专利名称：金黄色葡萄球菌检测方法及其金标快速诊断试剂盒和制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测金黄色葡萄球菌的方法，以及用于该方法的金黄色葡萄 球菌金标快速诊断试剂盒和制备方法。
背景技术：
金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可 找到金黄色葡萄球菌。因此，食品受其污染的机会很多。近年来，美国疾病控制中心报告显 示，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素的检 测是世界性的卫生难题。在美国，由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性 食物中毒的33%，加拿大则更多，占到45%，而我国每年发生的此类中毒事件也非常多。金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点金黄色葡萄球菌的感染多见于春夏 两季；中毒食品种类多如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，因食剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉 等引起的金黄色葡萄球菌中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率高达83%，所 以人、畜化脓性感染部位，常成为污染源。一般情况，经黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品i因食品加工人员、炊事员 或销售人员带菌，而造成食品污染；ii食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污 染，产生了肠毒素，引起食物中毒；iii熟食制品包装部密封，或运输过程中所引起的污染 iv因奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其它部位的污染。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌。它可引起局部化脓感染，也 可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。同时，该菌的自然来 源非常广泛，并且目前对其致病机制还不是很清楚。传统的检测方法主要有动物试验、血清 学试验、免疫荧光检测试验及酶联免疫吸附等方法。虽然近年来相关检测技术取得了很大 的进展，但仍然存在一些缺陷。所以，进一步研究该菌的快速、准确、灵敏的检测方法对食源 性致病菌感染的控制、疾病的诊断和流行病学调查非常关键。本发明采用金黄色葡萄球菌免疫家兔或羊制备多表位抗体，免疫BALB/C小鼠制 备单克隆抗体，研制一种可适用于现场操作的金标快速诊断试剂盒。本试剂盒可快速(5-20 分钟出结果)特异性的检测出金黄色葡萄球菌，可用于发病现场快速诊断。本发明的公开本发明的第一目的是提供一种金黄色葡萄球菌的检测方法。该方法为一步检测 法，灵敏度高、特异性强，反应速度快、操作简便，无需专门设备。该试剂盒可用于临床检测、 流行病学调查和场地检疫等多种场合。本发明的第二目的是提供一种金黄色葡萄球菌金标快速诊断试剂盒。该试剂盒 针对金黄色葡萄球菌检测，提供一种简便而且直接的一步法检测试剂盒。利用该试剂盒检 测金黄色葡萄球菌的灵敏度高、特异性强，反应速度快、操作简便，无需专门设备。本发明的第三目的是提供一种金黄色葡萄球菌金标快速诊断试剂盒的制备方法。该方法操作简便、稳定性好、重复性好。