专利名称：大肠杆菌o157:h7检测方法及其金标快速诊断试剂盒和制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测大肠杆菌0157:H7的方法，以及用于该方法的大肠杆菌 0157:H7金标快速诊断试剂盒和其制备方法。
背景技术：
大肠杆菌是中等大小杆菌，其大小为1 3umX 0. 5 0. 7um,有鞭毛，无芽胞，有的 菌株可行成荚膜，革兰氏染色阴性，需氧或兼性厌氧，生化反应活泼、易于在普通培养基上 增殖，适应性强。此菌对一般消毒剂敏感，对抗生素及磺胺类药等极易产生耐药性。根据抗原不同，已知大肠杆菌有菌体(“0”)抗原170种，表面⑷抗原近103种， 鞭毛(H)抗原60种，因而构成了许多血清型。最近菌毛(F)抗原被用于血清学鉴定，最常见 的血清型K88，K99，分别命名为F4和F5型。在引起人畜肠道疾病的血清型中，有肠致病性 大肠杆菌(简称EPEC)、肠毒素性大肠杆菌(简称ETEC)和肠侵袭性大肠杆菌(简称EIEC) 等之分，多数肠毒素性大肠杆菌都带有F抗原。在170种“0”型抗原血清型中约1/2左右对 禽有致病性，但最多的是01、02、078、035四个血清型。大肠杆菌能分解葡萄糖、麦芽糖、甘 露醇、木糖、甘油、鼠李糖、山梨醇和阿拉伯糖，产酸和产气。多数菌株能发酵乳糖，有部分菌 株发酵蔗糖，产生靛基质，不分解糊精、淀粉、肌醇和尿素。不产生硫化氢，不液化明胶、V P实验阴性，Μ. R试验阴性。肠出血性大肠杆菌0157:Η7是一种新出现的食物传播性疾病的病因。它除引起腹 泻、出血性肠炎外，还可发生溶血性尿毒综合症、血栓性血小板减少性紫癜等严重的并发 症。自1982年美国首次发现因该致病菌引起的食物中毒以来，肠出血性大肠杆菌0157:Η7 疫情开始逐步扩散和蔓延，相继在英国、加拿大、日本等多个国家引起腹泻疾病的爆发和流 行。我国已陆续有十余个省份在市售食品、进口食品、腹泻病患者、家畜家禽等分离到大肠 杆菌 0157: Η7。大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品 卫生工作中。该菌群主要来源于人及温血动物粪便，一般多用来作为食品中的粪便污染指 标。过去我国在大肠杆菌的检验方面经验不多，对该菌群的认识也不够充分。1974年全国 修订食品卫生细菌检验方法座谈会和1976年全国食品卫生标准会议建议以大肠菌群作为 粪便污染指标菌，并提出进行有关大肠菌群方面的科研工作。在这次修订1976年版食品卫 生检验方法的过程中，大肠菌群科研协作组又于1983-1985年对大肠菌群快速检测方法也 进行了研讨，为这次修订国家标准食品卫生检验方法微生物学部分中的大肠菌群测定提供 了科学依据。大肠杆菌0157:Η7感染具有发病急的特点，同时该菌的自然来源非常广泛，而目 前对其致病机制还不是很清楚。虽然近年来相关检测技术取得了很大的进展，但仍然存在 一些缺陷。为此，我公司研发部对大肠杆菌群的检验方法，主要是快速检验方法及其卫生学 意义进行了广泛的科学研究和实践，取得了一定成绩，为进一步研究该菌的快速、准确、灵敏的检测方法，以及对食源性致病菌感染的控制、疾病的诊断和流行病学调查提供了科学 依据。本发明采用大肠杆菌0157:H7免疫家兔或羊，制备多表位抗体，免疫BALB/C小鼠 制备单克隆抗体，研制一种可适用于现场操作的金标快速诊断试剂盒。本试剂盒可特异性 的检测大肠杆菌0157:H7抗原，反应迅速(5-20分钟出结果)，可用于发病现场快速诊断。本发明的公开本发明的第一目的是提供一种大肠杆菌0157:H7的检测方法，该方法为一步检 测法，灵敏度高、特异性强，而且速度快、操作简便，无需专门设备，适用于临床检测、流行病 学调查和场地检疫等多种场合。本发明的第二目的是提供一种大肠杆菌0157:H7金标快速诊断试剂盒。是针对 大肠杆菌0157:H7检测提供的一种简便而且直接的一步法检测试剂盒，利用该试剂盒检测 大肠杆菌0157:H7的灵敏度高、特异性强，反应速度快、操作简便，无需专门设施。本发明的第三目的是提供一种大肠杆菌0157:H7金标快速诊断试剂盒的制备方 法，该方法简便、稳定性好、重复性好。