一种大肠杆菌的检测试剂盒及其检测方法

一种大肠杆菌的检测试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种大肠杆菌的检测试剂盒及其检测方法，属于生物检测【技术领域】。该试剂盒包括月桂胰蛋白培养液、酶底物溶液、酶诱导剂和细胞裂解缓冲液，所述月桂胰蛋白培养液的成分包括：胰蛋白、乳糖、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、十二烷基硫酸钠，该大肠杆菌的检测方法以荧光仪配合检测试剂盒进行实时检测。该检测试剂盒及其检测方法能够准确、快速地检测大肠杆菌。
【专利说明】一种大肠杆菌的检测试剂盒及其检测方法

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测【技术领域】，具体涉及一种大肠杆菌的检测试剂盒及其检测方 法。

【背景技术】
[0002] 大肠杆菌（E. Coli)是一种生活在人类或动物消化道的细菌，它有多种类型，其 中大多数是无害的。但有些可能会导致血性腹泻。最知名的大肠杆菌类型是0157 :H7型， 该菌种会产生强烈的毒素，可能会导致严重贫血或肾功能衰竭，甚至死亡。因此准确、快速 地检测大肠杆菌具有十分重要的意义。
[0003] 传统的培养法检测大肠杆菌存在周期长（至少48小时以上），操作烦琐、灵敏度 低、易污染、程序复杂和所需试剂（生化试验试剂和血清）繁多等缺点，已远远不能满足快 速检测大肠杆菌的要求。


【发明内容】

[0004] 解决的技术问题：本发明的目的是克服传统的培养法检测大肠杆菌技术的不足而 提供一种准确、快速地检测大肠杆菌的检测试剂盒及其检测方法。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下： 本发明公开了一种大肠杆菌的检测试剂盒，所述试剂盒包括月桂胰蛋白培养液、酶底 物溶液、酶诱导剂和细胞裂解缓冲液，所述月桂胰蛋白培养液的成分包括：胰蛋白、乳糖、氯 化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、十二烷基硫酸钠，所述酶诱导剂为异丙基β-D-I-硫代半 乳糖苷（IPTG)，所述酶底物溶液为4-甲基伞形酮-B-D-葡糖苷酸，所述细胞裂解缓冲液为 鸡蛋白溶菌酶（HEWL)。
[0006] 所述月桂胰蛋白培养液的各成分浓度分别为： 胰蛋白：20. Og/L 乳糖：5. Og/L 氯化钠：5. Og/L 磷酸氢二钾：2. 75g/L 磷酸二氢钾：2. 55g/L 十-烧基硫酸纳：〇. lg/L。
[0007] 所述月桂胰蛋白培养液的PH值为6. 6?7. 0。
[0008] 所述试剂盒还包括无菌水。
[0009] 所述月桂胰蛋白培养液、酶底物溶液、酶诱导剂、细胞裂解缓冲液、无菌水的体积 含量如下： 月桂胰蛋白培养液 1毫升/管 酶底物溶液 1毫升/管 酶诱导剂 1毫升/管 细胞裂解缓冲液 1毫升/管 无菌水 1毫升/管。
[0010] 应用上述大肠杆菌的检测试剂盒进行大肠杆菌的检测方法一包括步骤： 步骤一、取一大试管，并在其中滴入0. 