本发明的第一目的可通过如下措施来实现一种金黄色葡萄球菌检测方法包括以下步骤(1)将胶体金标记的抗金黄色葡萄 球菌抗体，包括多抗或单抗载于玻璃纤维或无纺布载体上，然后与胶体金标记抗体载体相 连，检测载体上包被抗金黄色葡萄球菌抗体(单抗和多抗)形成的检测线和由羊、兔抗鼠 IgG抗体形成的控制线；( 取样品稀释液滴于胶体金标记抗体的载体上。如上述稀释液含 有金黄色葡萄球菌，则在检测载体上出现紫红色检测线和控制线双线，该检测结果判定为 阳性，若仅有一条红色质控线，则检测结果为阴性。本发明的第二目的可通过如下措施来实现一种金黄色葡萄球菌金标快速诊断试剂盒，内设金黄色葡萄球菌金标检测卡组 成。检测卡由检测条和塑料卡盒组成，检测条安装在塑料卡内。所述的金黄色葡萄球 菌金标检测条是在衬板上设有加样端吸水层、检测层和吸水端吸水层，在检测层和加样端 吸水层之间设有金标抗金黄色葡萄球菌抗体层，在检测层上包被有由抗金黄色葡萄球菌多 抗或单抗形成的检测线和由羊、兔抗鼠IgG抗体形成的控制线。本发明的第三目的可通过如下措施来实现一种金黄色葡萄球菌金标快速诊断试剂盒的制备方法；主要包括制备金标抗体层 和检测层的控制线和检测线。然后再衬板上组合金黄色葡萄球菌金标测试条和检测板。所述的金标抗体层的制备方法包括下述步骤i胶体金的制备；在浓度为 0. 006-0. 012%的氯金酸中加入其体积的1. 5-2%、浓度为的柠檬酸三钠，煮沸10-20 分钟，可得到15-50纳米的胶体金溶液；ii胶体金标记抗金黄色葡萄球菌抗体在胶体金溶 液中用0. 2M碳酸钾溶液调pH7. 8-8. 8，按Hmg/lOOml加入金黄色葡萄球菌抗体，搅拌后 在溶液中加入浓度为0. 1-0. 6G/100ml的动物血清蛋白，4°C静置2_4小时；iii将上述胶 体金溶液经2000转/分钟离心10-15分钟，弃沉淀物，收集上清液；iv将上清液经10000 转/分钟离心60-80分钟，离心得沉淀物；ν将沉淀物溶于0. 02M、pH7. 4Tris-HCI的体积 为4-10ml的缓冲液，得胶体金溶液。该缓冲液中含体积比为0. 2-0. 6%的动物血清蛋白和 0. 01-0. 06%叠氮钠；Vi将玻璃纤维或无纺布浸入胶体金溶液至液体渗出为止，37°C干燥 过夜形成金标抗体层。所述的检测层的制备，是在硝酸纤维素膜上设有金黄色葡萄球菌抗 体构成的检测线和有羊、兔抗鼠IgG抗体形成的控制线。其制备方法是在浓度为1-ang/ ml的抗体溶液中加入1-3%的固定剂，再利用喷膜机将抗体喷在纤维素膜上，喷膜后37°C 干燥。然后用0. 01M、pH7. O含10%小牛血清的PBS。在37°C下封闭30分钟，0. 01M、pH7. O 的PBS漂洗，37 °C干燥。所述的固定剂选用甲醛、丙酮中的一种。本发明相比现有技术具有如下优点1、本发明检测、诊断金黄色葡萄球菌的方法为一步法。具有较高的特异性和灵敏 性，且操作简便，无需专门设备与设施。2、本发明的诊断试剂盒检测金黄色葡萄球菌时具有较高的特异性和灵敏性。检测 过程操作迅速、快捷、方便，本试剂盒适用于临床检验、流行病学调查和场地检疫等多种场合。
3.本发明的诊断试剂盒的制备方法简便、稳定性好、重复性好。图面说明
图1是发明检测板的外观结构示意图1-检测板 2-加样孔 3-检视窗图2是本发明检测板的内部结构示意图4-加样端吸水层 5-金标抗体层 6-控制线 7-检测线8-检测层 9-吸水端吸水层 10-衬板本发明的实施方式本发明还将结合实施例作进一步详述实施例一一种金黄色葡萄球菌检测方法包括以下步骤(1)将胶体金标记的抗金黄色葡萄 球菌抗体载于玻璃纤维或无纺布载体上，将胶体金标记的抗体载体相连的检测载体上，并 在与胶体金标记抗体载体相连的检测载体上包被金黄色葡萄球菌抗体形成的检测线和由 羊、兔抗鼠IgG抗体形成的控制线；( 取样品稀释液滴于胶体金标记抗体的载体上，如上 述稀释液含有金黄色葡萄球菌，则在检测载体上形成紫红色检测线、控制线双线；显双线结 果判定为阳性，仅控制线显色结果判定为为阴性。参照图1，一种金黄色葡萄球菌金标快速诊断试剂盒，内设金黄色葡萄球菌抗标检 测卡1。