一种油菜及其近缘植物干种子基因组dna提取方法
【专利摘要】本发明涉及一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法，该方法包括以下步骤：⑴油菜及其近缘植物干种子加石英砂研成粉末后加提取液，研磨成匀浆；⑵匀浆装入离心管，并水浴保温以充分裂解；⑶离心管冰浴冷却后加氯仿-异戊醇，混匀至不分层，离心得到上清液A；⑷上清液A中加NaCl，摇匀后加预冷无水乙醇，冰浴静置，然后离心得到沉淀物A；⑸沉淀物A中加NaCl，待沉淀物溶解后再加氯仿-异戊醇，轻轻混匀至不分层，然后离心，得到上清液B；⑹上清液B中加NaCl和预冷无水乙醇，冰浴静置，然后离心得到沉淀物B；⑺沉淀物B中加乙醇，洗涤沉淀后自然风干，加入TE缓冲液进行充分溶解，即得DNA提取液。本发明操作简便、实用，易于实施。
【专利说明】-种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物分子生物学研究的【技术领域】，尤其涉及一种油菜及其近缘植物干 种子基因组DNA提取方法。
【背景技术】
[0002] 甘肃河西地区气候属高原寒冷半湿润气候，昼夜温差大，日照充足，有利于油菜脂 肪的形成和积累，油菜籽出油率达42%以上。民乐、山丹两县是河西油菜主产区，也是甘肃 最大的油菜连片种植示范基地，种植面积最大时达44万多亩，是发展优质油菜的理想地 带。该地区油菜在增加当地人民收入方面起到了积极作用。
[0003] 目前，存在的主要问题是：①随着油菜品种数量日益增加，遗传基础相对狭窄，使 得完全根据形态性状进行油菜品种的鉴别越来越困难，给种子生产、经营、管理和维权等环 节带来不同程度的困难，导致油菜品种多、乱、杂的现象日益突出，对产量和品质造成了严 重的影响。②至今，用于油菜品种纯度鉴定，遗传多样性分析的技术主要是SSR和RAH)标记 技术，而应用这两大技术的关键环节是基因组DNA的有效提取。多数研究者以幼嫩的组织 如新鲜叶片提取基因组DNA，但在实际操作中，为得到幼嫩组织，必须在实验室条件下播种 或者田间取材，播种油菜或田间取材耗费大量的人力物力和时间。③三大类型油菜籽、芸芥 籽、白芥籽中均贮藏较多的蛋白质和淀粉，采用一般的方法，如CTAB法、SDS法，提取的DNA 往往内含杂质（蛋白质、多糖)，影响后续的种子纯度鉴定或遗传多样分析等工作。同时，油 菜籽中还含有小分子次生物质，如黄酮、香豆素、鞣质等，其中含有酚羟基的化合物，氧化后 要与DNA结合，引起DNA降解。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种简便实用的油菜及其近缘植物干种子基 因组DNA提取方法。
[0005] 为解决上述问题，本发明所述的一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方 法，包括以下步骤： ⑴将油菜及其近缘植物干种子〇. 5 ~lg置于研钵中，用研棒压破，加几颗石英砂后用力 粗研成粉末，然后再加入50(T700 PL提取液，迅速用力研磨成匀浆；所述提取液是按下述 方法制得： ① 将1.2114 g Tris加蒸馈水溶解，并定容至100 mL，即得0.1mol/L三轻甲基氨基甲 烷溶液； ② 吸取浓度为1(T14 mol/L分析纯盐酸0.85 mL，加水至IOOmL,混匀后用0.1 mol/L 标准氢氧化钠溶液滴定，即得〇. lmol/L盐酸； ③ 将50 mL所述0· lmol/L三羟甲基氨基甲烷溶液与29. 2mL所述0· lmol/L盐酸混匀 后，加水稀释至100 mL，即得pH =8. 0的0· 05mol/L Tris-HCl缓冲液； ④ 将14. 61g EDTA和4g氢氧化钠加水溶解，并定容至100 mL，即得0. 5 mol/L乙二胺 四乙酸溶液； ⑤分别将l(T20g十六烷基三乙基溴化铵、f 3g二硫苏糖醇、f 2g PEG8000用水溶解， 然后将该三种溶液混合，得到混合液； ⑦在所述混合液中依次加入9(Tl00 mL所述0.05mol/L Tris-HCl缓冲液、4(T50mL所 述0. 5 mol/L乙二胺四乙酸溶液，并加水定容至500mL即得； ⑵所述勻楽装入2 mL的离心管中，并置于65 °C水浴中保温15~20 min,每间隔5 min 轻轻摇动离心管1次，以充分裂解； ⑶将所述步骤⑵所得的离心管采用冰浴冷却后，加入50(Γ700 PL氯仿-异戊醇，混匀 至不分层，以1000(Tl2000 r/min的速率离心5 min，得到上清液A ; ⑷在300?400 μ?