专利名称：大肠杆菌s-甲酰谷胱甘肽水解酶的原核表达载体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种高效表达大肠杆菌S-甲酰谷胱 甘肽水解酶蛋白(FGH)的原核表达载体pET3h-FGH及其在FGH蛋白的原核表达和FGH包 涵体蛋白制备中的应用。
背景技术：
甲醛是一种无色，有强烈刺激气味的气体，易溶于水、醇和醚，被广泛用于工业生 产中，是胶粘剂工业应用最广泛的化学原材料。随着经济的发展和人民生活水平的提高， 各种原料制成的建筑装饰材料已走入各种室内公共场所和家庭，使甲醛成为室内空气污染 公认最具代表性的化学物质。室内空气中游离甲醛浓度在中国规定的允许值是0.08(mg/ 立方米)，对新装修住宅的调查结果表明室内空气中甲醛浓度是室外空气的6. 65倍，为 0. 49aiig/m3，在门窗关闭时甲醛浓度超标100倍。甲醛为较高毒性物质，它反应能力极强，能与蛋白质，核酸和脂类产生非特异性的 反应，是一种非常活泼的化合物，因此对所有的生物来说都有很高的毒性，长期接触低剂量 甲醛可引起慢性呼吸道疾病，引起鼻烟癌、结肠癌、脑瘤、月经紊乱、细胞核的基因突变，DNA 单链内交连和DNA与蛋白质交连及抑制DNA损伤的修复、妊娠综合症、引起新生儿染色体异 常、白血病，这就是所谓的装修综合病(sick-house)。相对于油漆中的苯、甲苯、二甲苯、游离甲苯二异氰酸酯(TDI)、挥发性有机化合物 (VOC)等有害物质来说，甲醛具有潜伏周期长(3-15年)、隐藏深、分布广、易挥发、治理难、 危害大等特性。目前清除污染甲醛通常使用的方法有三种一是使用环保材料；二是开窗 通风；三是用植物或除污剂清除污染，使用除污剂有二次污染的可能。用室内栽培植物清除 甲醛污染，是最自然、最环保的方式，科学研究证明确实有些植物能够吸收分解甲醛，但吸 收能力和速度非常有限(Giese 等，1994，Plant Physiol. 104 :1301-1309)。为了防止甲醛对生物体致死和突变的影响，生物体已经进化了一些修复机制。甲 醛的脱毒可以通过甲醛歧化酶、甲酸甲酯合成酶、或谷胱甘肽依赖型甲醛脱氢酶来实现。谷胱甘肽依赖性甲醛脱氢酶修复系统广泛存在于很多原核生物和真核生物中 (Gonzalez 等，The Journal of Biological Chemistry，2006，281 :14514-14522)。在 依赖谷胱甘肽的甲醛代谢途径中，HCHO首先和谷光甘肽(GSH)形成加合物-羟甲基谷 光甘肽(HM-GSH)，然后由谷光甘肽依赖型的甲醛脱氢酶(FADLH)催化形成甲酰基谷光甘 肽(Formyl-GSH)，再被S-甲酰谷胱甘肽水解酶(FGH)水解为HC00H，HC00H最后被甲酸 脱氢酶(FDH)氧化为 CO2 和 H20(Hanson and Roje, Annu. Rev. PlantPhysiol. Plant Mol. Biol. 2001,52 :119-37)。在大肠杆菌中frmA和frmB分别编码S-羟甲基谷胱甘肽脱氢酶和S-甲酰谷胱 甘肽水解酶，FrmA和FrmB的表达受甲醛的诱导，且它们的表达比非诱导的细胞高20-100 倍，这两个蛋白质都与体内甲醛的脱毒有关(Gonzalez等，Hie Journal ofBiologicalChemistry, 2006, 281 14514-14522)。S-甲酰谷胱甘肽是甲醛在谷胱甘肽依赖脱毒途径 中的一个中间产物，S-甲酰谷胱甘肽水解酶对S-甲酰谷胱甘肽具有很高的水解酶活性。 大肠杆菌有两个具有活性的S-甲酰谷胱甘肽水解酶，他们是诱导型FrmB和组成型kiG。 这两种酶是异位的丝氨酸水解酶，具有水解S-甲酰谷胱甘肽的能力。由于FrmB编码的 FGH对S-甲酰谷胱甘肽的水解酶活性很高(比^iG编码的FGH高5倍)，所以在大肠杆 菌中这种蛋白质有可能是主要的S-甲酰谷胱甘肽水解酶(Gonzalez等，The Journal of BiologicalChemistry，2006，281 :14514-14522)。这说明 FrmB 编码的 FGH 是甲酸脱毒谷 胱甘肽依赖途径的一个关键酶，这个酶可能也存在于很多植物谷胱甘肽依赖甲醛代谢途径 中，因此这个酶的过量表达可以用于提高植物吸收和代谢甲醛能力的遗传操作。FGH蛋白特 异性抗体是检测植物中FGH蛋白表达水平的有效工具。