参照图2，本权利要求书中说书的金黄色葡萄球菌金标检测卡1，是在衬板10上设 有加样端吸水层4、检测层8和吸水端吸水层9。在检测层和加样端吸水层9之间设有金标 金黄色葡萄球菌抗体层5，在检测层8上包被有检测线7和控制线6。其中加样端吸水层4 和吸水端吸水层9是由多层滤纸制成；检测层8为纤维素膜，纤维素膜可为硝酸纤维素膜、 醋酸纤维素膜；金标抗体层为玻璃纤维或无纺布浸取胶体金标记抗体制成。一种金黄色葡萄球菌金标快速诊断试剂盒的制备方法主要包括制备金标抗体层 (5)和检测层(8)、控制线(6)和检测线(7)的包被，然后再衬板(10)上组合金黄色葡萄球 菌金标测试条和检测卡(1)。在塑料垫板10的两端分别粘贴加样端吸水层4和吸水端吸 水层9 ；在其中段粘贴包被检测线和控制线的纤维素膜层8，在加样端吸水层4与纤维素膜 层8的交接部位，夹贴含金标抗体5的玻璃纤维，玻璃纤维的4/5部分在加样端吸水层4中 间，1/5部分在纤维素膜层8上。然后按4毫米宽、8厘米长规格切条，在组装于塑料盒内。 盒盖上加样孔2正对测试条的加样端吸水层4，观察孔3正对纤维素膜的检测层8。所述的金标抗体层的制备方法包括下述步骤i胶体金的制备取IOOmg氯金酸溶 于IOOOml三蒸水中，然后加入15ml、浓度为的柠檬酸三钠，煮沸15分钟，冷却后得到 15-50纳米的胶体金溶液；ii胶体金标记金黄色葡萄球菌抗体；量取IOOml胶体金溶液，用 0. 2ml碳酸钾溶液调pH8. 6，加入^ig金黄色葡萄球菌抗体，搅拌20分钟，然后加入MOmg 牛血清白蛋白，继续搅拌5分钟，4°C静置2-4小时；iii将上述胶体金溶液经2000转/分 钟离心10分钟，弃沉淀物，收集上清液；iv将上清液经10000转/分钟离心60分钟，收集 沉淀物；ν将沉淀物按4-10ml/100ml溶于0. 02M、pH7. 4Tris_HCI缓冲液得胶体金溶液，该 缓冲液中含0. 25%的牛血清白蛋白和0. 02%叠氮钠；vi将玻璃纤维或无纺布浸入胶体金 溶液至其表面有液体渗出为止；在37°C下干燥2小时而形成金标抗体层5。本权利要求书所述胶体金标记抗体为羊、兔抗金黄色葡萄球菌抗体。所述的检测层8是在硝酸纤维素膜上设有金黄色葡萄球菌抗体构成的检测线7和 有羊或兔抗鼠IgG抗体形成的控制线6。其制备方法是取抗金黄色葡萄球菌抗体，调浓度至 lmg/ml，加入2%的甲醛，用喷膜机在纤维素膜中段喷检测线7;再取兔、羊抗鼠IgG，然后调 浓度至2mg/ml，再加入2%的甲醛。用喷膜机在纤维素膜中段，距检测线0. 5cm处，喷控制 线6，按ul/lOcm设置喷膜量，喷膜后置于37°C干燥2小时，再用0. 01M、pH7. O含10%小牛 血清的PBS，在37°C下封闭30分钟，0. 01M、pH7. O的PBS漂洗，37 °C干燥。实施例二 金黄色葡萄球菌检测方法及其金标快速诊断试剂盒与例一同。该试剂盒的制备方法除制备胶体金标记的抗体为抗金黄色葡萄球菌单克隆抗体 外，其他条件与例一同。
权利要求
1.一种金黄色葡萄球菌检测方法，其特征在于(1)将胶体金标记的金黄色葡萄球菌 抗体载于玻璃纤维或无纺布载体上，并与胶体金标记抗体载体相连的检测载体上包被抗金 黄色葡萄球菌抗体(多抗或单抗)，所形成的检测线和由羊或兔抗鼠IgG抗体形成的控制 线。( 取检测样本稀释液滴于胶体金标记抗体的载体上。如果被检测物含有金黄色葡萄 球菌则含在检测载体上形成检测线和控制线双线，则检测结果判定为阳性，若仅有控制线 显色则检测结果为阴性。
2.一种金黄色葡萄球菌金标快速诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒内设金黄色葡萄球 菌金标检测卡，检测卡由检测条和塑料卡盒组成，检测条安装在塑料卡内。
