵体后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离ADH蛋白，再从凝胶中回收ADH蛋白可得 到纯度极高的ADH蛋白，可作为抗原用于ADH抗体的制备。ADH重组蛋白表达量很高，因此 不需要大规模培养细菌，纯化ADH蛋白的操作相当简单，成本也很低，极易重复使用。为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案ADH的原核表达载体pET32a_ADH，该载体含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结 合位点和ADH基因及一个组氨酸标签。上述载体中的ADH基因来源于拟南芥，在GenBank中的登录号为ATO63931。上述载体中ADH基因的上游有T7启动子和细菌核糖体结合位点RBS，T7启动子的 下游有可被IPTG诱导的操作子序列，紧靠ADH基因的起始密码子上游还有一个组氨酸标签 序列。原核表达载体pET32a_ADH，由下述方法构建而得(1)从GenBank中查找拟南芥ADH的全长基因序列，并设计序列如下的一对引物ADH5 :5，-CACCATGGCGACTCAAGGTCAGGTTATC-3‘
ADH3 :5’ -GAATTCTCATTTGCTGGTATCGAGG-3，5’端引物有CCATGG特征序列，并由此形成Nco I酶切位点；下游引物3’端引物添 加EcoR I酶切位点GAATTC。以拟南芥第一链cDNA为模版扩增，得到ADH基因的全长cDNA。(2)回收并纯化ADH全长基因片段，并将其连接到pMD18-T载体上，采用碱裂解法 提取质粒DNA，通过酶切检测获得重组质粒pMD-ADH ；(3)构建原核载体 pET32a_ADH，用 NcoI 和 EcoRI 双酶切 pMD-ADH 和 pET32a，并回 收纯化ADH基因片段以及载体片段pET32a，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR扩增检测和 酶切检测，获得原核表达载体pET32a-ADH。原核表达载体pET32a_ADH的制备方法，包括下列步骤(1)从GenBank中查找拟南芥ADH的全长基因序列，并设计序列如下的一对引物ADH5 :5，-CACCATGGCGACTCAAGGTCAGGTTATC-3‘ADH3 :5’ -GAATTCTCATTTGCTGGTATCGAGG-3’5’端引物有CCATGG特征序列，并由此形成Nco I酶切位点；3’端引物添加EcoRI 酶切位点GAATTC0以拟南芥第一链cDNA为模版扩增，得到ADH基因的全长cDNA。(2)回收并纯化ADH全长基因片段，并将其连接到pMD18_T载体上，采用碱裂解法 提取质粒DNA，通过酶切检测获得重组质粒pMD-ADH ；(3)构建原核载体 pET32a_ADH，用 NcoI 和 EcoRI 双酶切 pMD-ADH 和 pET32a，并回 收纯化ADH基因片段以及载体片段pET32a，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR扩增检测和 酶切检测，获得原核表达载体pET32a-ADH。原核表达载体在制备ADH包涵体蛋白中的应用。原核表达载体在制备ADH特异性抗体的抗原中的应用。用原核表达载体制备ADH特异性抗体抗原的方法，将上述载体用热刺激法导入大 肠杆菌蛋白表达专用受体菌株BL21中，获得转化子菌落，用ImM IPTG于37°C诱导4小时后 获ADH重组蛋白，90 %重组蛋白形成包涵体，用高浓度的尿素溶解包涵体后，通过聚丙烯酰 胺凝胶电泳分离ADH蛋白，再从凝胶中回收ADH蛋白可得到纯度极高的ADH重组蛋白，可作 为抗原用于ADH特异性抗体的制备，为ADH特异性抗体抗原的制备提供一条新途径。
图IADH基因的TA克隆策略。图2ADH基因的TA克隆。其中A表示PCR扩增adh基因片段，M λ DNA/HindIII，1 4 扩增产物；B表示 pMD-adh 质粒电泳检测，M λ DNA/HindIII, 1 :pMD_hps/phi (对照质粒)，2 5 :pMD_adh ；C 表示=EcoRI 酶切检测 pMD-adh 质粒，M:ADNA/HindIII，l 3 =EcoRI 酶切 pMD-adh产物，4 sphl 酶切 pMD-hps/phi 产物(对照质粒)；D 表示PCR 检验 pMD18_adh，M λ DNA/HindIII, 1 5 扩增产物。图3ADH基因的原核表达载体构建策略。图4ADH基因原核表达载体的检测。其中(A)表示重组质粒pET32a_ADH的电泳检测。1-13 重组质粒pET32a_ADH ；14 正对照(分子量为7. Okb的质粒DNA)。(B)表示重组质粒pET32a-ADH的双酶切检测。M
