专利名称：靶标物质的识别芯片、其检测方法和设备的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于灵敏地识别样品中的靶标物质的芯片、检测设备和检测方法。
背景技术：
近年来，随着对健康、环境和安全问题的愈加了解，需要用于检测在这些问题中涉及的生物或者化学痕量物质的技术。
但是，要检测的这种物质(以下称之为“靶标物质”)通常仅以微量存在于各种物质的复杂混合物中，并且仅能收集到有限量的包括这种靶标物质的样本。因此，靶标物质的检测和测量需要具有高度的灵敏性、准确性和可再现性。
另外，这种样本一般是从生物体获得的样本(以下称之为“样品”)，因此难以获得该样品。所以希望能利用较小量的样本进行检测。这种较小量样品的需要也是基于该样品在丢弃后会成为传染源这一事实，因为它是从生物体获得的样本。
就人体临床实验装置的应用而言，迫切需要减少在样品获取和检测结果输出之间的时间长短，也就是所谓的“周转时间”。
作为与这些需求相对应的技术，已经研发了通过利用具有用于陷获靶标物质的反应空间的微结构来提高反应效率的方法，所述微结构是微观的并且具有较大的单位体积表面积。
日本专利申请公开No.H03-223674披露了一种采用简单的方式在活体内测量痕量物质的反应容器，其中在流体流过的通道内形成的试剂固定部分和/或试剂连接部分是凹穴和/或小凸起团粒。
日本专利申请公开No.H09-196920中披露了一种体液组分分析仪器，其具有样本接收口、泵连接口、其中有用标记物质标记的样本的样本处理区、以及具有多孔材料的样本处理和光度测量区，在多孔材料中固定了其中一对特定的键。
国际申请No.2003-514221的国内公开中披露了一种微流体设备，其包括用于传送流体的微通道，其中该微通道包括固定在多孔聚合物上的特定键对构件(specific binding pair member)的空间分开限定的区域，在微通道内制成的珠粒或者微结构。
另一方面，现在已经提出了有别于传统方法的检测方法，以满足上述需求。具体的说，如下所述，检测方法利用了含有金属的微颗粒。含有金属元素的微颗粒具有对靠近微颗粒表面的介质中的轻微变化高度敏感的光学特性，可以灵敏地识别由于标记的痕量物质的存在导致的物理化学变化。
日本专利申请公开No.2000-356587中披露了一种局部等离子体共振传感器，它具有构成为有给定基板和在基板表面上固定的金属微颗粒的传感器单元，能在用光照射传感器单元时通过测量穿过金属微颗粒的光的吸收来检测靠近金属微颗粒的介质的折射率。
日本专利申请公开No.2002-365210披露了一种用于检测活体分子的方法，其特征在于，一种用于利用光学多层膜的光学性质来以光学方式检测分子吸收的装置，它由基板、贵金属薄层、绝缘微颗粒和贵金属微颗粒构成，该装置用于检测分子吸收，其中，当光学多层膜吸收分子时，光学多层膜的反射光谱的最大吸收波长偏移，但是，当浸渍有光学多层膜的液体的折射率变化时，反射光谱的最大吸收波长在每单位折射率为1000nm或者更小的水平上发生变化。
日本专利申请公开No.2003-268592中披露了一种结构，其特征在于，该结构包括阳极氧化的铝层，其具有基本垂直于层表面而形成的多个独立的孔，这些孔与相互分开的并且填充各独立的孔的金属颗粒成为一体，还具有传感器，其特征在于，在用光照射该结构时，传感器通过测量从结构中的金属颗粒反射或者透射到其中的光的吸收来检测靠近固定在基板上的金属颗粒的介质的折射率。
按照这种方式，已经研发了各种检测芯片和设备，以用来检测痕量靶标物质。但是很明显，必须在短时间内从少量样品中检测更微量的成分。另外，希望临床实验装置能够如上所述灵敏地检测痕量成分，并能够不需稀释样品而在高浓度下定量地测量成分。
发明内容
在为了解决上述问题而进行了大量的研究之后，本发明人作出了如下的发明。
根据本发明的一个方面，提供一种检测设备，其包括基板，包括其性质会因为与靶标物质接触而发生改变的多个物体；用于使得靶标物质与所述物体相接触的装置；以及用于根据在用光照射所述物体时产生的光输出来检测因为在靶标物质与所述物体相接触时所导致的物体性能的变化的装置，其中所述多个物体位于照射光行进的方向，并且该检测装置是一种用于根据在照射光时从多个物体输出的光的总和来检测性能变化的装置。
所述物体优选是含有金属元素的微颗粒。
该物体还优选包括用于在表面陷获靶标物质的陷阱，并且所述靶标物质被陷获在该陷阱中。
该检测装置优选采用荧光方法、电化学发光方法或者等离子体共振方法。
该设备优选还包括用于传送样品的通道。
根据本发明的另一方面，提供一种检测方法，其包括如下步骤提供一个基板，其包括其性质会因为与靶标物质接触而发生改变的多个物体；使得靶标物质与所述物体相接触；以及根据在用光照射所述物体时产生的光输出，检测在接触步骤中靶标物质与所述物体相接触时所导致的物体性能的变化，其中检测步骤包括根据从位于照射光行进方向上的多个物体输出的光的总和来进行检测。
根据本发明的再一个方面，提供一种检测芯片，其包括基板，其包括其性质会因为与靶标物质接触而发生改变的多个物体；以及用于使得靶标物质与所述物体相接触的装置，其中根据在用光照射所述物体时产生的光输出，检测因为在靶标物质与所述物体相接触时所导致的物体性能的变化，所述多个物体位于照射光行进的方向。
本发明利用每单位体积具有大表面积的微结构实现了由微观空间构成的反应区域。利用这种微结构，可以实现与并行设置微观的短反应通道的结构相同的效果，并在向反应区域运送流体时明不必显增加压力。另外，由于微结构中的孔隙窄，可以缩短扩散距离，缩短所需的反应时间。而且，由于具有固定在其上的含有金属元素的微颗粒的结构形成微结构，因此在光学检测过程中可以增加每单位投影面积的微颗粒数量，并可以提高灵敏度。另外，由于微结构每单位体积具有大表面积，因此每单位体积的微颗粒数量多。因此，即使靶标物质以高浓度存在，微颗粒也可以从整体识别靶标物质，这样可以检测宽的动态浓度范围。
图1A、1B和1C是显示利用中空结构的测量方法的一个实施方式；图2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G和2H显示了微结构；图3是显示本发明实施例1的检测设备的结构的视图；图4A、4B和4C是显示本发明实施例1的检测芯片的结构的视图；图5是显示利用本发明的靶标物质陷获芯片的设备的方框图；图6是显示本发明实施例2的检测设备的结构的视图；图7A、7B和7C是显示本发明实施例2的检测设备的结构的其它视图；图8是显示本发明实施例3的检测设备的结构的视图；
图9A、9B和9C分别是显示本发明实施例3的检测设备的结构的其它视图；图10是显示本发明实施例4的检测设备的结构的视图；图11是显示本发明实施例4的的检测设备的结构的另一个视图；图12A和12B是显示本发明实施例4的检测设备的结构的视图；以及图13A和13B是显示本发明实施例5的检测设备的结构的视图。