所述上清液A中加入150?200 PL、3mol/L的NaCl，摇匀后加入 70(Γ800 PL预冷无水乙醇，冰浴静置5?10 min，然后在温度为4°C的条件下以1000(Γ12000 r/min的速率离心5~8 min，得到沉淀物A ; (5) 在所述沉淀物A中加入30(Γ40〇μ?、I mol/L的NaCl，待所述沉淀物溶解后再加入 30(Γ400 PL氯仿-异戊醇，轻轻混匀至不分层，然后在温度为4°C的条件下以1000(Γ12000 r/min的速率离心5 min,得到上清液B ; (6) 在30(Γ40〇μ?所述上清液B中依次加入3(Γ4〇μ?、1 mol/L的NaCl和800?900 μ?预 冷无水乙醇，冰浴静置5?10 min，然后在温度为4°C的条件下以1000(Tl2000 r/min的速率 离心5 min，得到沉淀物B ; ⑴所述沉淀物B中加入体积浓度为7(Γ75%的乙醇30(Γ400 μ?，洗涤沉淀2?3次后自 然风干该沉淀物Β，然后加入5(Γ100 μ L、ρΗ=8的TE缓冲液进行充分溶解，即得DNA提取 液。
[0006] 所述步骤⑴中油菜及其近缘植物干种子是指甘蓝型油菜种子、白菜型油菜种子、 芥菜型油菜种子、青海白芥种子以及和田芸芥种子中的任意一种。
[0007] 所述步骤⑶和所述步骤(5)中的氯仿-异戊醇是指将氯仿与异戊醇按24mL :1 mL的 体积比混合而成的混合物。
[0008] 本发明与现有技术相比具有以下优点： 1、本发明直接以油菜及其近缘植物干种子为材料进行DNA提取，相比现有常用方法中 以叶片为材料的提取方法，不仅能获得高质量的DNA，而且简单快速，省去了育苗过程，在降 低实验成本的同时大大降低了工作效率。
[0009] 2、本发明所采用的提取液中EDTA的浓度为50 mmol/L，能保护DNA不被内源核酸 酶降解，保证得到完整性较好的DNA。
[0010] 3、本发明种子和CTAB提取液之间的质量体积比为0. 5?1 :70(Γ800 (g/μυ，不仅降 低了多糖对提取DNA的干扰作用，而且CTAB与核酸复合物沉淀容易产生，得到的DNA不宜 降解。
[0011] 4、本发明采用2~3XCTAB提取液，且在用乙醇沉淀DNA时采用高盐法，使多糖保留 在溶液中，有效除去种子中的多糖，使2.0 < A260/A230 < 2. 5,从而获得无多糖污染的DNA 样品。
[0012] 5、本发明在提取液中加入广3%的二硫苏糖醇和广2%的PEG，不但起到防止酚类氧 化的作用，还可防止酚类与DNA的结合，完全保护DNA的完整性。
[0013] 6、本发明通过氯仿-异戊醇混合液对先后得到的上清液进行两次抽提，然后用预 冷乙醇对上清液中的DNA进行两次沉淀，能有效除去种子中贮藏的蛋白质，获得无蛋白质 污染的DNA样品。
[0014] 7、本发明在适量提取液中研样，不需液氮中冷冻研样，也能防止DNA的降解，解决 了河西走廊油菜主产地区制造液氮及提供液氮的场地较少的问题。
[0015] 8、本发明材料易得，操作简便、实用，易于实施，在保证DNA提取量的前提下能够 快速提取纯度较高、完整性较好的基因组DNA，满足油菜种质资源遗传多样性分析和种子纯 度检测的需要，利于后续PCR扩增实验。
[0016] 9、对本发明所获得的基因组DNA进行测试。
[0017] ⑴所获得的基因组DNA采用Nanaphotometer核酸蛋白分析仪测定各种DNA提取 样品的 A260/A280, A260/A230, A320 值和浓度。
[0018] DNA纯度检测：若所测DNA样品的A260/A280 ^ 1. 8，说明所提取的DNA样品纯度 较高，无蛋白质污染。较纯净的核酸其A260/A230的比值大于2.0。若比值小于2.0,表明 样品被糖类污染。A320为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子，该值应该接近0. 0。
[0019] 将总DNA在1?2%琼脂糖凝胶（1?I. 5%Gold View I型核酸染色剂冲电泳，I X TAE 为电泳缓冲液，按5V/cm电泳3(T40 min。电泳结束后，在凝胶成相系统上观察，记录，并照 相。
[0020] (2) PCR 扩增反应： 使用美国伯乐公司生产的MycyclerTM thermal cycler扩增仪，对三大类型油菜 及其近缘植物的基因组DNA进行PCR扩增。反应体系为25μ?，包括18. 5PL ddH20,2PL IOXbuffer (主要含 Mg2+)，2 μ? dNTPs，WL 引物，0·5μ? TaqDNA 聚合酶，WL 模板；反应 条件为94°C预变性4min，然后进行94°C50s，37°C退火Imin 20s，72°C延伸2min，35个循 环后，在72°C延伸lOmin。