5DNA markerIII ；1 用 Xho I+BamH I 双酶切的pET32a_ADH ;2 没有酶切的质粒pET32a_ADH。图5ADH原核表达条件的优化。图6可溶性和不溶性ADH重组蛋白的分布㈧及纯化⑶。
具体实施例方式试剂与仪器试剂主要分为分子生物学实验试剂。各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、反转录 酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自 博大泰克生物技术有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取试剂购自invitrogen公司。其余 试剂均为国产分析纯。仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。所有引物序列均在大连宝生物公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明 均为常规方法。 实施例1 :ADH基因cDNA扩增及TA克隆ADH基因的扩增及TA克隆的策略如图1所示，首先从GenBank中查找ADH的全长 基因序列，并设计一对特异引物，序列如下ADH5 CACCATGGCGACTCAAGGTCAGGTTATCADH3 GAATTCTCATTTGCTGGTATCGAGG上游引物有CACCATGG特征序列，并由此形成NcoI酶切位点；下游引物末端加EcoR I酶切位点GAATTC。M TRIzoL Reagent(Invitrogen) hKM^^Y (Arabidopsis thaliana) 巾 Ι. 总RNA，取植物嫩叶约0. Ig,加入Iml的TRIzoL提取液在研钵中研磨，室温静置5min后移 入离心管，再加入0. 2ml氯仿，振荡混勻，离心15min (12000rpm)，转移上清液至新管，加入 0. 5ml异丙醇，混勻室温放置10min，4°C离心IOmin (12000rpm)，弃上清，沉淀用75%乙醇 Iml清洗，4°C离心5min(7500rpm)，弃乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20μ 1焦碳酸二乙 酯(DEPC)处理水溶解 RNA。使用 M-MuLV Reverse Transcriptase Kit(TaKaRa)进行 cDNA 的合成，取植物总 RNA 约 0. 1 μ g-5 μ g, oligo (dT) 50ng, IOmM dNTP mix 1 μ 1，用 DEPC 处理 水补足至10 μ 1，混勻后，短暂离心将之收集于管底，置于65°C加热5min，冰浴lOmin，加入 反应混合物 9 μ 1(5 X reaction buffer 4 μ l,25mM MgCl2 4μ 1,0. IM DTT2 μ 1，RNA 酶抑制 剂1 μ 1)，将上述混合物混勻，短暂离心将之收集于管底，25°C保温2min，加入1 μ 1 M-MuLV Reverse Transcriptase,将上述混合物混勻，短暂离心将之收集于管底，25°C保温20min， 然后42°C保温70min，合成cDNA。以cDNA为模板，用adh基因上下游特异性引物进行PCR， 扩增得到ADH的全长cDNA约1. Ikb (图2A)。回收并纯化ADH的cDNA全长片段，并将其连 接到pMD-18T (大连宝生物公司)载体上(图2B)，转化大肠杆菌感受态DH5 α (天根生化 科技)，采用碱裂解法提取质粒DNA，经1 %琼脂糖凝胶电泳，选取大小和理论值相符的重组 质粒做进一步的PCR检测和酶切检测。根据阳性重组质粒pMD-ADH载体两端的多克隆位 点，用EcoRI单酶切重组质粒，经琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，连接成功的重组质粒 pMD-ADH酶切产物理论上为3. 9kb左右的条带(图1C)。以重组质粒为模板，用引物ADH5 和ADH3扩增得至Ij 1. Ikb的PCR产物(图1D)。