具体实施例方式
本发明涉及一种用于识别样品中的靶标物质的芯片，其特征在于，用于靶标物质的识别芯片包括微结构和至少位于该微结构的表面上的含有金属元素的微颗粒，当使样品与微颗粒相接触时识别靶标物质。另外，检测芯片优选其特征在于，微颗粒可以结合有用于陷获靶标物质的陷阱，当样品与微颗粒相接触时靶标物质被陷获在陷阱内并因此被识别，检测芯片具有用于识别靶标物质的带有微结构的多个区域以及用于运送样品的通道。
另外，本发明的用于识别靶标物质的检测设备具有用于识别靶标物质的检测芯片，该检测设备包括微结构和至少位于该微结构的表面上的含有金属元素的微颗粒；引入装置，用于将样品引入到该检测芯片中；接触装置，用于使引入的样品与微颗粒相接触；以及用于检测因为使样品与微颗粒相接触所导致的物理或者化学变化的装置。在这种情况下，用于检测因为使样品与微颗粒相接触所导致的物理或者化学变化的检测装置优选是光学检测装置，以用光学方式检测这种变化，并且该光学检测装置优选至少由用光照射检测芯片的光照射装置和用于接收来自检测芯片的光的光检测装置构成。光检测装置所接收的光更优选是受到荧光、电化学发光或者等离子体共振影响的光。
本发明还涉及一种用于检测靶标物质的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤将样品引入到包括微结构和至少位于该微结构的表面上的含有金属元素的微颗粒的区域中，以及检测因为使样品与微颗粒相接触所导致的物理或者化学变化。
以下参考附图描述本发明的优选实施方式。
作为本实施方式的反应区域的微结构是指由具有大约几百μm或更小尺寸的孔隙的任何材料构成的结构。微结构的例子包括中空结构(图1A)、多孔结构(图2A)、蛋白石结构(图2B)、反蛋白石结构(图2C)、微颗粒聚集的结构(其中蛋白石结构中的微颗粒不规则地并排设置)(未显示)、柱结构(图2D)、凸结构(图2E)、凹结构(图2F)、突出的结构(图2G)和纤维结构(图2H)。此处，描述利用中空结构作为微结构来检测靶标物质的情况。
在本实施方式中，作为反应区的微结构和含有金属元素的微颗粒(以下称之为“含有金属元素的微颗粒”)的复合物位于基板上。用于陷获靶标物质的陷阱可以固定在含有金属元素的微颗粒上。通过固定陷获功能以在含有金属元素的微颗粒上互补性地键合至靶标物质，可以将靶标物质固定在靠近微颗粒附近的区域上，这样可以高再现性进行检测。
不必固定陷阱，如果含有金属元素的微颗粒具有允许识别样品中的靶标物质的性能就足够了。此处，识别是指例如检测靠近含有金属元素的微颗粒的靶标物质。当靶标物质靠近含有金属元素的微颗粒时，含有金属元素的微颗粒附近的折射率发生变化。由于折射率中的变化表现在吸收和散射光谱等中，因此可以检测到靶标物质。在这种情况下，微颗粒可以用作检测例如流体的折射率等(类型或者浓度)的传感器。
另外，测量所需要的光源和光检测器被设置成将用于识别靶标物质的反应区域夹在它们之间。在这种情况下，基板优选是对光源的光透明的材料，例如玻璃。当微结构是中空结构或者是多孔结构时，孔优选具有几十nm至几十μm的直径。
图1A是显示该检测设备的整体结构的示意图；图1B显示了作为检测芯片的中空结构的顶面；图1C显示了中空结构的侧剖视图。
测量系统由光源101、芯片中的反应区域(中空结构)103和光检测器107构成。从光源101发出的光是入射光102，其入射在芯片中的反应区域103上。在芯片中的反应区域103中形成多个通孔104。通孔104的内表面吸附含有金属元素的微颗粒105。从芯片中的反应区域103中出来的透射光106被光检测器107所检测。
图1B和1C分别是芯片中的反应区域103的俯视图和剖视图。附图标记109和110分别表示通孔109和含有金属元素的微颗粒110，该通孔形成在基板108上贯穿基板并作为基板上的反应区域103，该含有金属元素的微颗粒110吸附在通孔104的内表面上。
含有金属元素的微颗粒105可以是粘聚的或者是分离的，并具有用于所需反应的足够空间。
根据图1A，来自光源101的入射光102入射在芯片中的反应区域103的顶面上，来自芯片中的反应区域103的透射光106由光检测器107所检测。但是，可以通过改变光检测器107的位置来检测反射光。
通过利用光检测器107测量吸收和/或散射光谱可以获得基于吸附在通孔104上的含有金属元素的微颗粒105的局部表面等离子体共振的光谱特性。通过检测改变与含有金属元素的微颗粒105的表面相接触的介质(更具体的说，是靠近含有金属元素的微颗粒的区域中的介质)或者允许提前固定在含有金属元素的微颗粒上的陷阱键合至靶标物质而导致的吸收和/或散射光谱中的变化，可以测量吸收和/或散射光谱。
在利用基于含有金属元素的微颗粒的局部表面等离子体共振的检测技术的情况下，在含有金属元素的微颗粒中含有的金属元素可以是能导致局部表面等离子体共振的任何金属元素。特别的，金、银、铜、铂、铝、锌、钾等是优选的。另一方面，在利用基于如下所述的荧光或者电化学发光的方法的检测技术的情况下，可以选择适用于每种技术的任何金属元素。
尽管可以从任何材料中选择用于例如中空结构或者多孔结构的微结构的材料来使得陷获靶标物质的检测技术和效率是最优的，但是该材料更优选是对入射光和要检测的光的波长是透明的材料。
检测设备包括用于检测因为使样品与含有金属元素的微颗粒相接触导致的物理或者化学变化的装置，每单位体积的含有金属元素的微颗粒的量是大的。因此，因为存在靶标物质而导致的物理或者化学变化以高水平呈现在反应区域中，由此可以改善检测的灵敏度。
在通过光学方式检测识别在作为反应区域的微结构中导致的物理/化学变化的情况下，不必直接在反应区域中形成用于检测物理/化学变化的结构。因此，芯片具有简单的结构，并可以在更短时间内制造。另外，由于可以使反应区域和检测部分之间的间隔更长，因此可以更容易设计和制造检测设备。
作为光学检测的方法，优选采用荧光方法、电化学发光方法和等离子体共振方法。由于可以在荧光或者电化学发光方法中根据光量来确定靶标物质的浓度，因此可以简化检测机理。在采用等离子体共振的方法中，由于可以检测在反应过程中的物理变化，甚至反应过程状态也可以用来作为确定靶标物质的浓度的参数。另外，由于不需要标记，因此可以减少在反应区域中的反应步骤数量，并且可以减少检测所需时间。
(微结构)本发明的微结构是这样一种结构，在其中形成孔隙，这样该结构每单位体积具有大的表面积(比表面积)。可以将本发明的微结构中的孔隙设计为在它们之间具有体积和间隔，从而使该微结构具有所需的比表面积。本发明的微结构是本发明的陷获芯片、检测芯片和检测设备的构成材料，并具有孔隙，在孔隙中至少有作为本发明的构成材料的含有金属元素的微颗粒，该微结构可以具有这样的孔隙形状，即，孔隙形状的选择要考虑包括靶标物质的样品的性能(例如靶标物质的量或者例如粘度的液体性质)。所述孔隙优选具有1nm至10μm的直径。但是已经发现，就通道阻力而言孔隙更优选具有50nm或者更大的最小直径，并且就孔隙中的扩散时间而言孔隙更优选具有1000nm或者更小的最大直径。