本发明的第一目的可通过如下措施来实现一种大肠杆菌0157:H7检测方法包括下述步骤(1)将胶体金标记的抗大肠杆菌 0157:H7抗体载于玻璃纤维或无纺布载体上，并在与胶体金标记抗体载体相连的检测载体 上包被抗大肠杆菌0157:H7抗体形成的检测线和由羊、兔抗鼠IgG抗体形成的控制线；(2) 取样品稀释液滴于胶体金标记抗体的载体上，如上述稀释液含有大肠杆菌0157:H7则在检 测载体上形成检测线、控制线双线，显双线结果判定为阳性，仅控制线显色结果判定为阴 性。本发明的第二目的可通过如下措施来实现一种大肠杆菌0157: H7金标快速诊断试剂盒内设大肠杆菌0157: H7金标检测卡组 成。检测卡由检测条和塑料卡盒组成，检测条安装在塑料卡内。所述的大肠杆菌 0157:H7金标检测条是在衬板上设有加样端吸水层、检测层和吸水端吸水层，在检测层和 加样端吸水层之间设有金标抗大肠杆菌0157:H7抗体层，在检测层上包被有由抗大肠杆菌 单抗形成的检测线和由羊、兔抗鼠IgG抗体形成的控制线。本发明的第三目的可通过如下措施来实现一种大肠杆菌0157 :H7金标快速诊断试剂盒的制备犯法主要制备金标抗体层和 检测层的控制线、检测线的包被，然后再衬板上组合大肠杆菌0157:H7抗原金标测试条和 检测板。所述的金标抗体层的制备方法包括下述步骤i胶体金的制备，在浓度为 0. 004-0. 010 %的氯金酸中加入其体积的1. 0-1. 8 %浓度为1_3 %的柠檬酸三钠，煮沸 10-20分钟，可得到15-60纳米的胶体金溶液；ii胶体金标记抗大肠杆菌0157:H7抗体， 在胶体金溶液中用0. 2M碳酸钾溶液调pH7. 2-8. 8，按3-8mg/100ml加入大肠杆菌0157 :H7 抗体，搅拌后，再在溶液中按0. 1-0. 6g/100ml加入动物血清蛋白，4°C静置2_4小时；iii 将上述胶体金溶液经2000转/分钟离心10-15分钟，弃沉淀物，收集上清液；iv将上清 液经10000转/分钟离心60-80分钟离心得沉淀物；ν将沉淀物按4-10ml/100ml溶于0. 02M、pH7. 4Tris-HCI缓冲液得胶体金溶液，该缓冲液中含0. 2-0. 6 %的动物血清蛋白和 0.01-0. 06%叠氮钠；vi将胶体金溶液浸入玻璃纤维或无纺布至液体开始渗出为止，37°C 干燥过夜形成金标抗体层。所述的检测层的制备，是在纤维素膜上设有大肠杆菌0157:H7抗体构成的检测线 和有羊、兔抗鼠IgG抗体形成的控制线。其制备方法是浓度为l_2mg/ml的或抗体溶液中 刚加入1-3%的固定剂，再利用喷膜机将抗体喷在纤维素膜上，喷膜后置于37°C干燥，再用 0. 01mlpH7. 0含10%小牛血清的PBS，在37°C下封闭30分钟，0. 01mlpH7. 0的PBS漂洗，37°C 干燥。所述的固定剂选用甲醛、丙酮中的一种。本发明相比现有技术具有如下优点1、本发明检测、诊断大肠杆菌0157:H7的方法为一步法，具有较高的特异性和灵 敏性，且操作简便，无需专门设施。2、本发明的诊断试剂盒检测大肠杆菌0157:H7时具有较高的特异性和灵敏性，检 测过程操作迅速、快捷、方便，适用于临床检验、流行病学调查和场地检疫等多种场合。3、本发明的诊断试剂盒的制备方法简便、稳定性好、重复性好。图面说明
图1是发明检测板的外观结构示意图1-检测板 2-加样孔 3-检视窗图2是本发明检测板内部结构示意图4-加样端吸水层 5-金标抗体层 6-控制线 7-检测线8-检测层 9-吸水端吸水层 10-衬板本发明的实施方式本发明还将结合实施例作进一步详述实施例一一种大肠杆菌0157:H7检测方法包括下述步骤(1)将胶体金标记的抗大肠杆菌 0157:H7抗体载于玻璃纤维或无纺布载体上，并在与胶体金标记抗体载体相连的检测载体 上包被大肠杆菌0157:H7抗体形成的检测线和由羊或兔抗鼠IgG抗体形成的控制线；(2) 取样品稀释液滴于胶体金标记抗体的载体上，如上述提取液含有大肠杆菌0157:H7，则在 检测载体上形成检测线、控制线双线，显双线结果判定为阳性，仅控制线显色结果为阴性。