但现有研究还未有制备FGH抗体的 报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种FGH的原核表达载体(pET3h_FGH)，该载体含有T7启动 子和终止子、细菌核糖体结合位点和FGH基因及一个组氨酸标签，利用该载体转化大肠杆 菌(BL21)，可实现FGH蛋白的高水平表达，表达的FGH蛋白60%以上形成包涵体，用高浓度 的尿素溶解包涵体后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离FGH蛋白，再从凝胶中回收FGH蛋白可 得到纯度极高的FGH蛋白，可作为抗原用于FGH抗体的制备。FGH重组蛋白表达量很高，因 此不需要大规模培养细菌，纯化FGH蛋白的操作相当简单，成本也很低，极易重复使用。为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案FGH的原核表达载体pET3h-FGH，含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点 RBS和FGH基因及一个组氨酸标签。上述的原核表达载体，其中所述的S-甲酰谷胱甘肽水解酶基因FGH来源于大肠杆 菌，其GenBank登录号为CP000802。上述的原核表达载体，FGH基因的上游有T7启动子和细菌核糖体结合位点RBS，T7 启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，紧靠FGH基因的起始密码子上游还有一个组 氨酸标签序列。所述的原核表达载体由下述方法构建而得(1)从GenBank中查找大肠杆菌FGH的全长基因序列，并设计序列如下的一对引 物FGH5 :5， -CCATGGAACTCATTGAAAAACATG-3，FGH3 :5’ -CTCGAGTCAACGCATATTCAGTTTATTG-3’5’端引物有CCATG特征序列，并由此形成Nco I酶切位点；3’端加CTCGAG特征序 列，形成Β ο I酶切位点。Whcherichia coli的基因组为模版扩增，得到FGH的全长DNA 序列；(2)回收并纯化FGH全长基因片段，并将其连接到pMDlS-Τ载体上，采用碱裂解法 提取质粒DNA，通过酶切检测获得重组质粒pMD-FGH ；(3)构建原核载体pET32a-FGH，用NcoI和XhoI双酶切pMD-FGH和pET32a，并回收 纯化FGH基因片段以及载体片段pET3h，然后连接、转化、抽提质粒进行单、双酶切检测，获
4得原核表达载体pET3h-FGH。本发明的原核表达载体的构建方法，包括下述步骤(1)从GenBank中查找大肠杆菌FGH的全长基因序列，并设计序列如下的一对引 物FGH5 :5， -CCATGGAACTCATTGAAAAACATG-3，FGH3 :5’ -CTCGAGTCAACGCATATTCAGTTTATTG-3’5’端引物有CCATG特征序列，并由此形成Nco I酶切位点；3’端加CTCGAG特征序 列，形成》ιο I酶切位点。以hcherichia coli的基因组模版扩增，得到FGH的全长DNA 序列；(2)回收并纯化FGH全长基因片段，并将其连接到pMD18_T载体上，采用碱裂解法 提取质粒DNA，通过酶切检测获得重组质粒pMD-FGH ；(3)构建原核载体pET32a_FGH，用NcoI和XhoI双酶切pMD-FGH和pET32a，并回收 纯化FGH基因片段以及载体片段pET3h，然后连接、转化、抽提质粒进行单、双酶切检测，获 得原核表达载体pET3h-FGH。原核表达载体在制备FGH包涵体蛋白中的应用。原核表达载体在制备FGH特异性抗体的抗原中的应用。用原核表达载体制备FGH特异性抗体抗原的方法，将上述载体用热刺激法导入大 肠杆菌蛋白表达专用受体菌株BL21中，获得转化子菌落，用ImM IPTG于37°C诱导4小时后 获FGH重组蛋白，60 %重组蛋白形成包涵体，用高浓度的尿素溶解包涵体后，通过聚丙烯酰 胺凝胶电泳分离FGH蛋白，再从凝胶中回收FGH蛋白可得到纯度极高的FGH重组蛋白，可作 为抗原用于FGH特异性抗体的制备，为FGH特异性抗体抗原的制备提供一条新途径。
图1、大肠杆菌基因组DNA的检测。其中M =DNA marker III ；1-3 基因组DNA。图2、FGH基因的TA克隆策略。图3A重组质粒pMD18-FGH的电泳检测.M :DNA marker III ； 1-11 重组质粒 PMD18-FGH ;12 正对照(分子量为3. 5kb的质粒DNA)。图3B重组质粒pMD18-FGH的单酶切检测.M :DNA marker III ； 1-4 用XhoI单酶 切的PMD18-FGH ；5 没有酶切的质粒pMD18_FGH。图 3C 重组质粒 pMD18-FGH 的 PCR 检验。M :DNA marker III ； 1-2 以 pMD18_FGH 为 模版用FGH5和FGH3引物扩增的PCR产物；5 负对照。其中图3A、图;3B和图3C都是FGH基因TA克隆质粒的检测。图4、FGH基因的原核表达载体构建策略。图5A重组质粒pET3h-FGH的电泳检测。1_12 重组质粒pET3h_FGH ;13 正对照 (分子量为6. 7kb的质粒DNA)。图 5B 重组质粒 pET32a-FGH 的双酶切检测。M :DNA marker III ；1-4:用 Xho I+Kpn I双酶切的pET3h-FGH ；5 没有酶切的质粒pET3h_FGH。其中图5A和图5B表示FGH基因原核表达载体的检测。图6、FGH重组蛋白表达条件的优化。