本发明使用的微结构的材料可以是能够形成本发明的结构的任何材料，可以是从以下材料中选择的一种或者多种材料金属、金属氧化物、无机半导体、有机半导体、无机固体材料(例如玻璃和陶瓷)、天然聚合物、合成聚合物、以及塑料，或者包括其复合物的材料。
本发明中使用的微结构可以具有能够形成本发明的结构的任何形状，包括选择以下的一种或者多种形状多孔结构、蛋白石结构、反蛋白石结构、微颗粒聚集的结构、柱结构、中空结构、凸结构、凹结构、突出的结构和纤维结构。
本发明的微结构的形状分别定义如下。
多孔结构具有多个孔、并且每个孔具有随机打开的任何形状的结构(图2A)。
蛋白石结构其中球体紧密聚集的结构(图2B)。
反蛋白石结构其中与蛋白石结构中的空间部分对应的空间由物质填充的结构(图2C)。
微颗粒聚集的结构其中球体没有紧密聚集的结构(未显示)。
柱结构其中多个具有任何形状的柱并排设置的结构(图2D)。
中空结构其中形成有多个通孔的结构(图1A、1B和1C)。
凸结构其中在基板上具有多个有任何形状的凸出突起(在图2E中形状类似凸透镜)的结构。
凹结构其中在基板上具有多个有任何形状的凹入孔(在图2F中形状类似凹透镜)的结构。
突出的结构其中多个针状突起彼此纠缠的结构(图2G)。
纤维结构其中多个纤维组分以一种复杂的方式彼此纠缠的结构(图2H)。
作为塑料的主要成分的有机聚合物化合物是通过选自以下的一种或者多种可聚合的单体聚合而制成的有机聚合物化合物，所述单体包括苯乙烯类可聚合单体例如苯乙烯、α-甲基苯乙烯、β-甲基苯乙烯、邻-甲基苯乙烯、间-甲基苯乙烯、对-甲基苯乙烯、2，4-二甲基苯乙烯、对正丁基苯乙烯、对叔丁基苯乙烯、对正己基苯乙烯、对正辛基苯乙烯、对正壬基苯乙烯、对正癸基苯乙烯、对正十二烷基苯乙烯、对甲氧基苯乙烯、和对苯基苯乙烯；丙烯酸类聚合单体例如丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸正丙酯、丙烯酸异丙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸异丁酯、丙烯酸叔丁酯、丙烯酸正戊酯、丙烯酸正己酯、丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸正辛酯、丙烯酸正壬酯、丙烯酸环己酯、丙烯酸苄基酯、磷酸二甲酯丙烯酸乙酯、磷酸二乙酯丙烯酸乙酯、磷酸二丁酯丙烯酸乙酯和2-苯甲酰氧基乙基丙烯酸酯；甲基丙烯酸类可聚合单体，例如甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸正丙酯、甲基丙烯酸异丙酯、甲基丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸异丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸正戊酯、甲基丙烯酸正己酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸正辛酯、甲基丙烯酸正壬酯、磷酸二乙酯甲基丙烯酸乙酯、磷酸二丁酯甲基丙烯酸乙酯；亚甲基脂肪族单羧酸酯；以及乙烯类可聚合单体例如乙烯酯例如醋酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、苯甲酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、苯甲酸乙烯酯、和甲酸乙烯酯，乙烯基醚例如乙烯基甲醚、乙烯基乙基醚和乙烯基异丁基醚、以及乙烯基酮例如乙烯基甲基酮、乙烯基己基酮和乙烯基异丙基酮。
可以使用的无机固体材料的示例包括但不限于，粘土矿物质例如高岭石、膨润土、滑石和云母；金属氧化物例如氧化铝、氧化钛、氧化锌、氧化镁、铁氧体、NbTa复合氧化物、WO3、IN2O3、MoO3、V2O5和SnO2；不溶的无机盐例如硅胶、羟磷灰石和磷酸钙凝胶；金属例如金、银、铂和铜；半导体化合物例如GaAs、GaP、ZnS、CdS和CdSe；玻璃、硅和其复合物。
本发明的微结构可以利用塑料制成的薄膜形成为膜或者片，所述塑料例如聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、二醋酸酯、三醋酸酯、赛璐玢、赛璐珞、聚碳酸酯、聚酰亚胺、聚氯乙烯、聚偏氯乙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯或者聚酯；可以利用聚氯乙烯、聚乙烯醇、醋酸纤维素、聚碳酸酯、尼龙、聚丙烯、聚乙烯、Teflon等制成的多孔聚合物膜；木板、玻璃板、硅基板；棉、人造纤维、丙烯酸树脂、丝绸、聚酯等的纤维；或者纸张，例如道林纸、含磨木浆纸、美术纸、证券纸、再生纸、钡白纸、高光泽印刷纸、皱纹纸或者树脂印相纸。但是微结构的形状不限于此。这些膜或者片状材料可以是平滑的或者不平滑的。
微结构的示例包括但不限于，硅、石英、玻璃、二氧二硅玻璃等的基板，以及通过例如光刻法、蚀刻或者喷砂等技术在这种基板中加工的微沟槽或者孔；柱结构、突出的结构、凹结构、凸结构、拱顶状结构或者具有用金、银或者铂薄膜加工的表面的这种结构；PDMS(聚二甲基硅氧烷)、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)、PC(聚碳酸酯)、PS(聚苯乙烯)等的基板以及通过成型技术在这种基板中加工的微沟槽和孔；柱结构、突出的结构、凹结构、凸结构、拱顶状结构、碳纳米管、碳纳米突、球碳金刚石或者其聚集体；氧化铝、碳、球碳、ZnO等制成的纳米晶须；SiO2、铝硅酸盐、其他金属硅酸盐、TiO2、SnO2、Ta2O5等制成的中孔性薄膜、微颗粒和单块结构；金、银、铜、铂等的微颗粒；铁氧化物例如磁铁、铁氧体、赤铁矿、γ-赤铁矿或者磁铁的微颗粒；通过将膜、多孔氧化铝薄膜、氧化铝纳米孔结构、硅纳米线等阳极氧化获得的铝-硅混合的膜和氧化硅纳米结构。
微结构不限于上述结构和材料。
(由于和靶标物质接触而改变性能的物体)由于和靶标物质接触而改变性能的物体的示例包括含有金属元素的微颗粒。含有金属元素的微颗粒可以含有任何金属元素，诸如碱金属元素例如钾、金、银、铜、铂、锌、锂、或者铝；碱土金属元素、铍或者镁；具有磁性的金属，例如铁、钴或者镍；或者半导体元素例如钪、钛、钒、铬、锰、镓或者镉。优选示例包括但不限于如下容易导致等离子体共振的元素，例如金、银、铜、铝、锌和钾。