[0021] ⑶实验结果参见表1和图广6,通过表1可以看出，油菜及其近缘植物干种子基因 组DNA提取方法和传统CTAB方法比较，从3种类型油菜和2种油菜近缘植物干种子中所提 取的基因组DNA的A260/A230, A320，A260/A280值都较理想。
[0022] 表1油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法和传统CTAB方法的提取效果 比较
【权利要求】
1. 一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法，包括以下步骤： ⑴将油菜及其近缘植物干种子〇. 5 ~lg置于研钵中，用研棒压破，加几颗石英砂后用力 粗研成粉末，然后再加入50(T700 ML提取液，迅速用力研磨成匀浆；所述提取液是按下述 方法制得： @将1.2114 8!'1^8加蒸馈水溶解，并定容至10〇1111，即得0.11]1〇1凡三轻甲基氨基甲 烷溶液； ② 吸取浓度为1(T14 mol/L分析纯盐酸0? 85 mL，加水至100mL，混匀后用0? 1 mol/L 标准氢氧化钠溶液滴定，即得〇. lmol/L盐酸； ③ 将50 mL所述0? lmol/L三羟甲基氨基甲烷溶液与29. 2mL所述0? lmol/L盐酸混匀 后，加水稀释至100 mL，即得pH =8. 0的0? 05mol/L Tris-HCl缓冲液； ④ 将14. 61g EDTA和4g氢氧化钠加水溶解，并定容至100 mL，即得0. 5 mol/L乙二胺 四乙酸溶液； ⑤ 分别将l(T20g十六烷基三乙基溴化铵、f 3g二硫苏糖醇、f 2g PEG8000用水溶解， 然后将该三种溶液混合，得到混合液； ⑦在所述混合液中依次加入9(Tl00 mL所述0.05mol/L Tris-HCl缓冲液、4(T50mL所 述0. 5 mol/L乙二胺四乙酸溶液，并加水定容至500mL即得； ⑵所述勻楽装入2 mL的离心管中，并置于65 °C水浴中保温15~20 min,每间隔5 min 轻轻摇动离心管1次，以充分裂解； ⑶将所述步骤⑵所得的离心管采用冰浴冷却后，加入50(T700 ML氯仿-异戊醇，混匀 至不分层，以1000(Tl2000 r/min的速率离心5 min，得到上清液A ; ⑷在300?400 ML所述上清液A中加入150?200 ML、3mol/L的NaCl，摇匀后加入 70(T800 ML预冷无水乙醇，冰浴静置5?10 min，然后在温度为4°C的条件下以1000(Tl2000 r/min的速率离心5~8 min，得到沉淀物A ; (5) 在所述沉淀物A中加入30(T400ML、1 mol/L的NaCl，待所述沉淀物溶解后再加入 30(T400 ML氯仿-异戊醇，轻轻混匀至不分层，然后在温度为4°C的条件下以1000(T12000 r/min的速率离心5 min,得到上清液B ; (6) 在30(T400ML所述上清液B中依次加入30?40ML、1 mol/L的NaCl和800?900 ML预 冷无水乙醇，冰浴静置5?10 min，然后在温度为4°C的条件下以1000(Tl2000 r/min的速率 离心5 min，得到沉淀物B ; (7) 所述沉淀物B中加入体积浓度为70?75%的乙醇30(T400 ML，洗涤沉淀2?3次后自 然风干该沉淀物B，然后加入5(Tl00 y L、pH=8的TE缓冲液进行充分溶解，即得DNA提取 液。
2. 如权利要求1所述的一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法，其特征在 于：所述步骤⑴中油菜及其近缘植物干种子是指甘蓝型油菜种子、白菜型油菜种子、芥菜型 油菜种子、青海白芥种子以及和田芸芥种子中的任意一种。
3. 如权利要求1所述的一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法，其特征在 于：所述步骤⑶和所述步骤(5)中的氯仿-异戊醇是指将氯仿与异戊醇按24mL :1 mL的体积 比混合而成的混合物。
【文档编号】C12N15/10GK104371995SQ201410586586
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年10月28日 优先权日:2014年10月28日
【发明者】范惠玲 申请人:范惠玲