一种用于检测大肠杆菌的引物及其方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种用于检测大肠杆菌的引物及其应用。
【背景技术】
[0002] 大肠埃希氏菌（Escherichia coli)习惯称为大肠杆菌，分类于肠杆菌科，归属于 埃希氏菌属。大部分大肠杆菌是人及各种动物肠道中的正常寄居菌，食物或水中大肠杆菌 的检出意味着直接或间接的近期粪便污染。大肠杆菌作为饮水、食品等的粪源性污染卫生 细菌学指标；而且其在外界存活时间与一些主要肠道病原菌相近。它的出现也可能预示某 些肠道病原菌（如沙门氏菌、志贺氏菌）的存在。大肠杆菌是国际上公认的卫生监测指示 菌，因此大肠杆菌的检测技术显得十分重要。
[0003] 传统的大肠杆菌的检测方法有常规涂片镜检法、培养法等，但是这些方法存在一 定的缺陷，如常规涂片镜检是最基本的细菌学检查方法，但是敏感性低，特异性差；培养法 是目前临床上发现传染源的主要途径和手段，但一般需4到7天的时间，操作繁琐，费时耗 力，不能实现快速的目的。
[0004] 本发明利用生物信息学寻找出大肠杆菌特异基因，并针对其设计引物，建立了大 肠杆菌的检测方法，实现了简便、快速、准确的检测出大肠杆菌的目的。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术的缺陷，提出了一种用于检测大肠杆菌的基因，通过生物信 息学手段获取该可用于鉴定大肠杆菌的特异基因，并针对该基因涉及引物。
[0006] 本发明的另一目的在于针对所涉及的引物，建立了大肠杆菌的检测方法，其具有 特异性良好、灵敏较好、检测快速可靠、操作简单的特点。
[0007] 本发明的第三个目的在于提供一种检测大肠杆菌的试剂盒，便于大肠杆菌的检 测。
[0008] 本发明具体通过以下技术方案实现：
[0009] -种用于检测大肠杆菌的引物，包括上游引物和下游引物，所述的上游引物核苷 酸序列如SEQ ID NO :1所示，所述的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示。
[0010] 通过实验证明，本发明提供的检测引物对大肠杆菌具有良好的特异性，该检测引 物针对的靶基因片段LafF基因。
[0011] 一种检测大肠杆菌的方法，包括以下步骤：
[0012] 1)提取待检测样品的t旲板DNA ;
[0013] 2)设计上述所述的引物；
[0014] 3) PCR 扩增：
[0015] 反应体系：Taq 0· 125 μ L，IOX 聚合酶缓冲液 2. 5 μ L，dNTP 2 μ L，Mg2+L 6 μ L，模 板I yL，上下游引物各I yL，加 ddH20补足25yL ;
[0016] 反应条件：95°C 5min ;95°C 30s，57°C 30s，72°C 20s，30 个循环；72°C Imin ;
[0017] 4)利用琼脂糖凝胶电泳方法判断检测结果。
[0018] 一种用于检测大肠杆菌的试剂盒，包括引物SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2,具体为： IOX聚合酶缓冲液2.5 μ L，dNTP 2 μ L，Mg2+L 6 μ L，模板1 μ L，上下游引物各1 μ L，CldH2O 25 μ L0
[0019] 本发明的有益效果为：针对大肠杆菌的特异基因 LafF设计特异引物，该引物可以 快速、简便、准确的检测大肠杆菌。
【附图说明】
[0020] 图1是不同退火温度和MgC12浓度对大肠杆菌PCR反应的影响；M :2000bp DNA Marker ;1 :MgCl2浓度 0· 8mM ;2 :MgCl2浓度 I. 6mM ;3 :MgCl2浓度 2. 4mM ;4 :MgCl2浓度 3. 2mM ; 5 :MgCl2浓度 4. OmM ;
[0021] 图2是大肠杆LafF菌基因特异性检测电泳图；M :2000bp DNAMarker ;1~3 :三株 不同的大肠杆菌菌株；4 :肺炎克雷伯菌；5 :弗劳地氏枸橼酸杆菌；6 :伤寒杆菌泳道；7 :琼 氏不动杆菌；8 :表皮葡萄球菌；9 :粪肠球菌；10 :溶血葡萄球菌；11 :金黄色葡萄球菌；12 : 摩氏摩根菌；
[0022] 图3是大肠杆菌LafF基因灵敏度检测电泳图；M :2000bp DNAMarker ;1~10 :每 微升模板中质粒的数目，1~10分别对应IO9个/ μ L~10 °个/ μ L ;11 :阴性对照。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0024] 实施例1特异性靶基因筛选及引物设计：
[0025] 1)本地 BLAST 分析
[0026] 从 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/genome/)中下载的大肠杆菌全基因组 序列，对本地的核酸数据库进行本地BLAST检索，获取得到大肠杆菌各序列片段与数据库 比对结果。
[0027] 2) BLAST 重确认
[0028] 使用在线BLAST功能，使用2种策略确认其菌种特异性和大肠杆菌鉴定可用性。一 种策略为BLAST时排除大肠杆菌，结果显示无任何相似序列者为大肠杆菌特异基因；第二 种策略为BLAST时选择在大肠杆菌内进行检索，结果返回大量相似序列者是不同大肠杆菌 菌株共有序列。结合两种策略，最终得出基因 LafF如SEQ ID NO :3所示，符合两种策略标 准。
[0029] 3)引物设计
[0030] 针对大肠杆菌LafF基因，设计特异引物：gaagaaaatcgtggtggcgg和 gtcggttttccttttccggc〇
[0031] 实施例2检测方法的建立
[0032] 1)DNA 的提取
[0033] 用北京庄盟国际生物基因科技有限公司的细菌基因组DNA小量提取试剂盒进行 抽提回收，步骤如下：
[0034] (1)取细菌培养液5mL，12, OOOrpm离心1分钟，尽量吸净上清。