实施例2 原核表达载体pET32a_ADH的构建pET32a-ADH 的构建策略如图 3 所示,用 NcoI (Fermentas)禾口 EcoR I (Fermentas) 切开纯化的原核表达质粒载体pET32a(购自Novagen公司)和pMD18_ADH，通过琼脂糖 凝胶电泳分离已切开的载体和插入片段，从凝胶中回收pET32a被切割后产生的载体片断 pET32a(5. 9kb)及pMD18_ADH被切割产生的ADH基因的DNA片断(1. Ikb)，然后用宝生物 (TaKaRa)的连接酶试剂盒连接pET32a载体片段和ADH基因的DNA片断产生原核表达载体 pET32a-ADH用连接反应混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5a，天根生 化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有氨苄霉素(Amp，100yg/ml)的平板上，于37°C过 夜培养，筛选Amp抗性重组子菌落，从Amp抗性重组子菌落中提取质粒(图4A)，用Xho I、 BamH I (Fermentas)进行双酶切检测，因为Xho I在载体上有单一酶切位点，而BamH I在 ADH基因片段上有单一酶切位点，所以双酶切产生两条带，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电 泳图上产生两条带，分子量小的一条为1. Okb,另一条为6. Okb (图4B)。选出连接成功的 质粒载体pET32a-ADH，转化大肠杆菌DH5 α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒 pET32a-ADH。实施例3 重组ADH蛋白的表达与表达条件的优化用原核表达载体pET32a_ADH转化大肠杆菌BL21的感受态细胞(DH5 α，天根生化 科技)。挑取单菌落加入2mL LB (含有Amp 100mg/L)中，37°C过夜培养(0D_值约为1. 5)。 加0. 5和1. OmM的IPTG于25°C诱导0_6小时后，离心收集菌体，去掉上清液，加入0. Iml SDS-PAGE上样缓冲液(Sample loading buffer)，于95°C加热10分钟煮沸菌体。冰浴冷却 后于4°C离心(12000rpm)10分钟，取上清作SDS-PAGE。根据文献资料和软件分析预测目的 蛋白大小为60kDa左右，采用12%分离胶。SDS-PAGE电泳参看《分子克隆实验指南(第三 版)》。SDS-PAGE电泳结果(图5)表明用1. OmM的IPTG于37°C诱导4小时后ADH蛋白表 达量最闻。 实施例4 重组ADH蛋白的纯化用原核表达载体pET32a_ADH转化大肠杆菌BL21的感受态细胞，挑取单菌落入 500mL LB(含有 Amp 100mg/L)中，25°C 培养至 0D600 值约为 0. 6 时，加 1. Ommol/LIPTG 诱 导后4小时，离心收集菌体，用wash buffer (IOmM Tris-Cl, ρΗ7· 5)洗2次，加入30ml蛋 白抽提缓冲液(磷酸钠缓冲液(pH7.4)20mmol/L)，悬浮菌体。于冰浴上超声波破碎细菌细 胞(工作3秒，间歇9秒，功率30W，全程30分钟)。于4°C离心(6000g) 30分钟，得到上清 和沉淀，沉淀用8M尿素(IOml)溶解。取适量上清和沉淀蛋白样品加入适量上样缓冲液作 SDS-PAGE，结果说明所表达的ADH重组蛋白90%出现在包涵体蛋白部分(图6A)，出现在上 清液中的ADH重组蛋白极少(图6A)。沉淀用8M尿素(IOml)溶解，加入适量上样缓冲液， 用12%的分离胶跑SDS-PAGE，然后用0. 25M KCl于4°C染色30分钟，割出ADH蛋白条带，放 入透析袋，加入2ml SDS-PAGE buffer，进行水平电泳4_5小时或过夜，将ADH蛋白从凝胶中 洗脱出来，可获得纯度达85%以上的ADH蛋白样品(图6B)。最后在1 XPBS溶液中透析过 夜后可作为抗原用于ADH抗体的制备。通过上述的实验，本发明达到了如下的结果利用本发明的原核表达载体 pET32a-ADH转化大肠杆菌(BL21)，实现了 ADH蛋白的高水平表达，表达的ADH蛋白90%以 上形成包涵体，用高浓度的尿素溶解包涵体后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离ADH蛋白，再从凝胶中回收ADH蛋白可得到纯度极高的ADH蛋白，可作为抗原用于ADH抗体的制备。ADH 重组蛋白表达量很高，因此不需要大规模培养细菌，纯化ADH蛋白的操作相当简单，成本也 很低，极易重复使用。
