具有l-色氨酸生产力的微生物以及使用所述微生物生产l-色氨酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及具有增强的L-色氨酸生产力的重组微生物以及使用所述微生物生产 L-色氨酸的方法。
【背景技术】
[0002] L-色氨酸，一种必需氨基酸，已广泛用作饲料和食品添加剂。L-色氨酸通常通过 使用棒状杆菌（Corynebacterium)属、芽抱杆菌（Bacillus)属或埃希氏菌（Escherichia) 属微生物及其变体发酵来生产。L-色氨酸由用于合成芳香族氨基酸的常见中间体分支酸生 物合成。具体地，L-色氨酸通过由色氨酸操纵子trpEDCBA合成的五种酶作用于分支酸来 生物合成，所述分支酸通过开始于磷酸烯醇丙酮酸和D-赤藓糖-4-磷酸的常见莽草酸途径 产生。首先，邻氨基苯甲酸合酶（TrpE-TrpD复合物）作用于分支酸以合成邻氨基苯甲酸， 然后邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶（TrpD)作用于邻氨基苯甲酸以合成N-(5'_磷酸核糖 基）_邻氨基苯甲酸。然后，磷酸核糖基邻氨基苯甲酸异构酶（TrpC)和吲哚-3-甘油磷酸 合酶（TrpC)作用于N-(5' -磷酸核糖基）-邻氨基苯甲酸以合成吲哚-3-甘油-磷酸，然 后色氨酸合酶（TrpB-TrpA复合物）作用于吲哚-3-甘油-磷酸以合成L-色氨酸（图1 ; Bonggaerts等，MetabEng，3, 289_3〇0, 2〇01)〇
[0003] 在大肠杆菌（E.coli)中，由trpE和trpD基因之复合物编码的蛋白质形成邻氨 基苯甲酸合酶以合成邻氨基苯甲酸。所合成的邻氨基苯甲酸与5-磷酸核糖基1-焦磷酸 (PRPP)通过由trpD基因编码的邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶反应，从而合成N-(5'_磷 酸核糖基）_邻氨基苯甲酸。
[0004] 在本文中，由trpD基因编码的蛋白质与由trpE基因编码的蛋白质组合充当邻氨 基苯甲酸合酶，或者单独充当邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶，并且野生型大肠杆菌菌株 保持这两种作用的平衡。
[0005] 在野生型大肠杆菌菌株中，用作细胞内色氨酸生物合成中的辅因子的PRPP的浓 度为约180yM(Bennett等，NatChemBiol，5, 595-599, 2009)。在具有增强的邻氨基苯甲 酸生物合成的L-色氨酸生产菌株中，邻氨基苯甲酸的细胞外累积浓度为最大值，而PRPP的 细胞内浓度远低于邻氨基苯甲酸的浓度。低PRPP浓度充当N-(5' -磷酸核糖基）-邻氨基 苯甲酸生产中降低L-色氨酸的总合成速率并提高邻氨基苯甲酸的细胞内和细胞外累积的 限制因素。因此，使用对PRPP具有较高亲和力的邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶使得可防 止邻氨基苯甲酸的细胞内和细胞外累积并且提高L-色氨酸的生物合成速率。
[0006] 在先前关于L-色氨酸生产菌株改良的报道中，增强生物合成途径并保持邻氨基 苯甲酸合酶和邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶活性之平衡的技术尚未被报道。
[0007]根据研究，大肠杆菌对PRPP的KJ直为50,而酵母对PRPP的KJ直为约 22. 4±2. 6(Hommel等，EurJBiochem，180,33-40，1989)。因此，酵母邻氨基苯甲酸磷酸核 糖基转移酶对PRPP的亲和力高于大肠杆菌邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶对PRPP的亲和 力。因此，预期使用酵母邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶将对防止邻氨基苯甲酸的细胞内 和细胞外累积以及使具有增强L-色氨酸生物合成途径之微生物中的L-色氨酸生物合成提 高产生更大的作用。
[0008] 在试图增强大肠杆菌中的分支酸生物合成途径和trp操纵子途径以生产大量的 工业可用L-色氨酸期间，本发明人发现，随着以上两种途径增强，邻氨基苯甲酸在细胞内 和细胞外累积，并因此出现异常培养物。因此，出于以下期望，本发明人继续进行研究：增强 具有增强L-色氨酸生物合成途径的微生物中邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的表达可以 防止邻氨基苯甲酸的细胞内和细胞外累积并且提高L-色氨酸的生物合成，从而实现本发 明。
【发明内容】
[0009]技术问题
[0010] 因此，本发明的一个目的是提供具有增强的L-色氨酸生产力的微生物，其已被修 饰成表达酵母邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶（trp4)。
[0011] 本发明的另一个目的是提供使用上述微生物生产L-色氨酸的方法。
[0012] 技术方案
[0013] 为了实现上述目的，本发明提供了具有增强的L-色氨酸生产力的埃希氏菌属微 生物，其已被修饰成表达酵母邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶。
[0014] 本发明还提供了用于生产L-色氨酸的方法，所述方法包括以下步骤：培养埃希氏 菌属微生物；以及从培养物中回收L-色氨酸。
[0015] 有益效果
[0016] 根据本发明的微生物可以以高产率生产L-色氨酸，并因此可以有利地用于制药 工业和饲料工业，特别地用于动物饲料领域。
【附图说明】
[0017] 图1是示出了大肠杆菌中L-色氨酸生物合成途径及参与其中的蛋白质的示意图。
[0018] 图2示出了酵母邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的氨基酸序列同源性。