图7 (A)可溶性和不溶性FGH重组蛋白的分布。图7 (B)可溶性和不溶性FGH重组蛋白的纯化。
具体实施例方式试剂与仪器试剂主要分为分子生物学实验试剂。各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、dNTP等 为日本宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自博大泰克生物技术有限公 司，其余试剂均为国产分析纯。仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。所有引物序列均在上海生工合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常 规方法。实施例1 大肠杆菌(Escherichia coli)基因组DNA的制备与检测本发明所用的大肠杆菌(Escherichia coli)为DH5 α (购自北京天根生化科技公 司)，大肠杆菌基因组DNA的制备采用普通细菌基因组提取方法。取2mL过夜培养菌液于 4°C 4000rpm离心2min，弃尽上清液，收集菌体；加入100μ 1 Solution I悬菌；30 μ 1 10% SDS, 1 μ 1 20mg/mL蛋白酶K，混勻，37°C孵育1小时；加入100μ 15mol/L NaCl，混勻；加入 20 μ 1 CTAB/NaCl 溶液(CTAB 10%, NaCl 0. 7mol/L)，混勻，65°C，10 分钟；加入等体积酚 / 氯仿/异戊醇混合液(酚/氯仿/异戊醇25 24 1)混勻；离心12000rpm，5分钟；取上 清，加入2倍体积无水乙醇，0. 1倍体积3mol/LNa0AC，_20°C放置30分钟；离心12000rpm， 10分钟；沉淀加入70%乙醇洗涤；沉淀干燥后，溶于20 μ 1 TE，-20°C保存。取2μ 1基因组 DNA用的琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果(图1)说明提取到的基因组DNA质量符合要 求。实施例2 =FGH基因的扩增与TA克隆FGH基因的扩增及TA克隆的策略如图2所示，首选从GenBank中查找FGH的全长 基因序列(FGH基因的GenBank登录号为CP000802)，并设计一对特异引物，序列如下FGH5 CCATGGAACTCATTGAAAAACATGFGH3 CTCGAGTCAACGCATATTCAGTTTATTG5’端引物有CCATG特征序列，并由此形成Nco I酶切位点；3’端加CTCGAG特征序 列，形成Bio I酶切位点。在PCR反应混合液中加入IOng的大肠杆菌基因组DNA作为模板，同时加入50ng的 特异性引物 FGH5 和 FGH3、1. 8 μ IdNTP (IOmM)，2. 5 μ 1 的 ExTaq 反应 Buffer 和 0. 15 μ 1 的 ExTaq (5U/ μ 1)聚合酶(大连宝生物公司)，加双蒸水使反应终体积为20 μ 1。在PCR仪上 于94°C加热3分钟，然后按照94°C、45秒，53°C、30秒，72°C、1分钟的程序进行30个循环的 反应，最后在72°C延长反应10分钟的程序进行PCR反应扩增得到FGH基因。反应完成后， 通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物。回收并纯化FGH全长基因DNA(0. 81Λ)，然后用宝 生物(TaKaRa)的TA克隆试剂盒亚克隆到pMD18_T (大连宝生物公司)载体上，实验操作按 试剂盒的说明书进行，反应过夜后用反应混合液转化大肠杆菌感受态DH5 α (购自天根生 化科技公司)，采用碱裂解法提取质粒DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测其大小(图3Α)，选 取大小和理论值相符的重组质粒进行酶切检测。用BioI单酶切重组质粒，用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，连接成功的重组质粒pMD-FDH有一条大小为3. 