5毫升无菌水，并滴入1滴酶诱导剂； 步骤二、取一棉签，用棉签末端取样，并置于上述大试管内，混合形成待测液； 步骤三、取一小试管，在其内滴入3滴细胞裂解缓冲液； 步骤四、用微量移液枪或一次性移液枪头从上述大试管取200微升待测液滴入小试 管，充分混合，密封，并在环境温度下等待5?10分钟； 步骤五、在上述小试管内滴入2滴酶底物溶液，充分混合； 步骤六、用微量移液枪或一次性移液枪头从上述小试管取200微升待测液滴入荧光检 测用样品试管，密封，在环境温度下等待3?5分钟； 步骤七、将荧光检测用样品试管置于荧光仪的样品测试室内，并密封； 打开荧光仪的测试模式，记录第一次测试数值P1 ; 等待20分钟，再次测试，记录第二次测试数值P2 ; 若测试值P2- P1 > 60,则样品为阳性； 若测试值P2- P1 < 60,则样品为阴性； 若测试值P2- P1接近60,则再等待20?60分钟，再次测试，获得新的P2 ; 所述酶诱导剂为异丙基β-D-I-硫代半乳糖苷（IPTG)，所述细胞裂解缓冲液为鸡蛋白 溶菌酶（HEWL)，所述酶底物溶液为4-甲基伞形酮-B-D-葡糖苷酸。
[0011] 应用上述大肠杆菌的检测试剂盒进行大肠杆菌的检测方法二包括步骤： 步骤一、取一大试管，并在其中滴入0. 5毫升上述的月桂胰蛋白培养液，并滴入1滴酶 诱导剂； 步骤二、取一棉签，用棉签末端取样，并置于上述大试管内，混合形成待测液； 步骤三、将上述待测液置于38. 5°C的恒温箱中培养3?5小时； 步骤四、取一小试管，在其内滴入3滴细胞裂解缓冲液； 步骤五、用微量移液枪或一次性移液枪头从上述大试管取200微升待测液滴入小试 管，充分混合，密封，并在环境温度下等待5?10分钟； 步骤六、在上述小试管内滴入2滴酶底物溶液，充分混合； 步骤七、用微量移液枪或一次性移液枪头从上述小试管取200微升待测液滴入荧光检 测用样品试管，密封，在环境温度下等待3?5分钟； 步骤八、将荧光检测用样品试管置于荧光仪的样品测试室内，并密封； 打开荧光仪的测试模式，记录第一次测试数值P1 ; 等待20分钟，再次测试，记录第二次测试数值P2 ; 若测试值P2- P1 > 80,则样品为阳性； 若测试值P2- P1 < 80,则样品为阴性； 若测试值P2- P1接近80,则再等待20?60分钟，再次测试，获得新的P2。
[0012] 所述月桂胰蛋白培养液的PH值为6. 6?7. 0。
[0013] 所述酶诱导剂为异丙基β -D-I-硫代半乳糖苷（IPTG)，所述细胞裂解缓冲液为鸡 蛋白溶菌酶（HEWL)，所述酶底物溶液为4-甲基伞形酮-B-D-葡糖苷酸。
[0014] 本发明的大肠杆菌的检测试剂盒利用待检测大肠杆菌中存在的特征生物酶，水解 该酶的底物而产生荧光，再利用手持式荧光仪读取荧光值来快速准确鉴定该大肠杆菌的存 在。
[0015] 本发明的有益效果为： 本发明大肠杆菌检测试剂盒检测样品，仅需1小时(不需培养细菌状况）或6个左右小 时(需培养细菌状况）即可完成检测，方法简单，准确度高；同时，采用荧光检测大肠杆菌特 异性较强，有效克服了大肠杆菌传统培养法中存在的周期长、操作烦琐、灵敏度低、易污染、 程序复杂和所需试剂（生化试验试剂和血清）繁多等缺点。

【专利附图】

【附图说明】
[0016] 图1为本发明检测大肠杆菌的实施例的检测方法的流程图； 图2本发明检测大肠杆菌的实施例所用的手持式荧光仪的内部模块的示意图； 图3为图2的光学模块结构示意图； 其中，光源1 光学模块2 透镜一 2. 1 滤光片一 2. 2 光阑一 2. 3 光阑二2. 4 透镜二2. 5 滤光片二2. 6 滤光片三2. 7 透镜三2. 8 光学探测器3 分析处理模块4 CPU电路4. 1 放大器一 4. 2 放大器二4. 3 数模转换电路4. 4 触摸屏电路4. 5 显示电路4. 6 USB电路4. 7 样品试管5。

【具体实施方式】
[0017] 现将在下文中参照附图更加充分地描述本发明，在附图中示出了本发明的示例性 实施例，从而本公开将本发明的范围充分地传达给本领域的技术人员。然而，本发明可以以 许多不同的形式实现，并且不应被解释为限制于这里阐述的实施例。