(靶标物质/靶标物质陷阱)
样品中包括的靶标物质可以粗略地分成异型生物质和生物物质。
工业上有用的异型生物质包括作为环境污染物的带有不同数量/位置的氯取代基的PCB、作为环境污染物的带有不同数量/位置的氯取代基的二恶英、以及称之为环境激素的内分泌干扰化学品(例如六氯代苯、五氯苯酚、2，4，5-三氯乙酸、2，4-二氯苯氧基乙酸、氨基三唑、莠去津、草不绿、六氯环己烷、乙基对硫磷、氯丹、氧氯丹、九氯、1，2-二溴-3-氯丙烷、DDT、开乐散、艾氏剂、异狄氏剂、狄氏剂、六氮硫环(硫丹)、七氯、七氯还氧化物、马拉硫磷、甲氨叉威、甲氧氯、灭蚁灵、除草醚、毒杀芬、氟乐灵、烷基苯酚(具有5-9个碳原子)、壬基苯酚、辛基壬基苯酚、4-辛基苯酚、双酚A、双-2-乙基己基邻苯二甲酸酯、邻苯二甲酸丁基苄基酯、邻苯二甲酸二正丁基酯、邻苯二甲酸二环己基酯、邻苯二甲酸二乙酯、苯并芘、2，4-二氯苯酚、二-2-乙基己基己二酸酯、二苯甲酮、4-硝基甲苯、八氯苯乙烯、涕灭威、苯菌灵、开蓬(十氯酮)、代森锰锌、代森锰、代森联、赛克津、亚减宁、顺式氰戊菊酯、氰戊菊醋、苄氯菊酯、乙烯菌核利、代森锌、福美锌、邻苯二甲酸二戊酯、邻苯二甲酸二己酯、和邻苯二甲酸二丙酯)。
生物物质包括选自以下的生物物质，包括核酸、蛋白质、糖链、脂质和其复合物。更具体的说，这种生物物质包括选自以下的生物分子，包括核酸、蛋白质、糖链和脂质。具体的说，本发明可以用于包括选自以下物质的任何物质，包括DNA、RNA、核酸适体、基因、染色体、细胞膜、病毒、抗原、抗体、外源凝集素、半抗原、激素、受体、酶、肽、鞘糖脂和鞘类磷脂。另外，产生以上“生物物质”的细菌或者细胞可以是本发明涉及的作为“生物物质”的靶标物质。
具体的蛋白质包括所谓的疾病标记。
疾病标记的示例包括作为酸性糖蛋白的α-胎蛋白(AFP)，它在胎儿时期在肝细胞内产生并存在于胎儿血液中，作为肝细胞癌症(原发性肝癌)、肝母细胞瘤、转移性肝癌和卵巢内胚层窦瘤的标记；PIVKA-II，作为在肝功能障碍情况下出现的异常凝血酶原，它被证实具体出现在肝细胞癌症中；BCA225，作为糖蛋白，它是免疫组织化学的乳腺癌特定抗原，作为原发性和晚期乳腺癌、复发性乳腺癌和转移性乳腺癌的标记；碱性胎蛋白(BFP)，作为碱性胎蛋白，在人类胎儿血清、肠组织提取物、脑组织提取物中发现，用作卵巢癌、睾丸肿瘤、前列腺癌、胰腺癌、胆道癌、肝细胞癌、肾癌、肺癌、胃癌、膀胱癌和结肠癌的标记；CA15-3，作为糖抗原，是晚期乳腺癌、复发性乳腺癌、原发性乳腺癌和卵巢癌的标记；CA19-9，作为糖抗原，是胰腺癌、胆道癌、胃癌、肝癌、结肠癌和卵巢癌的标记；CA72-4，作为糖抗原，是卵巢癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌和胰腺癌的标记；CA125，作为糖抗原，是卵巢癌(尤其是浆液囊腺癌)、子宫体腺癌、输卵管癌、子宫颈腺癌、胰腺癌、肺癌和结肠癌的标记；CA130，作为糖蛋白，是上皮卵巢癌、输卵管癌、肺癌、肝细胞癌和胰腺癌的标记；CA602，作为核蛋白抗原，是卵巢癌(尤其是浆液囊腺癌)、子宫体腺癌、子宫颈腺癌的标记；CA54/61(CA546)，作为有关核基质糖链的抗原，它是卵巢癌(尤其是粘质囊腺癌)、子宫体腺癌、子宫颈腺癌的标记；癌胚抗原(CEA)，它是目前最广泛用于辅助癌症诊断的，作为涉及肿瘤例如结肠癌、胃癌、直肠癌、胆道癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、子宫癌和泌尿系统癌的标记；DUPAN-2，作为糖抗原，它是胰腺癌、胆道癌、肝细胞癌、胃癌、卵巢癌和结肠癌的标记；弹性蛋白酶1，作为胰腺外分泌蛋白酶，它存在于胰腺中，并具体地说用于水解结缔组织(它构成动脉壁、腱等)的弹性纤维、弹性蛋白，作为胰腺癌、胰腺囊胰癌和胆道癌的标记；免疫抑制酸性蛋白(IAP)，作为糖蛋白，以高浓度存在于人类癌症患者的腹水或者血清中，作为肺癌、白血病、食道癌、胰腺癌、卵巢癌、肾癌、胆管癌、胃癌、膀胱癌、结肠癌、、甲状腺癌和恶性淋巴瘤的标记；NCC-ST-439，作为糖抗原，是胰腺癌、胆道癌、乳腺癌、结肠癌、肝细胞癌、肺腺癌和胃癌的标记；γ-精浆蛋白(γ-Sm)，作为糖蛋白，它是前列腺癌的标记；前列腺特定抗原(PSA)，作为从人体前列腺组织提取的糖蛋白，存在于前列腺组织中，并因此是前列腺癌的标记；前列腺酸性磷酸酶(PAP)，作为从前列腺分泌的酶，在酸性pH条件下水解磷酸酯，它用做前列腺癌的肿瘤标记；神经特定烯醇酶(NSE)，作为糖酵解酶，具体来说存在于神经组织和神经内分泌细胞中，作为肺癌(尤其是肺小细胞癌)、成神经细胞瘤、神经瘤、胰岛癌、食道小细胞癌、胃癌、肾癌和乳腺癌的标记；与鳞状上皮细胞癌有关的抗原(SCC抗原)，作为从子宫颈鳞状上皮细胞癌的肝转移病灶提取和提纯的蛋白质，它是子宫癌(颈鳞状上皮细胞癌)、肺癌、食道癌、头颈癌以及皮肤癌的标记；多涎LeX-i抗原(SLX)，作为糖抗原，它是肺腺癌、食道癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、卵巢癌和子宫癌的标记；Span-1，作为糖抗原，它是胰腺癌、胆道癌、肝癌、胃癌和结肠癌的标记；组织多肽抗原(TPA)，作为食道癌、胃癌、结肠直肠癌、乳腺癌、肝细胞癌、胆道癌、胰腺癌、肺癌和子宫癌的标记，它是单链多肽，与其他肿瘤标记一起识别晚期癌，尤其用于复发的预报和处理跟踪；多涎Tn抗原(STN)，作为核基质糖抗原，它是卵巢癌、转移性卵巢癌、胃癌、结肠癌、胆道癌、胰腺癌和肺癌的标记；CYFRA(细胞角蛋白)作为肿瘤标记，有效用于检测肺非小细胞癌，尤其是肺鳞状上皮细胞癌；胃蛋白酶原(PG)，作为分泌到胃液中的蛋白质消化酶的两种胃液素(PGI、PGII)的不活跃前体，其用作胃溃疡(尤其是下部胃溃疡)、十二指肠溃疡(尤其是复发性和顽固性十二指肠溃疡)、布伦内氏(Brunner)腺瘤、Zollinger-Ellison综合症和急性胃炎的标记；C-反应性蛋白质(CRP)作为急性相位反应蛋白质，它通过组织异常或者感染而变异，当由于急性心肌梗塞等而发生心肌坏死时其含量高；血清淀粉状蛋白A蛋白质(SAA)，作为急性相位反应蛋白质，它通过组织异常或者感染而变异；肌红蛋白，作为分子量大约为17,500的血红素蛋白，它主要存在于心肌和骨骼肌中，其用作急性心肌感染、肌营养不良、多肌炎和皮肌炎的标记；肌酸激酶(CK)(从骨骼肌得出的CK-MM、从脑或平滑肌得出的CK-BB和从心肌得出的CK-MB三种同功酶，以及键合在线粒体同功酶或者免疫球蛋白的CK(大CK))，作为主要存在于骨骼肌和心肌的可溶部分中的酶，通过细胞受伤而释放到血液中，它是急性心肌感染、甲状腺机能减退、渐进式肌营养不良和多肌炎的标记；肌钙蛋白T，作为分子量为39,000的蛋白质，与肌钙蛋白I、C一起在横纹肌的细丝上形成肌钙蛋白复合物，并涉及肌肉收缩的调整，它是横纹肌溶解、心肌炎、心肌感染和肾衰竭的标记；心脏肌球蛋白轻链I，作为包括在骨骼肌的细胞和心肌细胞内的蛋白质，它是用于急性心肌感染、肌营养不良和肾衰竭的标记，因为标记值升高表示骨骼肌或心肌的机能障碍或者坏死；嗜铬粒蛋白A、硫氧还原蛋白、8-OHdG和皮质醇，它们在近年来作为压力标记引起注意。