5kb左右的FDH基因 DNA片段(图:3B)。选取酶切检测正确的重组质粒pMD18-FGH做进一步的PCR检测，用FGH 基因上下游特异性引物FGH5和FGH3作PCR，亚克隆成功的重组质粒均能扩增出0. 81Λ左右 的FGH基因DNA片段(图3C)，测序分析证明重组质粒载体中插入的FGH全长基因序列正 确。再次确认是连接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5 α，挑单个菌落进行液体培养，用 试剂盒纯化质粒PMD18-FGH。实施例3 原核表达载体pET3h_FGH的构建pET32a-FGH 的构建策略如图 4 所示，用 NcoI (Fermentas)和 XhoI (Fermentas) 切开纯化的原核表达质粒载体pET3h(购自Novagen公司)和pMD18_FGH，通过琼脂糖 凝胶电泳分离已切开的载体和插入片段，从凝胶中回收PET3M被切割后产生的载体片断 pET32a(5. 9kb)及pMD18_FGH被切割产生的FGH基因的DNA片断(0. 81Λ)，然后用宝生物 (TaKaRa)的连接酶试剂盒连接pET3h载体片段和FGH基因的DNA片断产生原核表达载 体pET3h-FGH。用连接反应混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5a，天根 生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有氨苄霉素(Amp，100yg/ml)的平板上，于37°C 过夜培养，筛选Amp抗性重组子菌落，从Amp抗性重组子菌落中提取质粒(图5A)，用)(h0 I、KpnI (Fermentas)进行双酶切检测，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上产生5. 9kb 和862bp左右大小的两条带(因为Bio I和在FGH基因处有单一识别位点，而Kpn I在 pET-32a(+)载体有单一识别位点，故双酶切质粒应有两个片段)(图5B)。将连接成功的质 粒载体pET3h-FGH重新转化大肠杆菌DH5 α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质 粒 pET3h-FGH.实施例4 重组FGH蛋白的表达与表达条件的优化用原核表达载体pET3h_FGH转化大肠杆菌BL21的感受态细胞(天根生化科技)。 挑取单菌落加入2mL LB (含有Amp 50mg/L)中，37°C过夜培养(OD6tltl值约为1. 5)。加0. 5mM 和1. OmM的IPTG于37°C诱导0-8小时后，离心收集菌体，去掉上清液，加入5XSDS-PAGE 上样缓冲液(Sample loading buffer)，于95°C加热10分钟煮沸菌体。冰浴冷却后于4°C 离心(12000rpm)10分钟，取上清作SDS-PAGE。根据文献资料和软件分析预测目的蛋白大 小为48kDa左右，采用12%分离胶。SDS-PAGE电泳参看《分子克隆实验指南(第三版)》。 SDS-PAGE电泳结果(图6)表明用用0. 5mM的IPTG诱导4小时后FGH蛋白表达量最高，占 总蛋白的70% (图6)。实施例5 重组TOH蛋白的纯化用原核表达载体pET3h-FGH转化大肠杆菌BL21的感受态细胞，挑取单菌落入 IOOOmL LB (含有 Amp 100mg/L)中，37°C 培养至 0D600 值约为 0. 6。加 0. 5mmol/LIPTG 诱 导后4小时，离心收集菌体，用wash buffer (IOmM Tris-Cl, ρΗ7· 5)洗2次，加入30ml蛋 白抽提缓冲液(磷酸钠缓冲液(pH7.4)20mmol/L)，悬浮菌体。于冰浴中超声波破碎细菌细 胞(工作3秒，间歇9秒，功率30W，全程30分钟)。于4°C离心(6000g) 30分钟，得到上清 和沉淀。取适量上清和沉淀蛋白样品加入适量上样缓冲液作SDS-PAGE，结果说明所表达的 FGH重组蛋白有60%出现在包涵体蛋白部分(图7A)，出现在上清液中的FGH重组蛋白为 40% (图7A)。沉淀用8M尿素(IOml)溶解，加入适量上样缓冲液，用12%的分离胶跑12% SDS-PAGE，然后用0. 25MKC1于4°C染色30分钟，割出FGH蛋白条带，放入透析袋，加入2mlSDS-PAGE buffer,进行水平电泳4_5小时或过夜，将FGH蛋白从凝胶中洗脱出来，可获得纯 度达95%以上的FGH蛋白样品(图7B)，最后在1 XPBS溶液中透析过夜后可作为抗原用于 FGH抗体的制备。 通过上述的实验，本发明达到了如下的结果利用本发明的FGH的原核表达载体 (pET32a-FGH)转化大肠杆菌(BL21)，可实现FGH蛋白的高水平表达，表达的FGH蛋白60% 以上形成包涵体，用高浓度的尿素溶解包涵体后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离FGH蛋白， 再从凝胶中回收FGH蛋白可得到纯度极高的FGH蛋白，可作为抗原用于FGH抗体的制备。 FGH重组蛋白表达量很高，因此不需要大规模培养细菌，纯化FGH蛋白的操作相当简单，成 本也很低，极易重复使用。