[0035] (2)向留有菌体沉淀的离心管中加入500 μ L细胞悬浮液，使用移液器或涡旋振荡 器彻底悬浮细菌细胞沉淀，37°C温浴30分钟。每隔10分钟颠倒混匀数次。12, OOOrpm离心 2分钟，尽量吸净上清。
[0036] (3)向菌体沉淀中加入225 μ L缓冲液A，振荡至菌体彻底悬浮。
[0037] (4)向管中加入6 μ L RNaseA溶液，振荡15秒，室温放置5分钟。
[0038] (5)向管中加入10 μ L蛋白酶K溶液，颠倒混匀。
[0039] (6)加入25 μ L裂解缓冲液S，颠倒混匀。
[0040] (7)加入250 μ L缓冲液Β，振荡10秒，70°C放置10分钟。12, OOOrpm离心1分钟， 取上清放入一新管中，弃去沉淀。
[0041] (8)加入250 yL无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，瞬时离 心以去除管盖内壁的水珠。
[0042] (9)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中）， 12, OOOrpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。
[0043] (10)向吸附柱中加入500 μ L缓冲液C，12, OOOrpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱 放入收集管中。
[0044] (11)向吸附柱中加入700 μ L漂洗液W2,12, OOOrpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱 放入收集管中。
[0045] (12)向吸附柱中加入500 μ L漂洗液W2,12, OOOrpm离30秒，倒掉废液，将吸附柱 放回收集管中。然后12, OOOrpm离心2分钟。将吸附柱置于一个新的1.5mL离心管中，室 温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0046] (13)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100 μ L 洗脱缓冲液ΤΕ，室温放置2分钟，12, OOOrpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
[0047] 2) PCR条件优化：
[0048] 一、对退火温度和Mg2+同时进行优化。退火温度为6个梯度，49、51、53、55、57、 59°C。Mg 2+浓度为5个梯度，0. 8、1.6、2. 4、3. 2和4. OmM。所述通过聚合酶链式反应检测大 肠杆菌条件优化扩增体系为25 μ L。具体反应体系为：TaqDNA聚合酶0. 125 μ L，10 X聚合 酶缓冲液 2. 5 μ L，dNTP 2 μ L，Mg2+分别为 0. 8、I. 6、2. 4、3. 2 和 4. OmM，模板 1 μ L，上下游引 物各1 μ L，加 CldH2O补足25 μ L。
[0049] 二、在PCR仪中按以下程序扩增：
[0050] (1)预变性
[0051 ] 95 °C 5 分钟
[0052] ⑵3〇个循环：
[0053] 95 〇C 30 秒钟
[0054] 49、51、53、55、57、59°C 30 秒钟
[0055] 72 〇C 20 秒钟
[0056] (3)后扩增
[0057] 72 °C 1 分钟
[0058] 最终确立Mg2+为4. 0M，退火温度为57°C条件为检测的最优化条件。结果如图1所 不O
[0059] 实施例3特异性检测
[0060] 一、收集大肠杆菌临床分离株3株，非大肠杆菌9株。将这些菌株用北京庄盟国际 生物基因科技有限公司的细菌基因组DNA小量提取试剂盒提取基因组，步骤如下：
[0061] (1)取细菌培养液5mL，12, OOOrpm离心1分钟，尽量吸净上清。
[0062] (2)向留有菌体沉淀的离心管中加入500 μ L细胞悬浮液，使用移液器或涡旋振荡 器彻底悬浮细菌细胞沉淀，37°C温浴30分钟。每隔10分钟颠倒混匀数次。12, OOOrpm离心 2分钟，尽量吸净上清。
[0063] (3)向菌体沉淀中加入225 μ L缓冲液A，振荡至菌体彻底悬浮。
[0064] (4)向管中加入6 μ L RNaseA溶液，振荡15秒，室温放置5分钟。
[0065] (5)向管中加入10 μ L蛋白酶K溶液，颠倒混匀。
[0066] (6)加入25 μ L裂解缓冲液S，颠倒混匀。
[0067] (7)加入250 μ L缓冲液Β，振荡10秒，70°C放置10分钟。12, OOOrpm离心1分钟， 取上清放入一新管中，弃去沉淀。
[0068] (8)加入250 μ L无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，瞬时离 心以去除管盖内壁的水珠。
[0069] (9)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中）， 12, OOOrpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。
[0070] (10)向吸附柱中加入500 μ L缓冲液C，12, OOOrpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱 放入收集管中。
[0071] (11)向吸附柱中加入700 μ L漂洗液W2,12, OOOrpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱 放入收集管中。
[0072] (12)向吸附柱中加入500 μ L漂洗液W2,12, OOOrpm离30秒，倒掉废液，将吸附柱 放回收集管中。然后12, OOOrpm离心2分钟。将吸附柱置于一个新的