“抗体”作为在本发明中的陷阱，表示在天然环境中在器官中产生的、或者全部或部分通过基因重组技术、基因工程、有机反应等合成的免疫球蛋白。本发明中的“抗体”还包括具有特定键合能力的任何衍生物。该术语还包括具有键合域的任何蛋白质，它与免疫球蛋白(包括嵌合抗体或者人源化抗体)的键合域同源或者高度同源。这些“抗体”或者“免疫球蛋白”在天然环境中在器官中产生，或者全部或者部分合成或者改性。
所述“抗体”或者“免疫球蛋白”可以是对靶标物质特定的单克隆抗体或者多克隆抗体。
所述“抗体”或者“免疫球蛋白”可以是任何免疫球蛋白类的其中一个，包括任何人的类(IgG、IgM、IgA、IgD和IgE)。在本发明中，IgG类的衍生物是更优选的。
本发明的“抗体片段”是指长度小于抗体或者免疫球蛋白的全长的抗体的任何分子或者复合物，或者这种分子的任何复合物。优选的是，抗体片段具有对全长抗体的特定键合能力来说重要的部分。抗体片段的示例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、Fv、双功能抗体和Fd片段。
可以通过任何方法来制造抗体片段。例如，可以通过将完好的抗体断裂来通过酶的作用或者化学方法制造抗体片段，或者可以通过基因编码部分抗体序列来重组制造。或者，可以全部或者部分采用合成方法制造抗体片段。如果需要，抗体片段可以是单链抗体片段。或者，抗体可以包括通过例如硫醚(-S-S-)键连接的多个链。如果需要，片段也可以是多个分子的复合物。功能性抗体片段一般包括至少50个氨基酸，更典型的是包括至少200个氨基酸。
本发明中的“可变域”是指在免疫球蛋白的具有氨基酸序列的端部处的域，它因每个抗原而不同，以特定键合至/陷获每种类型的靶标物质(抗原)，并通常称之为Fv。
Fv由“重链可变域(以下称之为VH)”和“轻链可变域(以下称之为VL)”构成。免疫球蛋白G通常包括两个VH域和两个VL域。
“免疫球蛋白重链或者轻链的可变域中的功能性部分(以下简称之为“功能性部分”)”是指实际上靶标物质(抗原)特有的可变域部分，也是在学术上称之为CDR(互补确定区超变量区)的部分，尤其是实际上靶标物质(抗原)特有的CDR部分。
靶标物质与陷阱之间可能发生任何的相互作用，只要本发明的芯片可以确定在键合之前和之后的物理/化学的变化量。更优选的是，这种相互作用是“抗原-抗体反应”，“抗原-核酸适体(带有特定结构的RNA片段)”，“配体-受体相互反应”，“DNA杂交”，“DNA-蛋白质(例如转录因子)相互反应”，“外源凝集素-糖链相互反应”等。
(微通道)尽管本发明的芯片的反应区域可以仅用在分批式系统反应中，但是反应区域可以被构成为与微通道连接，和/或反应区域可以被构成为位于微通道内，以促进靶标物质陷获反应，确保定量和可再现性，并简化由人执行的复杂操作。
本发明的微通道可以被加工为基板中的微沟槽或者可以具有毛细结构。
作为构成本发明的微通道的材料，可以使用允许加工微通道、允许样品被引入到靶标物质陷获反应区、并且不会抑制检测系统的任何材料。通常，可以使用无机材料，例如玻璃、石英玻璃和硅、以及树脂(例如PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)和PDMS(聚二甲基硅氧烷))，如果需要，将它们在一起制造并结合在一起，或者可以使用加工成毛细管的玻璃、聚酰亚胺、熔融的二氧化硅。
实施例以下参考其他实施例描述本发明。但是这些实施例不是对本发明范围的限制。
(实施例1)首先，参考图3描述实施例1中的构成。
<构成>
图3是显示该实施例中的构成的示意图。图3的检测设备用于检测样品中的靶标物质，该设备由钨灯301、准直透镜303、芯片中的反应区域304和分光光度计308构成。尽管在本实施例中使用产生白光的钨灯301，但是可以使用激光束。从钨灯301发出的入射光302通过准直透镜303转换为平行光，并入射在芯片中的反应区域304上，所述反应区域304是具有在基板上形成的多个通孔305的中空结构。
在反应区域304中形成的作为芯片中的中空结构的通孔305中，固定金的微颗粒306。入射光302穿过作为中空结构的芯片中的反应区域304，并射出芯片中的反应区域304成为出射光307。出射光307入射在分光光度计308上。
此处，参考图4A、4B和4C描述检测芯片的详细构成。
图4A是将检测芯片分解为构成元件的分解视图。检测芯片由顶盖401、带有微孔的膜406、包装材料404、包装材料407、0形环405和底盖408构成。对于顶盖401和底盖408的材料没有任何限制，只要该材料是光学透明的、不会允许流体渗透穿过、并且容易形成即可。在顶盖401中形成用于引入样品的入口402和用于在反应之后排出样品的出口403。设置包装材料404和407，用于允许流体仅渗透穿过反应区域。对其材料没有限制，只要该材料具有高度柔性、容易形成并且不会允许流体渗透穿过即可。设置O形环405用于防止流体从膜406泄漏，该O形环优选由硅橡胶或者氟橡胶制成。本实施例中使用的多孔膜406是具有中空结构的氧化铝纳米孔膜，其中通孔垂直于膜的平面。
在本实施例中，顶盖401和底盖408是通过PMMA树脂模制而成，包装材料404和407是通过PMMA树脂模制而成。多孔膜406采用纳米盘膜，它是Whatman plc制造的氧化铝纳米孔膜。
图4B是显示组件的视图，在该组件中，图4A中的元件沿垂直方向组合并由图中未显示的螺栓按照给定的作用力或者更大的力沿垂直方向固定。
在顶盖401和底盖408中形成的凹度和凸度形成了样品的通道，具有微孔的膜406、包装材料404、包装材料407和O形环405形成通道中的微孔。
在顶盖401和底盖408中形成的凹度和凸度形成了样品的通道，具有微孔的膜406、包装材料404、包装材料407和O形环405形成通道中的微孔。
图4C是从顶面看的检测芯片的视图，测量位置409与暴露于形成有通道的膜的通道的微孔位置相对应。
所述微孔的每一个的直径是0.2μm，密度是大约8孔/μm2，每一个的深度是60μm。
<制备反应区域的方法>
在制备反应区域时，由于不必使用整个氧化铝纳米孔膜作为反应区域，因此将氧化铝膜夹在包装材料404和407之间并进行处理，使得除了氧化铝膜的反应区域之外的区域不被处理。