[0018] 本发明实施例开发并提供了一种大肠杆菌的检测试剂盒，该试剂盒包括月桂胰蛋 白培养液、酶底物溶液、酶诱导剂、细胞裂解缓冲液和无菌水，其中，月桂胰蛋白培养液的成 分包括：胰蛋白、乳糖、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、十二烷基硫酸钠，酶诱导剂采用异 丙基β -D-I-硫代半乳糖苷（IPTG)，酶底物溶液为4-甲基伞形酮-B-D-葡糖苷酸，以鸡蛋 白溶菌酶（HEWL)作为细胞裂解缓冲液。
[0019] 上述月桂胰蛋白培养液、酶底物溶液、酶诱导剂、细胞裂解缓冲液、无菌水的体积 含量优选如下： 月桂胰蛋白培养液 25毫升/管 酶底物溶液 1毫升/管 酶诱导剂 1毫升/管 细胞裂解缓冲液 1毫升/管 无菌水 1毫升/管。
[0020] 本发明大肠杆菌的检测试剂盒具有快速、灵敏、安全等优点。
[0021] 优选地，作为本发明的实施例，上述月桂胰蛋白培养液的各成分浓度分别为： 胰蛋白：20. Og/L 乳糖：5. Og/L 氯化钠：5. Og/L 磷酸氢二钾：2. 75g/L 磷酸二氢钾：2. 55g/L 十-烧基硫酸纳：〇. lg/L。
[0022] 本发明实施例进一步提供了一种大肠杆菌的检测方法--荧光检测方法。荧光检 测已经被广泛应用于生物、化学、医药、食品安全等行业，它是生物DNA检测与排序、化学分 子及材料组分识别、医学癌细胞诊断中的必不可少的检测手段。针对该检测方法，本发明提 供了一手持式荧光仪，使用360nm的短波，该荧光仪的正面设有带盖的样品测试室和触控 显示屏，在样品测试室内可容纳一个垂直放置的荧光检测用样品试管5,如图2和图3所示， 检测时，承有检测液的荧光检测用样品试管5插入样品测试室内，盖上盖子即可进行测试。
[0023] 具体地，手持式荧光仪包含有光源1、光学模块2、光学探测器3和分析处理模块4， 如图2所示。光源1由LED作为激发光源，其中光源1置于光学模块2前方，光学探测器3 置于光学模块2后方，检测时，样品试管5置于光学模块2中，光源1发出的光经光学模块 2后由光学探测器3接收，光学探测器3与分析处理模块4相连，将检测到的荧光信号传输 至分析处理模块4进行分析。
[0024] 光学模块2由激发模块和接收模块构成，如图3所示，激发模块和接收模块的光学 系统共焦设置，其中激发模块依次设置有透镜一 2. 1、滤光片一 2. 2和光阑一 2. 3,接收模块 依次设置有光阑二2. 4、透镜二2. 5、滤光片二2. 6、滤光片三2. 7和透镜三2. 8,且透镜一 2. 1置于光源1前方，透镜三2. 8置于光学探测器3前方。
[0025] 由激发光源LED发出的光经由透镜一 2. 1汇聚到样品试管5中，激发光到达样品 之前需先通过一个短通或带通滤光片一 2. 2和光阑一 2. 3,滤光片一 2. 2的作用是将激发光 中与样品荧光光谱成分重合的部分滤掉，只透过能够对样品有效激发的光谱成分；光阑一 2. 3的作用是在空间上对激发光进行约束，避免激发光照射到试管壁较大的范围内，从而产 生散射光对测量结果造成影响。
[0026] 在激发光作用下，由样品发出的荧光经由光阑二2. 4、透镜二2. 5、滤光片二2. 6、 滤光片三2. 7和透镜三2. 8后，最后到达探测器3 ;光阑二2. 4的作用是将源自试管壁上的 散射光和突光去除掉，只通过源自样品的突光，透镜二2. 5与透镜一 2. 1形成一个折转90 度的共焦系统，它们焦点在样品内重合，从而达到高效率的荧光成分的收集，经透镜二2. 5 准直后的荧光再依次通过滤光片二2. 6和滤光片三2. 7,其作用是将激发光去掉，而只透过 荧光成分，即可选用长通滤光片或带通滤光片；透过滤光片二2. 6和滤光片三2. 7的荧光 由透镜三2. 8汇聚到探测器3上，探测器3将检测到的信号传输至分析处理模块4进行处 理。