参照图1，一种大肠杆菌0157: H7金标快速诊断试剂盒内设大肠杆菌0157: H7金标 检测卡1。参照图2，所述的大肠杆菌0157 :H7金标检测卡1是在衬板10上设有加样端吸水 层4、检测层8和吸水层9，在检测层和加样端吸水层4之间设有金标大肠杆菌0157:H7抗 体层5，在检测层8上包被有检测线7和控制线6。其中加样端吸水层4和吸水端吸水层9 由多层滤纸制成；检测层8为纤维素膜，该纤维素膜可为硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜；金 标抗体层为玻璃纤维或无纺布浸取胶体金标记抗体制成。一种大肠杆菌0157:H7金标快速诊断试剂盒的制备方法主要包括制备金标抗体 层( 和检测层(8)的控制线(6)、检测线(7)的包被，然后再衬板(10)上组合大肠杆菌 0157 :H7金标测试条和检测卡(1)。在塑料垫板10的两端分别粘贴加样端吸水纸层4与吸水端吸水层9 ；在其中段粘贴包被检测线和控制线的纤维素膜层8，在加样端吸水纸层4与 纤维素膜层8的交接部位，夹贴含金标抗体层5的玻璃纤维，玻璃纤维的4/5部分在加样端 吸水纸层4中间，1/5部分在纤维素膜层8上。然后按4毫米宽、8厘米长规格切条，再组装 于塑料盒内。盒盖上加样孔2正对测试条的加样端吸水纸层4，观察孔3正对纤维素膜的检 测层8。所述的金标抗体层5的制备方法包括下述步骤i胶体金的制备，取IOOmg氯金 酸溶于IOOOml三蒸水中，加入15ml、浓度为的柠檬酸三钠，煮沸15分钟，冷却后得到 15-50纳米的胶体金溶液；ii胶体金标记大肠杆菌0157:H7抗体，取IOOml胶体金溶于，用 0. 2M碳酸钾溶于调pH8. 4，加入6mg大肠杆菌0157 H7抗体，搅拌20分钟，再加入MOmg牛 血清白蛋白，继续搅拌5分钟，4°C静置2-4小时；iii将上述胶体金溶于经2000转/分钟 离心10分钟，弃沉淀物，收集上清液；iv将上清液经10000转/分钟离心60分钟离心得沉 淀物；ν将沉淀物按^iVlOOml溶于0. 02M、pH7. 4Tris-HCI缓冲液得胶体金溶于，该缓冲液 中含0. 25%的牛血清白蛋白和0. 02%叠氮钠；vi将胶体金溶于浸入玻璃纤维或无纺布至 液体开始渗出为止，在37°C下2小时干燥而形成金标抗体层5。所述胶体金标记抗体为羊、 兔抗大肠杆菌0157:H7抗体。所述的检测层8是在硝酸纤维素膜上设有大肠杆菌0157:H7抗体构成的检测线7 和由羊或兔抗鼠IgG抗体形成的质控线6。其制备方法是取抗大肠杆菌0157:H7抗体，调 浓度为lmg/ml，加入2%的甲醛，用喷膜机在纤维素膜中段喷检测线7;再取羊或兔抗鼠IgG 调浓度为2mg/ml，加入2%甲醛，用喷膜机在纤维素膜中段，距检测线05cm处，喷控制线6， 按20ul/10cm设置喷膜量，喷膜后置于37°C干燥2小时，再用0. 01mlpH7. 0含10%小牛血 清的PBS，在37 °C下封闭30分钟，0. 01mlpH7. 0的PBS漂洗，37 °C干燥。实施例二大肠杆菌0157:H7检测方法及其金标快速诊断试剂盒与例一同。该试剂盒的制备方法除制备胶体金的抗体为抗大肠杆菌0157:H7单克隆抗体外， 其他条件与例一同。
权利要求
1.一种大肠杆菌0157:H7检测方法，其特征在于(1)将胶体金标记的大肠杆菌 0157:H7抗体载于玻璃纤维或无纺布载体上，并在与胶体金标记抗体载体相连的检测载体 上包被抗大肠杆菌0157:H7抗体(多抗或单抗)形成的检测线和由羊或兔抗鼠IgG抗体形 成的控制线；( 取检测样本稀释液滴于胶体金标记的载体上，如上述稀释液含有大肠杆 菌0157:H7，则在检测载体上形成检测线和控制线双线，显双线结果判定为阳性，仅控制线 显色结果判定为阴性。
2.一种大肠杆菌0157:H7金标快速诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒内设大肠杆菌 0157:H7金标检测卡，检测卡由检测条和塑料卡盒组成检测条安装在塑料卡内。