首先在本实施例中，使用金的微颗粒。如下固定金的微颗粒。对于反应区域的氧化铝表面，将包装材料所夹着的氧化铝纳米孔膜浸在氨基乙硫醇的乙醇溶液中，使得硫醇基团键合至金属氧化物。然后将膜浸在金的微颗粒的水溶液中，其中金的微颗粒的颗粒直径是20-40nm(由Tanaka Kikinzoku Kogyo K.K.制造)，从而将金的微颗粒吸附在中空柱上。
然后将抗体固定在金微颗粒上作为陷阱。固定方法涉及利用11-巯基十一烷酸(具有对金有高度亲和力的硫醇基团)的乙醇溶液对固定在氧化铝纳米孔膜上的金的微颗粒进行表面改性。在这种情况下，利用点样器(spotter)等仅在反应区域滴加预定量的该溶液。因此羧基暴露在金的微颗粒的表面上。在这种状态下，利用点样器按照相同的方式将N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Dojindo Laboratories制造)的水溶液和1-乙基-3-[3-二甲基氨基]丙基碳化二亚胺氯化氢(Dojindo Laboratories制造)的水溶液滴加到反应区域上。因此，琥珀酰亚胺基团暴露在金的微颗粒的表面上。然后，将中空柱浸到作为要固定的抗体的特定于靶标物质的兔抗鼠IgG抗体的磷酸缓冲液(pH8.0)中。通过使得位于金表面上的琥珀酰亚胺基团与兔抗鼠IgG抗体的氨基基团相反应，将兔抗鼠IgG抗体固定在金的表面上。此处，仅描述了固定一种抗体的方法。当要在每个反应区域上固定不同抗体时，可以通过将目标反应区域之外的区域遮蔽并改变要固定的抗体来重复相同的处理，从而制备固定多种抗体的芯片反应区域。
<检测方法>
以下描述利用如上制备的芯片的检测方法。图5是显示利用芯片的设备和芯片的方框图。在图中，为了简便起见，反应区域的数量是一个。
入口501和出口502与检测芯片相结合。调整检测芯片(以下称之为“芯片”)的位置，从而反应区域在分光光度计503和光源504之间的光轴上。在这种状态下，利用分光光度计503检测反应之前的光谱。然后驱动泵505，以向检测芯片506的反应区域提供预定量的样品，由此进行抗原-抗体反应，从而借助于抗体由金的微颗粒陷获靶标物质。在反应之后，通过分光光度计503测量光谱。将此时的光谱与反应之前的光谱进行比较。它们之间的差异就是在靠近金的微颗粒附近的区域中通过陷获靶标物质而导致的金的微颗粒的局部表面等离子体共振状态中的变化。根据光谱变化程度确定靶标物质的浓度，并显示在显示单元507中。附图标记508表示中央处理单元，附图标记509表示废液储存器。
此处，利用已知的具有多个浓度的标准样品来提前获得光谱变化和靶标物质浓度之间的关系。根据该关系确定校准曲线，以确定在光谱变化和浓度之间的函数。在实际测量中，利用该函数可以根据光谱变化确定未知浓度的靶标物质的浓度。此处描述的光谱变化可以是在包括最大波长的不同波长处的光谱峰值中的变化，可以采用峰形中的变化(例如在光谱波形半高度处的峰宽度)，或者可以采用在一个或者多个波长点处的光强度。
(实施例2)以下描述利用电化学发光的发光检测靶标物质的实施例2中的检测设备，它采用带有由吸附在ZnO制成的突出结构上的金的微颗粒的复合物构成的检测芯片。
图6是本实施例的示意图。
检测芯片包括由层叠在玻璃基板上的透明导电膜ITO形成的工作电极601、铂制成的反电极602、以及由突出结构603和金的微颗粒604构成的复合物，并且工作电极601和反电极602之间的空间可以填充有液体。在这种结构中，按照需要单独形成每个反应区域。通过光电倍增管(PMT)605来进行检测。
此处，参考图7A、7B和7C描述位于通道内的反应区域的构成。
图7A是从顶面看的检测芯片的视图，图7B是该芯片的侧视图。多个反应区域701位于通道703内。在每个反应区域701内形成突出结构和金的微颗粒构成的复合物702。在突出结构的底部处形成反电极705。将样品704引入到入口706中，穿过反应区域701，并从出口707排出。图7C是检测设备712与检测芯片713结合时的侧视图。在该构成中，入口和出口分别与样品入口连接器710和样品出口连接器711连接，将样品引入到连接器710，并从连接器711排出。通过光电倍增管708检测从每个反应区域通过电化学发光发出的光709。
芯片内的多个反应区域可以从一个样品中同时陷获和检测要被检测的多种物质。另外，由于利用微结构向反应区域内引入用于检测的样品或者试剂或者灌洗液时使用了通道，因此可以更稳定的定量性和再现性进行反应、检测和清洗处理。
<制备靶标物质陷获尖端的方法>
首先，利用在日本专利申请公开NO.2002-167300中披露的方法制备ZnO制成的突出结构。作为其上固定有突出结构的基板，使用其上层叠有作为透明导电膜的ITO的玻璃板。如下所述将ZnO制成的突出结构与金的微颗粒结合。将ZnO制成的突出结构浸在氨基乙硫醇的乙醇溶液中，使得硫醇基团键合至金属氧化物。然后将突出结构浸在金的微颗粒的水溶液中，其中每个颗粒的直径是20-40nm(TanakaKikinzoku Kogyo K.K.制造)，以制备图6所示的复合物，其中金的微颗粒吸附在突出结构604的表面上。
然后，举例说明在金的微颗粒表面上固定作为本实施例使用的靶标物质陷阱的抗-AFP(甲胎蛋白)抗体的方法。利用11-巯基十一烷酸(具有对金有高度亲和力的硫醇基团)的乙醇溶液对金的微颗粒的表面进行改性。在这种情况下，利用点样器等仅在反应区域滴加预定量的该溶液。因此羧基暴露在金的微颗粒的表面上。在这种状态下，利用点样器按照相同的方式将N-羟基硫代琥珀酰亚胺(由DojindoLaboratories制造)的水溶液和1-乙基-3-[3-二甲基氨基]丙基碳化二亚胺氯化氢(由Dojindo Laboratories制造)的水溶液滴加到反应区域上。因此琥珀酰亚胺基团暴露在金的微颗粒的表面上。然后，通过键合抗生物素蛋白链菌素来利用抗生物素蛋白链菌素使金的微颗粒的表面改性。在金的微颗粒的表面上固定生物素化的抗-AFP抗体。
很明显，可以提供一种在多个反应区域上分别固定不同的抗体并且通过一个芯片检测不同的靶标物质的构造。通过利用不同的抗体按照上述方法执行相同的程序就可以获得这种结构。
<检测方法>
在以下过程之后确定通过电化学发光而发出的光。
(1)使包括作为靶标物质的AFP的样品流入到所制备的芯片中，以使AFP被陷获在微颗粒上。
(2)排出样品，用磷酸缓冲液洗涤通道。
(3)使用Ru(II)(bpy)32+标记的抗-AFP单克隆抗体被吸附在芯片上。
(4)排出标记的抗体溶液，用磷酸缓冲液洗涤通道。
因此由芯片陷获作为抗原的AFP和标记有Ru(II)(bpy)32+的抗-AFP单克隆抗体。此处为了导致电化学发光，用TPA(三丙基胺)溶液作为电子供体物质填充工作电极和反电极之间的空间，并使各电极充电。因此由于键合在电极表面的固相上的钌和细胞内的TPA导致电化学发光，在PMT605测量发光。这种发光强度取决于所陷获的Ru(II)(bpy)32+的量。具体的说，由于发光强度取决于所陷获的AFP的量，因此可以确定AFP的浓度。提前利用已知浓度的AFP对照溶液确定在发光强度和样品中的AFP浓度之间的关系。