[0027] 分析处理模块4包含有CPU电路4. 1、放大器一 4. 2、放大器二4. 3、数模转换电路 4. 4、触摸屏电路4. 5、显示电路4. 6和USB电路4. 7,如图2所示，光学探测器3经放大器一 4. 2与CPU电路4. 1相连，所述CPU电路4. 1经数模转换电路4. 4与放大器二4. 3相连，所 述放大器二4. 3与光源1相连，对光源1进行调控，所述触摸屏电路4. 5、显示电路4. 6和 USB电路4. 7均与CPU电路4. 1相连，完成相应的人机对话功能。
[0028] 该手持式突光仪，由于透镜二2. 5与透镜一 2. 1形成一个共焦系统，从而使得样 品发出的荧光能够被最大化的收集；同时样品与探测器3分别相对于透镜二2. 5和透镜三 2. 8呈对称结构，都处于透镜的焦点上，这种结构能够保证样品发出的荧光平行透过滤光片 二2. 6和滤光片三2. 7。这样就消除了由于入射角不同会带来干涉滤光片通光波长位移的 缺点，提1? 了检测精度。
[0029] 另外，当样品在低浓度的情况下，仅有几个CFU的细菌时，荧光发射可能会极微 弱，外界环境光的干扰将会极其严重，此时，该手持式荧光仪通过分析处理模块对光源行调 制，通过对比LED开和关两种状态下荧光信号的强度，得出荧光信号的真正强度而没有环 境光的干扰，提1? 了检测精度。
[0030] 使用，本发明实施例进一步提供了一种检测大肠杆菌的检测方法，该检测方法进 行检测的流程图，如图1所示，包括如下步骤： 步骤SOl :增菌培养和标本处理：提供检测大肠杆菌的样品； 步骤S02 :实时荧光检测：进行实时检测需要使用上述的大肠杆菌的检测试剂盒和手 持式荧光仪。
[0031] 具体地，步骤SOl在无菌条件下操作。
[0032] 1)取一大试管，并在其中滴入0. 5毫升上述月桂胰蛋白培养液，并滴入1滴酶诱导 剂； 2) 从试剂盒中取一棉签，使用棉签末端擦拭测试区域的表面来收集样品，将蘸有样品 的棉签末端置于上述大试管内，密封，轻轻晃动，使棉签收集的样品与液体混合，形成待测 液； 3) 将待测液置于38. 5°C的恒温箱中培养3?5小时(不超过12小时，以5小时为佳)， 以保证产生足够的检测大肠杆菌所需要的酶。
[0033] 然后再进行如下样品的裂解处理： 4) 从试剂盒内取一空的小试管(搅拌)，并往内滴入3滴细胞裂解缓冲液； 5) 用(可置换）微量移液枪或一次性移液枪头从大试管取200微升待测液滴入小试管， 密封，轻轻晃动或在小试管内反复抽吸8次来达到充分搅拌效果，在环境温度下等待5?10 分钟； 6) 往小试管滴入2滴酶底物溶液，轻轻晃动； 7) 用微量移液枪或一次性移液枪头从小试管取200微升待测液滴入荧光检测用样品 试管，密封，在环境温度下等待3?5分钟。
[0034] 步骤S02 :实时荧光检测。
[0035] 8)取步骤SOl中获得的荧光检测用样品试管置于荧光仪的样品测试室，盖好盖， 在进行此步骤之前，应用无绒布或镜片擦纸擦拭干净荧光检测用样品试管的外壁，并确保 管内无气泡； 打开荧光仪的测试模式，记录第一次测试数值P1 ; 等待20分钟，再次测试，记录第二次测试数值P2 ; 若测试值P2- P1 > 80,则样品为阳性；否则为阴性； 若测试值P2- P1接近80,则等待20分钟，再次测试，获得新的P2 ; 所述P2的数值在20?60分钟内有效。