[0019]图 3 示出了pCL-PCJ1_trpD和pCL-PCJ1_trp4 载体。
[0020] 图4示出了L-色氨酸生产母本菌株与经载体pCL-PtyftrpD或pCL-PQ1-trp4转化 的菌株在发酵40小时时的L-色氨酸生产力的比较。
[0021 ] 图5示出了L-色氨酸生产母本菌株与经载体pCL-PtyftrpD或pCL-PQ1-trp4转化 的菌株在发酵后的色氨酸前体邻氨基苯甲酸累积的比较。
[0022] 图6示出了L-色氨酸生产母本菌株与在基因组中插入trp4基因表达盒的菌株在 发酵40小时时的L-色氨酸生产力的比较。
[0023] 图7示出了L-色氨酸生产母本菌株与在基因组中插入trp4基因表达盒的菌株在 发酵后的邻氨基苯甲酸累积的比较。
【具体实施方式】
[0024] 下文中，将详细地描述本发明。
[0025] 本发明提供了具有增强的L-色氨酸生产力的埃希氏菌属微生物，其已被修饰成 表达酵母邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶。
[0026] 邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶是使用邻氨基苯甲酸和PRPP合成磷酸核糖基邻 氨基苯甲酸的酶。在具有增强的L-色氨酸生产力的菌株中，分支酸合成通过增强的莽草酸 途径提高，导致邻氨基苯甲酸提高。提高的邻氨基苯甲酸在细胞内和细胞外累积，干扰细胞 的正常生理学活性，从而抑制L-色氨酸生产。
[0027] 因此，本发明旨在通过增强邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的表达来防止邻氨基 苯甲酸的细胞内和细胞外累积，从而增强L-色氨酸的生物合成。
[0028] 本文中，本发明旨在通过使用酵母邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶进一步提高磷 酸核糖基邻氨基苯甲酸的合成速率，与由大肠杆菌的trpD基因编码的邻氨基苯甲酸磷酸 核糖基转移酶相比，所述酵母邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶对PRPP具有更高的亲和力。
[0029] 本发明中使用的邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶来自酵母，并且可以看出，来自 不同种酵母的邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶具有87%或更大的氨基酸序列同源性（图 2)。具体地，本发明中使用的邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶具有SEQIDN0 :1所示氨基 酸序列。然而，本发明中使用的邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶不限于此，原因是显示出邻 氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶活性的酶的氨基酸序列根据微生物的物种或菌株可不同。具 体地，本发明中使用的邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶可以是编码具有以下氨基酸序列的 多肽的突变或人工变体，所述氨基酸序列在SEQIDNO: 1的氨基酸序列的一个或更多个位 置处包含一个或数个氨基酸的替换、缺失、插入或添加，或者包含造成变为相似氨基酸的沉 默突变，只要可以保持或增强邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的活性即可。根据蛋白质三 维结构中氨基酸残基的类型或位置，本文中使用的术语"数个氨基酸"意指2至20个氨基 酸，优选2至10个氨基酸，并且更优选2至5个氨基酸。此外，基于具有酵母邻氨基苯甲酸 磷酸核糖基转移酶的微生物的个体差异和/或物种差异，氨基酸的替换、缺失、插入、添加 或倒位可包括天然突变体或人工变体。
[0030] 在本发明中，增强酵母邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶可通过用包含编码酵母邻 氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶之多核苷酸的载体转化或者通过将所述多核苷酸插入到染 色体中来实现。
[0031] 编码酵母邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的多核苷酸由SEQIDN0 :9表示。可将 所述多核苷酸转化到宿主细胞中，为此，可用宿主细胞偏好的密码子替换该多核苷酸，或者 可延长或消除其N端或C端，或者可修饰其起始密码子以控制表达水平。因此，本发明的多 核苷酸可具有编码与SEQIDN0 :1之氨基酸序列具有至少80%、具体为至少90%、更具体 为至少95%，特别具体为至少97%的同源性的蛋白质的多核苷酸序列，只要其可保持或增 强本发明变体的酵母邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的活性即可。最具体地，本发明的多 核苷酸可具有SEQIDN0 :9所示多核苷酸序列。
[0032] 本文中使用的术语"同源性"是指两个氨基酸序列之间的同一性。同源性可以使用 本领域技术人员公知的方法来确定，例如，计算诸如分数、同一性或相似性的参数的BLAST 2. 0〇
[0033] 此外，根据本发明的多核苷酸序列可以是编码酵母邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移 酶的变体，其可在严格条件下与SEQIDN0 :9的多核苷酸序列或来自所述多核苷酸序列的 探针杂交并且其正常起作用。
[0034] 本文中使用的术语"严格条件"意指允许多核苷酸之间的特异性杂交的条件。这 样的严格条件在M