(实施例3)以下参考图8描述利用凸结构作为微结构的实施例3的检测设备。
<构成>
本实施例的检测设备由激光二极管光源801、准直透镜802、凸结构和金的微颗粒805的复合物构成的检测芯片804、准直透镜807、滤镜808和光电倍增管809构成。
<制备靶标物质陷获尖端的方法>
此处，作为制备凸结构的方法，采用如日本专利申请公开NO.2000-263556所披露的技术。通过该方法制造具有图2E所示形状的SiO2制成的微透镜阵列。为了使得金的微颗粒吸附在微透镜阵列的表面上，首先用氨基硅烷偶联剂(由Chisso Corporation制造)处理透镜表面，从而使氨基基团出现在该表面上。然后将该微透镜阵列浸到金的微颗粒的溶液中，其中颗粒直径是20-40nm(由TanakaKikinzoku Kogyo K.K。制造)，以获得表面上吸附有金的微颗粒的复合物。然后按照如实施例2同样的方法，使得抗生物素蛋白链菌素附着在金的微颗粒的表面上。最后，使用生物素改性的抗-CEA抗体、抗-AFP抗体、抗-PSA抗体和抗-PAP抗体吸附在其上，以提供本发明的靶标物质陷获芯片。
<检测方法>
在图8中，来自激光二极管光源801的光由准直透镜802转换为平行光803。用平行光803照射凸结构和金的微颗粒805的复合物804。为了防止检测来自复合物804的反射光806，刚好在光电倍增管809的前面插入用于阻挡入射光波长范围内的光的滤镜808。从固定在金的微颗粒805上的荧光颜料发出的荧光穿过准直透镜807，并由光电倍增管809通过滤镜808检测。
在实际的测量中，进行已知作为癌症标记的CEA、AFP、PSA和PAP的各种抗原的检测。使得各种抗原按照如下方式特定键合至抗体。
(1)将分别含有CEA抗原、AFP抗原、PSA抗原或者PAP抗原溶液的样品引入到通道内，并培养5分钟。
(2)排出抗原溶液，用磷酸缓冲液洗涤通道。
(3)将用Cy5颜料进行荧光标记的抗-CEA抗体、抗-AFP抗体、抗-PSA抗体和抗-PAP抗体分别引入到通道内，并培养5分钟。
(4)排出标记的抗体，用磷酸缓冲液洗涤通道。
(5)用磷酸缓冲液填充通道。
通过在该过程之后引入激光束，可以观察到在微透镜阵列上来自金的微颗粒的荧光。由于荧光强度因荧光颜料的浓度而不同，因此可以检测到靶标物质的浓度相关性。
(实施例4)以下参考图10描述以柱微结构作为微结构来代替实施例3中的凸结构的实施例4的检测设备。
当将本实施例的带有柱结构的检测芯片与带有与柱结构相同尺寸的中空结构的检测芯片相比较时，发现中空结构中的反应时间取决于孔直径，柱结构中的反应时间取决于柱之间的间隔。尽管用于在中空结构中引入样品的通道的横截面具有孔的横截面，但是在柱结构中的通道具有在各柱之间的间隔的横截面。这易于在考虑通道阻力的情况下设计柱结构。
本实施例的检测设备与实施例3的相同。具体的说，如图10所示，检测设备由激光二极管光源1、准直透镜2、柱结构4和金的微颗粒5的复合物构成的检测芯片、准直透镜7、滤镜8和光电倍增管9构成。
在图10中，来自激光二极管光源1的光由准直透镜2转换为平行光3。用平行光3照射柱结构4和金微颗粒5的通道10内形成的复合物。为了防止光电倍增管9检测来自复合物的反射光，刚好在光电倍增管9的前面插入用于阻挡入射光波长范围内的光的滤镜7。由于作为来自固定在金的微颗粒5上的荧光颜料发出的光的荧光6其波长与入射光3不同，因此由光电倍增管9通过滤镜8检测该荧光。
如下制造通道10和在通道10内形成的作为微结构的柱结构。如图11所示，对硅基板进行干法蚀刻，以形成沟槽和硅基板11，其中在沟槽内形成柱微结构。作为通过硅基板干法蚀刻得到柱微结构的制造方法，可以使用在US6,531,068中披露的高真空等离子体蚀刻方法，该方法能够通过重复沉积和蚀刻而进行深度蚀刻。因此，可以在硅基板中形成沟槽以及由具有任何形状和布局的柱微结构构成的沟槽内的微结构。如后所述，在将靶标物质陷阱固定在柱结构的表面上之后，硅基板11连接至PDMS树脂基板12，从而可以形成用于导致样品流动的通道。
利用传统的光刻技术形成的光致抗蚀剂作为掩模在以下条件下进行蚀刻，以形成100μm宽和20μm深的沟槽以及沟槽内的圆柱体组，每个圆柱体组由1cm长的区域内的圆柱体构成，组之间具有相同的间隔。每个圆柱体的直径是3μm，高度是20μm，各圆柱体彼此之间以1μm的间隔分开。每个圆柱体的高度大致与沟槽的深度相同。可以根据掩模图案的设计来任意选择圆柱体的直径和在沟槽内的布局。
蚀刻条件沉积条件压力0.133Pa100sccm C4F8
800W 13.56MHz5秒蚀刻条件压力0.266Pa130sccm 高频100sccm C4F813.56MHz9秒柱结构在通道内的设置使其可以在一个芯片中同时陷获和检测要检测的多种物质。例如图12A和12B所示，如果形成柱结构的三个区域，并且在各区域上固定三种不同的靶标物质，可以同时陷获和检测要被检测的三种不同的物质。很明显，可以根据要检测的物质来适当地设计尺寸和布局。
如在实施例3中那样在通道内的柱结构上固定金的微颗粒。通过氨基硅烷偶联剂(由Chisso Corporation制造)将氨基基团暴露在柱结构的表面上，并与金的微颗粒的水溶液反应，其中颗粒直径是20-200nm(由BBInternational Ltd.制造)，以获得表面上固定有金的微颗粒的复合物。然后按照如实施例2同样的方法，利用抗生物素蛋白链菌素由硫醇基对金的微颗粒的表面进行改性。金的微颗粒的表面与生物素改性的抗-肌钙蛋白T抗体反应，以将抗体作为靶标物质陷阱固定在其上。
然后利用图12A和12B所示的检测芯片进行测量。
在图12A和12B所示的检测芯片13中，将上述PDMS树脂基板12连接至具有沟槽作为其中形成柱结构4的通道10的硅基板11。在PDMS树脂基板12中，在与硅基板中形成的沟槽的一端相对应的部分中形成入口14，在与沟槽的另一端相对应的位置处形成作为出口15的开口。
以下举例说明检测作为急性心肌感染的标记的肌钙蛋白T的检测。在以下过程中使作为抗原的肌钙蛋白T特定键合至抗体。
(1)将肌钙蛋白T抗原溶液从图12A和12B的入口14引入到通道10内，并培养5分钟。
(2)排出抗原溶液，用磷酸缓冲液洗涤通道。
(3)将用Cy5颜料进行荧光标记的抗-肌钙蛋白T抗体从入口10引入到通道内，并培养5分钟。
(4)排出标记的抗体，用磷酸缓冲液洗涤通道。
(5)用磷酸缓冲液填充通道。
通过在该过程之后用图10的激光二极管光源发出的激发光照射反应区域，可以观察到来自金的微颗粒表面的荧光。由于荧光强度因荧光颜料的浓度而不同，因此可以定量确定靶标物质的浓度相关性。