[0036] 在第一次测试与第二次测试之间的等待时间段内，可以将荧光检测用样品试管取 出置于环境中或培养箱内。
[0037] 上述步骤SOl中，采集样本，该样本中可能含有大肠杆菌，也可能不含有大肠杆 菌，要本发明实施例的检测方法进行检测确定。若明确知道棉签蘸有样品的样本中含有大 肠杆菌，则可将棉签直接置于滴入〇. 5毫升无菌水和1滴酶诱导剂的大试管内，无需进行培 养即可进行样品的裂解处理。
[0038] 具体地，一种大肠杆菌的检测方法，所述方法包括步骤： 1) 取一大试管，并在其中滴入〇. 5毫升无菌水，并滴入1滴酶诱导剂； 2) 取一棉签，用棉签末端取样，并置于上述大试管内，混合形成待测液； 3) 取一小试管，在其内滴入3滴细胞裂解缓冲液； 4) 用微量移液枪或一次性移液枪头从上述大试管取200微升待测液滴入小试管，充分 混合，密封，并在环境温度下等待5?10分钟； 5) 在上述小试管内滴入2滴酶底物溶液，充分混合； 6) 用微量移液枪或一次性移液枪头从上述小试管取200微升待测液滴入荧光检测用 样品试管，密封，在环境温度下等待3?5分钟； 7) 将荧光检测用样品试管置于荧光仪的样品测试室内，并密封； 打开荧光仪的测试模式，记录第一次测试数值P1 ; 等待20分钟，再次测试，记录第二次测试数值P2 ; 若测试值P2- P1 > 60,则样品为阳性；否则为阴性； 若测试值P2- P1接近60,则等待20分钟，再次测试，获得新的P2 ; 所述P2的数值在20?60分钟内有效。
[0039] 在第一次测试与第二次测试之间的等待时间段内，所述荧光检测用样品试管可以 取出置于环境中或培养箱内。
[0040] 由上述手持式荧光仪检测大肠杆菌的检测方法可知，若进行确认性检测，即不需 要进行培养检测，该检测大肠杆菌的所需时间在1小时内可以完成；即使需要进行培养检 测（38. 5°C的恒温箱中培养五小时)，使整个检测大肠杆菌的所需时间延长至6小时左右， 但该检测方法仍很简单。
[0041] 上述手持式荧光仪检测大肠杆菌的检测方法与传统的培养法检测大肠杆菌的方 法的准确度比对：

【权利要求】
1. 一种大肠杆菌的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括月桂胰蛋白培养液、酶 底物溶液、酶诱导剂和细胞裂解缓冲液，所述月桂胰蛋白培养液的成分包括：胰蛋白、乳糖、 氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、十二烷基硫酸钠，所述酶诱导剂为异丙基3-D-I-硫代 半乳糖苷（IPTG)，所述酶底物溶液为4-甲基伞形酮-B-D-葡糖苷酸，所述细胞裂解缓冲液 为鸡蛋白溶菌酶（HEWL)。
2. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述月桂胰蛋白培养液的各成分 浓度分别为： 胰蛋白：20.0g/L 乳糖：5. Og/L 氯化钠：5. Og/L 磷酸氢二钾：2. 75g/L 磷酸二氢钾：2. 55g/L 十-烧基硫酸纳：〇. lg/L。
3. 根据权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述月桂胰蛋白培养液的PH 值为6. 6?7.0。
4. 根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括无菌水。
5. 根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：所述月桂胰蛋白培养液、酶底物溶 液、酶诱导剂、细胞裂解缓冲液、无菌水的体积含量如下： 月桂胰蛋白培养液 1毫升/管 酶底物溶液 1毫升/管 酶诱导剂 1毫升/管 细胞裂解缓冲液 1毫升/管 无菌水 1毫升/管。