3.如权利要求2所述的大肠杆菌0157:H7金标快速诊断试剂卡，其特征在于所述的 大肠杆菌0157:H7金标检测卡(1)是在衬板(10)上设有加样端吸水层G)、检测层(8)和 吸水端吸水层(9)，在检测层(8)和加样端吸水层(4)之间设有金标大肠杆菌0157:H7抗体 层(5)，在检测层(8)上包被有检测线(7)和控制线(6)。
4.如权利要求2所述的大肠杆菌0157:H7金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在 于制备金标抗体层(5)和检测层(8)的控制线(6)、检测线(7)的包被，然后在衬板(10)上 粘贴大肠杆菌0157 :H7抗原金标测试条和检测卡(1)。
5.如权利要求4所述的大肠杆菌0157:H7金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在 于所述的金标抗体层(5)的制备方法包括下述步骤i胶体金的制备，在浓度为0.004 0.012%的氯金酸中加入其体积的1.0 1.8%、浓度为1 3%的柠檬酸三钠，煮沸10 20分钟，可得到15 50纳米的胶体金溶液；ii胶体金标记抗大肠杆菌0157:H7单克隆抗 体，在胶体金溶液中用0. 2m碳酸钾溶液调pH7. 2 8. 8，按4 12mg/100ml加入抗人大肠 杆菌0157:H7单克隆抗体，搅拌后，再在溶液中按0. 1 0. 6g/100ml加入动物血清蛋白， 4°C静置2-4小时；iii将上述胶体金溶液经2000转/分钟离心10 15分钟，弃沉淀物， 得上清液；iv将上清液经10000转/分钟离心60 80分钟离心得沉淀物；ν将沉淀物按 4-10ml/100ml溶于0. 02M、pH7. 4Tris_HCI缓冲液得胶体金溶液，该缓冲液中含0. 2-0. 6% 的动物血清蛋白和0. 01-0. 06%叠氮钠；vi将上述胶体金溶液浸入玻璃纤维或无纺布至液 体开始渗出为止，37°C干燥过滤形成金标抗体层。
6.如权利要求4或5所述的大肠杆菌0157:H7金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特 征在于所述胶体金标记抗体为羊或兔抗大肠杆菌0157 H7抗体或大肠杆菌0157 H7单克隆 抗体。
7.如权利要求4所述的大肠杆菌0157:H7金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征 在于所述的检测层(8)是在纤维素膜上设有羊或兔抗大肠杆菌0157:H7抗体和大肠杆菌 0157:H7单克隆抗体构成的检测线(7)和抗羊或兔鼠IgG抗体体形成的控制线(6)。
8.如权利要求7所述的大肠杆菌0157:H7金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在 于所述的固定剂为甲醛或丙酮。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测大肠杆菌O157:H7的方法，以及用于该方法的金标快速诊断试剂盒和其制备方法，其检测方法包括(1)将胶体金标记的抗大肠杆菌O157:H7菌抗体载于玻璃纤维或无纺布载体上，并在与胶体金标记抗体载体相连的检测载体上包被抗大肠杆菌O157:H7抗体形成的检测线和由羊、兔抗鼠IgG抗体形成的控制线；(2)取样品稀释液滴于胶体金标记抗体的载体上，如上述稀释液含有大肠杆菌O157:H7，则在检测载体上形成检测线和控制线双线，结果判定为阳性；仅控制线显色，结果判定为阴性。该试剂盒由检测卡组成，检测卡由检测条和塑料卡盒组成，检测条安装在塑料卡内，检测条是在衬板上设有加样端吸水层、检测层和吸水端吸水层，在检测层和加样端吸水层之间设有金标大肠杆菌O157:H7抗体层，在检测层上包被有由抗大肠杆菌O157:H7单抗形成的检测线和由羊、兔抗鼠IgG抗体形成的控制线。
文档编号G01N33/569GK102135538SQ20101027292
公开日2011年7月27日 申请日期2010年9月3日 优先权日2010年9月3日
发明者周海飞, 张远兴, 李克生, 李志远, 杜惠芬, 郑悦, 马国荣 申请人:李克生