(实施例5)在该实施例中，在玻璃基板上形成具有直径为10nm的孔的二氧化硅多孔薄膜，在孔中形成金的微颗粒，在孔内稳定和保持靶标物质陷阱，以检测靶标物质。
图13A和13B是显示在本实施例中使用的检测芯片13的结构的示意图。如图所示，将形成有作为通道10的沟槽的PDMS基板连接至覆盖通道10的PDMS基板18以形成检测芯片。在覆盖通道10的PDMS基板18中，在与作为通道10的沟槽的一端相对应的部分中形成入口14，在与沟槽的另一端相对应的位置处形成作为出口15的开口。
在作为通道10的沟槽的底部处设置玻璃基板17，在该基板上形成有用于支撑金的微颗粒5的表面的多孔薄膜16。
以下描述用于制造其表面上形成有多孔薄膜8的玻璃基板17的方法以及用于使得多孔薄膜16支撑金的微颗粒5的方法。
首先，用异丙醇和纯水洗涤玻璃基板8的表面，然后在臭氧发生器中用紫外光照射以清洁表面。
然后，在20克的乙醇中溶解0.5克的三嵌段共聚物F127(BASF制造)(HO(CH2CH2O)106(CH2CH(CH3)O)70(CH2CH2O)106H)。然后加入4.16克的四乙氧基硅烷(TEOS)、1.0克水和0.81克的0.1M盐酸，在室温下搅拌混合物2小时以制备反应溶液。
通过浸涂将反应溶液施加在玻璃基板上，并在25℃、50％的相对湿度的气氛中干燥24小时。拉的速度是3cm/min。
然后，将基板放在马弗炉中，加热至450℃，并在空气中烧结5小时。在烧结之后观察基板，以证实形成均匀和连续的薄膜。
然后，通过SEM观察薄膜的表面和截面，以根据表面观察证实存在每个直径为10nm的球形孔。根据表面观察，椭圆孔沿着观察的薄膜厚度方向收缩，长度方向的直径是12nm，宽度方向的直径是5nm。
然后，进行X-ray衍射分析，以在与7.5nm间距对应的角度观察归因于立方孔结构的不同的衍射峰。但是截面等的SEM观察证实薄膜实际上具有沿着薄膜厚度方向收缩的立方结构。
上述结果证实在玻璃基板上形成具有直径为10nm的孔的多孔薄膜。
然后使金的微颗粒被支撑在多孔薄膜的孔中。
首先，将其上形成有多孔薄膜的基板浸在四氯-金(III)酸三水合物的水溶液(0.1g/20ml)中，并放置24小时。然后基板在二氯甲烷中浸10分钟，并洗涤表面，在室温下干燥。然后进行还原处理。通过将其上形成有多孔薄膜的玻璃基板保持在管式炉中、按照2％的氢浓度按照50ml/min的速度给炉内充入氢/氦混合气体，并在120℃给基板加热3小时，由此进行还原处理。
在还原处理之后的TEM观察证实保持了孔结构，并且在孔内形成了金的微颗粒。
然后，按照如实施例2同样的方法，利用抗生物素蛋白链菌素由硫醇基对金的微颗粒的表面进行改性。金的微颗粒的表面与生物素改性的抗-PSA抗体反应，以将抗体作为靶标物质陷阱固定在其上。
以下举例说明利用图13A和13B中的检测芯片检测作为前列腺癌标记的PSA。使作为抗原的PSA按照以下的程序特定键合至抗体。使用如实施例3中的图8、9A、9B和9C中同样的光学系统进行检测。在图9A、9B和9C中，附图标记901表示反应区域，附图标记902表示含有金属的微颗粒，附图标记903表示通道，附图标记904表示样品，附图标记905表示入口，附图标记906表示出口，附图标记907表示激光二极管，附图标记908表示光电倍增管(PMT)，附图标记909表示激发光，附图标记910表示荧光，附图标记911表示滤镜，附图标记912表示样品入口连接器，附图标记913表示样品出口连接器，附图标记914表示检测设备，附图标记915表示检测芯片。
(1)将PSA抗原溶液从入口14引入到通道内，并培养5分钟。
(2)排出抗原溶液，用磷酸缓冲液洗涤通道。
(3)将用Cy5颜料进行荧光标记的抗-PSA抗体从入口14引入到图13A和13B中的通道内，并培养5分钟。
(4)排出标记的抗体，用磷酸缓冲液洗涤通道。
(5)用磷酸缓冲液填充通道。
通过在该过程之后向反应区域引入来自激光二极管光源的激发光，可以观察到来自金的微颗粒表面的荧光。由于荧光强度因荧光颜料的浓度而不同，因此可以定量确定靶标物质的浓度相关性。
本发明不限于上述实施例。很明显，这些实施例的结合和在本发明精神之内的改进都是可以的。
本申请要求在2004年3月5日提出的日本专利申请2004-062606和在2004年6月25日提出的2004-188879的优先权，它们在此引入作为参考。
权利要求
1.一种检测设备，其包括基板，其包括性质会因为与靶标物质接触而发生改变的多个物体；用于使靶标物质与所述物体相接触的装置；以及用于根据在用光照射所述物体时产生的光输出来检测因为在靶标物质与所述物体相接触时所导致的物体性能的变化的装置，其中所述多个物体位于照射光行进的方向上，并且该检测装置是一种用于根据在照射光时从多个物体输出的光的总和来检测性能变化的装置。
2.如权利要求1所述的检测设备，其中，所述物体是含有金属元素的微颗粒。
3.如权利要求1所述的检测设备，其中，所述物体还包括用于在表面陷获靶标物质的陷阱，并且所述靶标物质被陷获在陷阱中。
4.如权利要求1所述的检测设备，其中，所述检测装置采用荧光方法、电化学发光方法或者等离子体共振方法。
5.如权利要求1所述的检测设备，其中，该设备还包括用于传送样品的通道。
6.一种检测方法，包括如下步骤提供基板，该基板包括性质会因为与靶标物质接触而发生改变的多个物体；使该靶标物质与所述物体相接触；以及根据在用光照射所述物体时产生的光输出，检测在接触步骤中靶标物质与所述物体相接触时所导致的物体性能的变化，其中检测步骤包括根据从位于照射光行进方向上的多个物体输出的光的总和来进行检测。
7.一种检测芯片，其包括基板，该基板包括性质会因为与靶标物质接触而发生改变的多个物体；以及用于使靶标物质与所述物体相接触的装置；其中根据在用光照射所述物体时产生的光输出，检测因为在靶标物质与所述物体相接触时所导致的物体性能的变化，并且所述多个物体位于照射光行进的方向上。
全文摘要
一种检测设备包括包括其性质会因为与靶标物质接触而发生改变的多个物体(105)的基板(103)，用于使靶标物质与所述物体相接触的装置，以及用于根据在用光(102)照射所述物体时产生的光输出(106)检测因为在靶标物质与所述物体相接触时所导致的物体性能的变化的装置(101，107)，其中所述多个物体位于照射光行进的方向上，并且该检测装置是一种用于根据在照射光时从所述多个物体输出的光的总和来检测性能变化的装置。
文档编号B01L3/00GK1926424SQ20058000693
公开日2007年3月7日 申请日期2005年3月2日 优先权日2004年3月5日
发明者山道淳太, 小川美纪, 饭田洋一郎, 今村刚士, 宇都宫纪彦, 西马聪 申请人:佳能株式会社