权利要求
ADH的原核表达载体pET32a ADH，该载体含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点和ADH基因及一个组氨酸标签。
2.如权利要求1所述的原核表达载体，上述载体中的ADH基因来源于拟南芥，在 GenBank中的登录号为ATU63931。
3.如权利要求1所述的原核表达载体，所述ADH基因的上游有T7启动子和细菌核糖体 结合位点RBS，T7启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，紧靠ADH基因的起始密码 子上游还有一个组氨酸标签序列。
4.如权利要求1所述的原核表达载体，由下述方法构建而得(1)从GenBank中查找拟南芥ADH的全长基因序列，并设计序列如下的一对引物ADH5 :5’ -CACCATGGCGACTCAAGGTCAGGTTATC-3‘ADH3 :5’ -GAATTCTCATTTGCTGGTATCGAGG-3’5’端引物含有CACCATGG特征序列，并由此形成Nco I酶切位点；3’端引物添加EcoR I酶切位点GAATTC。以拟南芥第一链cDNA为模版扩增，得到ADH基因的全长cDNA。(2)回收并纯化ADH全长基因片段，并将其连接到pMDlS-Τ载体上，采用碱裂解法提取 质粒DNA，通过酶切检测获得重组质粒pMD-ADH ；(3)构建原核载体pET32a-ADH，用NcoI和EcoRI双酶切pMD_ADH和pET32a，并回收纯 化ADH基因片段以及载体片段pET32a，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR扩增检测和酶切 检测，获得原核表达载体pET32a-ADH。
5.权利要求1所述的原核表达载体的制备方法，包括下列步骤(1)从GenBank中查找拟南芥ADH的全长基因序列，并设计序列如下的一对引物ADH5 :5’ -CACCATGGCGACTCAAGGTCAGGTTATC-3‘ADH3 :5’ -GAATTCTCATTTGCTGGTATCGAGG-3’5’端引物有CCATGG特征序列，并由此形成Nco I酶切位点；下游引物3’端添加EcoRI 酶切位点GAATTC0以拟南芥第一链cDNA为模版扩增，得到ADH基因的全长cDNA。(2)回收并纯化ADH全长基因片段，并将其连接到pMDlS-Τ载体上，采用碱裂解法提取 质粒DNA，通过酶切检测获得重组质粒pMD-ADH ；(3)构建原核载体pET32a-ADH，用NcoI和EcoRI双酶切pMD-ADH和pET32a，并回收纯 化ADH基因片段以及载体片段pET32a，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR扩增检测和酶切 检测，获得原核表达载体pET32a-ADH。
6.权利要求1的原核表达载体在制备ADH包涵体蛋白中的应用。
7.权利要求1的原核表达载体在制备ADH特异性抗体的抗原中的应用。
8.应用权利要求1-4所述原核表达载体制备ADH特异性抗体抗原的方法，将上述载体 用热刺激法导入大肠杆菌蛋白表达专用受体菌株BL21中，获得转化子菌落，用ImM IPTG于 37°C诱导4小时后获ADH重组蛋白，90%重组蛋白形成包涵体，用高浓度的尿素溶解包涵体 后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离ADH蛋白，再从凝胶中回收ADH蛋白可得到纯度极高的 ADH重组蛋白，可作为抗原用于ADH特异性抗体的制备。
全文摘要
本发明公开了一种高效表达拟南芥谷胱甘肽依赖型甲醛脱氢酶蛋白的原核表达载体pET32a-ADH。该载体是含有拟南芥谷胱甘肽依赖型甲醛脱氢酶基因(ADH)的原核表达载体。本发明从拟南芥中克隆出ADH基因，用T7启动子控制它在大肠杆菌中的表达，表达的重组蛋白质90％以上形成包涵体，从包涵体中很容易纯化高纯度的重组蛋白质，可作为抗原用于ADH抗体的制备。
文档编号C12N15/53GK101928720SQ20101017209
公开日2010年12月29日 申请日期2010年5月14日 优先权日2010年5月14日
发明者严金平, 宋中邦, 张婧, 陈丽梅 申请人:昆明理工大学