6. -种大肠杆菌的检测方法，所述方法包括步骤： 步骤一、取一大试管，并在其中滴入0. 5毫升无菌水，并滴入1滴酶诱导剂； 步骤二、取一棉签，用棉签末端取样，并置于上述大试管内，混合形成待测液； 步骤三、取一小试管，在其内滴入3滴细胞裂解缓冲液； 步骤四、用微量移液枪或一次性移液枪头从上述大试管取200微升待测液滴入小试 管，充分混合，密封，并在环境温度下等待5?10分钟； 步骤五、在上述小试管内滴入2滴酶底物溶液，充分混合； 步骤六、用微量移液枪或一次性移液枪头从上述小试管取200微升待测液滴入荧光检 测用样品试管，密封，在环境温度下等待3?5分钟； 步骤七、将荧光检测用样品试管置于荧光仪的样品测试室内，并密封； 打开荧光仪的测试模式，记录第一次测试数值P1 ; 等待20分钟，再次测试，记录第二次测试数值P2 ; 若测试值P2- P1 > 60,则样品为阳性； 若测试值P2- P1 < 60,则样品为阴性； 若测试值P2- P1接近60,则再等待20?60分钟，再次测试，获得新的P2。
7. 根据权利要求6所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于：所述酶诱导剂为异丙基 3 -D-I-硫代半乳糖苷（IPTG)，所述细胞裂解缓冲液为鸡蛋白溶菌酶（HEWL)，所述酶底物 溶液为4-甲基伞形酮-B-D-葡糖苷酸。
8. -种大肠杆菌的检测方法，所述方法包括步骤： 步骤一、取一大试管，并在其中滴入0. 5毫升权利要求2所述的月桂胰蛋白培养液，并 滴入1滴酶诱导剂； 步骤二、取一棉签，用棉签末端取样，并置于上述大试管内，混合形成待测液； 步骤三、将上述待测液置于38. 5°C的恒温箱中培养3?5小时； 步骤四、取一小试管，在其内滴入3滴细胞裂解缓冲液； 步骤五、用微量移液枪或一次性移液枪头从上述大试管取200微升待测液滴入小试 管，充分混合，密封，并在环境温度下等待5?10分钟； 步骤六、在上述小试管内滴入2滴酶底物溶液，充分混合； 步骤七、用微量移液枪或一次性移液枪头从上述小试管取200微升待测液滴入荧光检 测用样品试管，密封，在环境温度下等待3?5分钟； 步骤八、将荧光检测用样品试管置于荧光仪的样品测试室内，并密封； 打开荧光仪的测试模式，记录第一次测试数值P1 ; 等待20分钟，再次测试，记录第二次测试数值P2 ; 若测试值P2- P1 > 80,则样品为阳性； 若测试值P2- P1 < 80,则样品为阴性； 若测试值P2- P1接近80,则再等待20?60分钟，再次测试，获得新的P2。
9. 根据权利要求8所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于：所述月桂胰蛋白培养液 的PH值为6. 6?7. 0。
10. 根据权利要求8所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于：所述酶诱导剂为异丙基 3 -D-I-硫代半乳糖苷（IPTG)，所述细胞裂解缓冲液为鸡蛋白溶菌酶（HEWL)，所述酶底物 溶液为4-甲基伞形酮-B-D-葡糖苷酸。
【文档编号】C12R1/19GK104313114SQ201410586920
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月28日 优先权日:2014年10月28日
【发明者】吴学斌, 冯岳忠, 吴学华 申请人:吴学斌