权利要求
1.FGH的原核表达载体pET3h-FGH，含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点RBS 和FGH基因及一个组氨酸标签。
2.如权利要求1所述的原核表达载体，其中所述的S-甲酰谷胱甘肽水解酶基因FGH来 源于大肠杆菌，其GenBank登录号为CP000802。
3.如权利要求1所述的原核表达载体，FGH基因的上游有T7启动子和细菌核糖体结合 位点RBS，T7启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，紧靠FGH基因的起始密码子上 游还有一个组氨酸标签序列。
4.权利要求1的原核表达载体，由下述方法构建而得(1)从GenBank中查找大肠杆菌FGH的全长基因序列，并设计序列如下的一对特异引物FGH5 :5’ -CCATGGAACTCATTGAAAAACATG-3’FGH3 :5’ -CTCGAGTCAACGCATATTCAGTTTATTG-3’5’端引物有CCATG特征序列，并由此形成Nco I酶切位点；3’端加CTCGAG特征序列， 形成Β ο I酶切位点。Whcherichia coli的基因组为模版扩增，得到FGH的全长DNA序 列；(2)回收并纯化FGH全长基因片段，并将其连接到pMDlS-Τ载体上，采用碱裂解法提取 质粒DNA，通过酶切检测获得重组质粒pMD-FGH ；(3)构建原核载体pET3h-FGH，用NcoI和XhoI双酶切pMD_FGH和pET32a，并回收纯 化FGH基因片段以及载体片段pET3h，然后连接、转化、抽提质粒进行单、双酶切检测，获得 原核表达载体pET3h-FGH。
5.权利要求1的原核表达载体的构建方法，包括下述步骤(1)从GenBank中查找大肠杆菌FGH的全长基因序列，并设计序列如下的一对引物FGH5 :5’ -CCATGGAACTCATTGAAAAACATG-3’FGH3 :5’ -CTCGAGTCAACGCATATTCAGTTTATTG-3’5’端引物有CCATG特征序列，并由此形成Nco I酶切位点；3’端加CTCGAG特征序列，形 成Xho I酶切位点。以Escherichia coli的基因组模版扩增，得到FGH的全长DNA序列；(2)回收并纯化FGH全长基因片段，并将其连接到pMDlS-Τ载体上，采用碱裂解法提取 质粒DNA，通过酶切检测获得重组质粒pMD-FGH ；(3)构建原核载体pET3h-FGH，用NcoI和XhoI双酶切pMD-FGH和pET32a，并回收纯 化FGH基因片段以及载体片段pET3h，然后连接、转化、抽提质粒进行单、双酶切检测，获得 原核表达载体pET3h-FGH。
6.权利要求1的原核表达载体在制备FGH包涵体蛋白中的应用。
7.权利要求1的原核表达载体在制备FGH特异性抗体的抗原中的应用。
8.应用权利要求1-4所述原核表达载体制备FGH特异性抗体抗原的方法，将上述载体 用热刺激法导入大肠杆菌蛋白表达专用受体菌株BL21中，获得转化子菌落，用ImM IPTG于 37°C诱导4小时后获FGH重组蛋白，60%重组蛋白形成包涵体，用高浓度的尿素溶解包涵体 后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离FGH蛋白，再从凝胶中回收FGH蛋白可得到纯度极高的 FGH重组蛋白，可作为抗原用于FGH特异性抗体的制备。
全文摘要
本发明公开了一种高效表达大肠杆菌S-甲酰谷胱甘肽水解酶蛋白的原核表达载体pET32a-FGH。该载体是含有大肠杆菌S-甲酰谷胱甘肽水解酶基因(FGH)的原核表达载体。本发明从大肠杆菌中克隆出FGH基因，用T7启动子控制它在大肠杆菌中的表达，表达的重组蛋白质60％以上形成包涵体，从包涵体中很容易纯化高纯度的重组蛋白质，可作为抗原用于FGH抗体的制备。
文档编号C12N15/70GK102134575SQ201010172010
公开日2011年7月27日 申请日期2010年5月14日 优先权日2010年5月14日
发明者张婧, 罗义勇, 陈丽梅 申请人:昆明理工大学