3.如权利要求2所述的金黄色葡萄球菌金标快速诊断试剂卡，其特征在于所述的金黄 色葡萄球菌抗原金标检测卡(1)是在衬板(10)上设有加样端吸水层G)、检测层(8)和吸 水端吸水层(9)，在检测层(8)和加样端吸水层(4)之间设有金标金黄色葡萄球菌抗体层 (5)，在检测层(8)上包被有检测线(7)和控制线(6)。
4.如权利要求( 所述的金黄色葡萄球菌金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在 于制备金标抗体层(5)和检测层(8)的控制线(6)、检测线(7)的包被，然后在衬板(10)上 组合金黄色葡萄球菌金标测试条和检测卡(1)。
5.如权利要求4所述的金黄色葡萄球菌金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在 于所述的金标抗体层(5)的制备方法包括下述步骤i胶体金的制备，在浓度为0.006 0. 012%的氯金酸中加入其体积的1. 5 2%、浓度为1 3%的柠檬酸三钠，煮沸10 20 分钟，可得到15 50纳米的胶体金溶液；ii胶体金标记抗金黄色葡萄球菌单克隆抗体，在 胶体金溶液中用0. 2m碳酸钾溶液调pH7. 8 8. 8，按1 ％ig/100ml加入抗人金黄色葡萄 球菌单克隆抗体，搅拌后，再在溶液中按0. 1 0. 6g/100ml加入动物血清蛋白，4°C静置2_4 小时；iii将上述胶体金溶液经2000转/分钟离心10 15分钟，弃沉淀物，得上清液；iv 将上清液经10000转/分钟离心60 80分钟离心得沉淀物；ν将沉淀物按4-10ml/100ml 溶于0. 02M、pH7. 4Tris-HCI缓冲液得胶体金溶液，该缓冲液中含0. 2-0. 6%的动物血清蛋 白和0. 01-0. 06%叠氮钠；vi将上述胶体金溶液浸入玻璃纤维或无纺布至液体开始渗出为 止，37 °C干燥过滤形成金标抗体层。
6.如权利要求4或5所述的金黄色葡萄球菌金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征 在于所述胶体金标记抗体为羊或兔抗金黄色葡萄球菌抗体或金黄色葡萄球菌单克隆抗体。
7.如权利要求4所述的金黄色葡萄球菌金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于 所述的检测层(8)是在纤维素膜上设有羊或兔金黄色葡萄球菌抗体或金黄色葡萄球菌单 克隆抗体构成的检测线(7)和由抗羊或兔抗鼠IgG抗体形成的控制线(6)。
8.如权利要求7所述的金黄色葡萄球菌金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于 所述的固定剂为甲醛或丙酮。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测金黄色葡萄球菌的方法，以及用于该方法的金标快速诊断试剂盒和其制备方法，其检测方法包括(1)将胶体金标记的抗金黄色葡萄球菌抗体载于玻璃纤维或无纺布载体上，并在与胶体金标记抗体载体相连的检测载体上包被抗金黄色葡萄球菌抗体形成的检测线和由羊、兔抗鼠IgG抗体形成的控制线；(2)取样品稀释液滴于胶体金标记抗体的载体上，如上述稀释液含有金黄色葡萄球菌，则在检测载体上形成检测线和控制线双线，结果判定为阳性；仅控制线显色，结果判定为阴性。该试剂盒由检测卡组成，检测卡由检测条和塑料卡盒组成，检测条安装在塑料卡内，检测条是在衬板上设有加样端吸水层、检测层和吸水端吸水层，在检测层和加样端吸水层之间设有金标金黄色葡萄球菌抗体层，在检测层上包被有由抗金黄色葡萄球菌单抗形成的检测线和由羊、兔抗鼠IgG抗体形成的控制线。
文档编号G01N33/543GK102135540SQ201010272889
公开日2011年7月27日 申请日期2010年9月3日 优先权日2010年9月3日
发明者周海飞, 张远兴, 李克生, 李志远, 杜惠芬, 郑悦, 马国荣 申请人:李克生